Geum.ru

Программа фундаментальных исследований Президиума ран

Вид материалаПрограмма

Содержание


Разработка биосенсорных голографических датчиков на основе гидрогелей для количественного определения компонентов в биологически
Разработка новых подходов для оценки эффективности терапии депрессий на основе пикосекундной флуоресцентной спектроскопии белков
Подобный материал:
1   ...   23   24   25   26   27   28   29   30   ...   72

2.2. Биофотоника




^ РАЗРАБОТКА БИОСЕНСОРНЫХ ГОЛОГРАФИЧЕСКИХ ДАТЧИКОВ НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЕЙ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.




А.В.Крайский 1), В.А.Постников, 2) Т.Т.Султанов 1), В.Е.Тихонов 3)

1) Физический институт им. П.Н.Лебедева РАН, Москва
2) ФГУ «НИИ физико-химической медицины», Росздрава, Москва
3) Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН, Москва



Принцип действия сенсоров основан на том, что толщина голографического слоя тол­стослойных денисюковских голограмм, записанных в специально созданных фотоэмульсиях на основе гидрогелевых матриц с группами, селективно чувствительными к наличию интере­сующих компонентов, изменяется в зависимости от концентрации этих компонентов [1]. Это регистрируется по изменению спектрального состава отраженной волны белого света. Дос­тоинством таких сенсоров является, в частности, то, что при однородном по толщине изме­нении расстояния между серебряными слоями спектр отражения узок и при достаточной чувствительности к концентрации, изменение спектра очень точно определяется современ­ными малогабаритными спектрографами невысокого разрешения и даже визуально.

На первом этапе мы ставили задачу разработки сенсоров, чувствительных к рН среды и физиологическим концентрациям глюкозы. Используемая нами [2] матрица представляла собой трехмерную полимерную сетку сополимера акриламида с акриловой кислотой (АК), N-ак­рилоиламидофенилборной кислотой (АФБК), сшитые N,N’-метилен-бис-акриламидом, содержащую включенный поливиниловый спирт.

Запись проводилась по обычной схеме записи голограмм на встречных пучках с пло­ским зеркалом в качестве объекта.

К настоящему времени нами получены следующие результаты:

Разработана технология создания голографических сенсорных слоев на подложках из стекла и полимерной пленки. Вид спектров отражения свидетельствует о достаточно од­нородной по толщине голограмме; изменения были обратимы.

Сенсоры на основе АК чувствительны к кислотности среды. В диапазоне изменения pH от 6 до 1 зафиксировано смещение максимума отражения от 623 нм до 593 нм.

Для сенсора на основе АФБК в пределах физиологических концентраций глюкозы, полу­чено уверенное приборное различение по спектру (607-643 нм) для концентраций 1, 5, 10, 50 ммоль/л в ацетатном буфере (0,05M, 0,15 M NaCl) рН 7,4.

При использовании буферных растворов на основе многоосновных кислот, положение максимума спектра отражения изменялось от 590 до 860 нм, что показывает возможности для создания визуального сенсора физиологических концентраций глюкозы.

Зафиксирована кинетика поведения спектра отражения, зависящая от типа буфера и его кислотности. Вид спектра показывает неоднородность деформации матрицы по толщине при определенных условиях и падение дифракционной эффективности вплоть до полного исчезновения в некоторых случаях при сдвиге ИК область.

В этих случае целесообразно смещать рабочую длину волны сенсора в синюю область. Следует также разработать метод определения однородности расстояния между слоями се­ребра по толщине и оптимизировать оптических свойства сенсора.

Marshall A.J. et al.,2006, Analyte-responsive holograms for (bio)chemical analysis, J.Phys.Condens.Matter.,18, S619-626; и патент США №5989923 от 23.11.1999),

V.A. Postnikov, A.V. Kraiskii, T.T. Sultanov, V.E. Tikhonov, Hydrogel holographic sensors to an acid media, In Abstracts XV111 International school-seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20.09-28.09.2007, Beregove, Crimea, Ukraine, p. 261

^ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ДЕПРЕССИЙ НА ОСНОВЕ ПИКОСЕКУНДНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ БЕЛКОВ.

2. МОДЕЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ И НАЧАЛО КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ




А.А.Комар1), Т.И.Сырейщикова1), Ю.А.Грызунов2,, Н.В.Смолина2), Г.Е.Добрецов2), Э.Ю.Мисионжник3), Н.М.Максимова3), Узбеков М.Г. 3)

1) ФИАН им. П.Н.Лебедева РФ 2) ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава
3) ФГУ МНИИ психиатрии Росздрава


Одним из наиболее социально значимых заболеваний в мире является депрессия. Ранее нами было показано, что при некоторых видах депрессии наблюдаются конформационные изменения главного внеклеточного транспортного белка человека – альбумина. Это позволило выдвинуть гипотезу, что изучение этих изменений а) позволит использовать свойства альбуминовых центров в качестве индикатора тяжести состояния больных при депрессии и б) поможет углубить знания о патогенезе депрессий. Разработанный ранее метод измерения стационарной флуоресценции специальных молекулярных зондов размером около 2 нм позволил выявлять нарушения конформации связывающих центров альбумина в индивидуальных пробах крови пациентов. Вместе с тем регистрация стационарной флуоресценции не дает детальной картины изменений альбумина, и для более полной характеристики этих структурных изменений требуется применение специальной техники пикосекундных измерений затухания флуоресценции. Поэтому на первом этапе выполнения Проекта в ФИАН им. П.Н.Лебедева была создана и протестирована лазерная установка для проведения флуоресцентных измерений в этом временном диапазоне.

Для изучения конформационных изменений альбумина при депрессии был выбран оригинальный флуоресцентный зонд – производное диметиламинонафталевой кислоты (К35), – а) который позволяет изучать альбумин без его выделения из сыворотки и б) флуоресценция которого чувствительна к состоянию главных связывающих центров этого белка. На данном, втором, этапе Проекта для понимания механизмов возникновения флуоресценции зонда из альбумина методом ab initio были проведены квантово-механические расчеты его конформации и рассчитаны энергии взаимодействия со средами, моделирующими свойства альбуминовых центров. По результатам экспериментов на изолированном белке была построена модель взаимодействия зонда с альбумином. Модель описывает связывание зонда в нескольких участках глобулы, их предполагаемую локализацию, стерическую доступность растворителю, вклады электростатических и гидрофобных взаимодействий в формирование комплекса зонд-альбумин. Сделана попытка объяснения неэкспонециальности затухания красителя в альбумине. Показано, что альбумин больных депрессией характеризуется изменением взаимодействия зонда как с гидрофобным карманом, так и с поверхностными центрами.

В соответствии с разработанным на данном этапе протоколом и с использованием созданной лазерной установки было начато клинические исследование альбумина больных депрессией – депрессивный эпизод (F.32.1) и рекуррентное депрессивное расстройство (F33.1) – в сравнении с группой здоровых добровольцев. Параллельно с биофизическими проводили комплекс биохимических, нейрохимических и гормональных исследований. Полученные результаты достоверно указывают на изменения структуры связывающих центров альбумина при депрессиях. Для более детальной характеристики изменений альбумина в различных подгруппах пациентов, в том числе в динамике психофармакотерапии, требуется накопление большого объема клинических данных. Это предполагается сделать в ходе дальнейшего развития Проекта.