Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Научный руководитель Официальные оппоненты Ведущая организация Общая характеристика работы Материал и методы исследования Оценка влияния АЛН Влияние ГАСАК и её комплекса с ДГК Оценка состояния костной ткани Прочность костной ткани Гистологическое исследование Биохимические методы исследования Статистический анализ Результаты и их обсуждение Возрастные особенности ремоделирования костной ткани у крыс Содержание С-концевых телопептидов коллагена Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) Содержание остеокальцина Содержание паратиреодного гормона (ПТГ) Минеральные элементы костной ткани. Прочность костной ткани. ... Полное содержание

Подобный материал:

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
• Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
• Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
• L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.

На правах рукописи


МУРАЛЁВА

НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА


ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ

ОСТЕОПОРОЗА У КРЫС ЛИНИИ OXYS И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ЛЕЧЕНИЯ БИСФОСФОНАТАМИ


14.03.03 – патологическая физиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Новосибирск – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) и Федеральном государственном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации


Научный руководитель:


доктор биологических наук Колосова Наталья Гориславовна


Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Садовой Михаил Анатольевич


Официальные оппоненты:


доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович


доктор медицинских наук Ким Лена Борисовна


Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск)


Защита диссертации состоится « 26 » апреля 2011 г. в 12-00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Научном Центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел./факс 8-(383)-333-64-56


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН


Автореферат разослан «___» марта 2011 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Остеопороз — системное метаболическое заболевание скелета, приводящее к снижению костной массы, нарушению микроархитектоники костной ткани и повышению риска переломов. На фоне постарения населения развитых стран и увеличения доли пожилых людей заболеваемость растет, а неполноценное питание, гиподинамия и неблагоприятная экологическая обстановка способствуют омоложению остеопороза. В основе его патогенеза лежит нарушение ремоделирования костной ткани, обеспечивающее механическую прочность костной ткани постепенным замещением старой кости новой. Для прогноза развития остеопороза принципиальны две детерминанты: пик костной массы и скорость последующего её снижения. Формирование адекватного пика костной массы рассматривается ВОЗ как наиболее эффективный путь профилактики остеопороза (WHO Geneva, 1999).

Оценка эффективности лечения остеопороза, основанного на длительном приёме препаратов, затруднена различиями в генетически детерминированных особенностях его развития, качестве жизни и приверженности пациентов к терапии. Структурно-функциональные изменения костной ткани при старении аналогичны тем, что происходят на ранних стадиях остеопороза, лежат в основе его патогенеза, но не всегда приводят к развитию заболевания. Запускающие патологический процесс механизмы остаются не ясными в связи с невозможностью исследовать ранние бессимптомные стадии. Создание биологических моделей заболеваний – один из подходов к выяснению их патогенеза и к разработке новых способов лечения (Duque G., Troen B.R., 2008).

На момент планирования настоящей работы существовали аргументы в пользу того, что моделью остеопороза может служить линия преждевременно стареющих крыс OXYS, у которых признаки заболевания присутствуют в молодом возрасте и классифицировались как проявления сенильного остеопороза. Основанием такой трактовки послужили более низкая, чем у крыс Вистар, минеральная плотность костной ткани, её структурные особенности (Фаламеева О.В. и др., 2006) и высокая активность катепсина К (Венедиктова А.А. и др., 2009). На развитие остеопороза указывали и нарушения минерализации, однако содержание Са в кости (Колосова Н.Г. и др., 2002) и крови (Venediktova А.А. и др., 2009) крыс OXYS в период активного роста оказались повышенными. Вопрос о возрасте манифестации остеопороза у крыс OXYS, знание которого важно для понимания его патогенеза, оставался открытым. По одним данным снижение минеральной плотности костной ткани развивается к возрасту 6 мес. (Фаламеева О.В. и др., 2006), по другим – она снижена уже в 2 мес. на фоне изменений межклеточного матрикса кости (Ершов К.И. и др., 2009).

Необходимый критерий адекватности модели тому или иному заболеванию – возможность влиять на его течение методами стандартной терапии (Reinwald S., Burr D., 2008). С этих позиций крысы OXYS ранее не исследовались. В лечении и профилактике остеопороза широко используют препараты антирезорбтивного действия, прежде всего бисфосфонаты, арсенал которых пополняется. Их применяют как монопрепараты и в комплексе с анаболиками. Наиболее изученный среди них – алендронат натрия (АЛН). Пример новых разработок – синтезированная в РХТУ им. Менделеева (Офицеров Е.Н. и др., 2010) глюкозаминовая соль алендроновой кислоты (ГАСАК). Глюкозамин способствует восстановлению эластичности связок и укрепляет межпозвоночные диски (Dahmer S., Schiller R.M., 2008), но крайне неустойчив. По замыслу авторов, устойчивый комплекс глюкозамина с алендроновой кислотой сможет повышать минеральную плотность костной ткани и позитивно влиять на связочно-хрящевой аппарат. Дополнение этого соединения дигидрокверцетином (ДГК) – флавоноидом растительного происхождения, предположительно, может повысить эффективность лечения благодаря его антиоксидантным свойствам (Vladimirov Y.A. et al., 2009) и доказанной в опытах in vitro способности активизировать синтез коллагена I типа – важного компонента костной ткани (Тараховский Ю.С. и др., 2007).

Максимально полная характеристика линии крыс OXYS как модели остеопороза имеет как фундаментальное, так и прикладное значение: выяснение патогенеза заболевания, анализ генетически детерминированных особенностей его развития у крыс OXYS и доказательство возможности объективной оценки эффективности терапевтических воздействий – актуальные задачи современной медико-биологической науки.

Цель работы: изучить патогенетические особенности развития остеопороза у крыс OXYS и возможность его коррекции алендронатом натрия как препаратом стандартной терапии и новым соединением из группы бисфосфонатов – глюкозаминовой солью алендроновой кислоты – монопрепаратом и в комплексе с дигидрокверцетином.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности возрастных изменений метаболизма костной ткани крыс OXYS по содержанию маркеров костного ремоделирования в сыворотке крови и моче, содержанию Са, Р и Sr в костной ткани и её морфологии.

2. Изучить влияние алендроната натрия на минеральную плотность костной ткани, маркеры костного обмена и прочностные характеристики кости самцов и самок крыс OXYS.

3. Исследовать влияние глюкозаминовой соли алендроновой кислоты (ГАСАК), а также её комплекса с дигидрокверцетином (ДГК) на состояние костной ткани и маркеры костного метаболизма у крыс OXYS.

4. Сравнить эффективность алендроната натрия и монопрепарата глюкозаминовой соли алендроновой кислоты, а также её комплекса с дигидрокверцетином в коррекции остеопороза у крыс OXYS.

Научная новизна

Впервые было показано, что для ранних стадий развития остеопороза у крыс OXYS характерно повышение содержания маркеров костной резорбции: С-концевого телопептида коллагена I типа в сыворотке крови начиная с возраста трех месяцев, пиридинолинов в моче начиная с полугодовалого возраста и снижение содержания остеокальцина – маркера костеобразования – в сыворотке крови в возрасте 12 мес.

Особенностями остеопороза у крыс OXYS являются: активное участие в костной резорбции остеоцитов, а не остеокластов, как в классическом варианте и формирование низких пиковых значений костной массы с пониженным накоплением Са, Р и Sr в костной ткани в период формирования пиковых значений костной массы.

Впервые было показано, что применение алендроната натрия у крыс OXYS приводит к снижению содержания пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче и повышает минеральную плотность костной ткани и площадь поперечного сечения кости, увеличивая прочность костной ткани.

Линия крыс OXYS была использована для исследования механизмов патогенеза раннего остеопороза и оценки эффективности терапевтических воздействий, что доказало адекватность крыс этой линии как модели данного заболевания.

Глюкозаминовая соль алендроновой кислоты в комплексе с дигидрокверцетином повышает минеральную плотность и прочность бедренной кости эффективнее, чем при приёме алендроната натрия и монопрепарата глюкозаминовой соли алендроновой кислоты.

Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс OXYS критериям модели раннего остеопороза, возможности её использования для исследования патогенеза этого заболевания, в том числе на ранних доклинических стадиях его развития. Показано, что крысы OXYS могут быть использованы для оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на лечение и профилактику снижения МПКТ и хрупкости костей, связанных с остеопорозом.

Выявленные в работе эффекты глюкозаминовой соли алендроновой кислоты и её комплекса с дигидрокверцетином на течение остеопороза у крыс OXYS и состояние костной ткани крыс Вистар позволяют рекомендовать комплексное соединение к дальнейшему исследованию с целью создания лекарственного средства для лечения остеопороза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие раннего остеопороза у крыс OXYS связано с нарушением процессов костного ремоделирования, которое приводит к формированию сниженной пиковой массы и минеральной плотности костной ткани на фоне снижения аккумуляции Са, P и Sr в костях, усиленной экскреции Са и деградации коллагена I типа, снижения маркеров остеосинтеза - остеокальцина и щелочной фосфатазы.
   
2. Усиление процесса резорбции матрикса костной ткани у крыс OXYS осуществляется не за счет повышенной активности остеокластов, как при сенильном остеопорозе, а активное участие в нём принимают остеоциты. При этом очаги резорбции локализуются преимущественно периканаликулярно – вокруг сосудов эндоста и периоста.
   
3. Алендронат натрия – стандартный для лечения остеопороза препарат – снижает выраженность проявлений этого заболевания у крыс OXYS. Комплексный препарат глюкозаминовой соли алендроновой кислоты эффективнее, чем алендронат натрия или монопрепарат глюкозаминовой соли алендроновой кислоты повышает минеральную плотность и прочность костной ткани у крыс OXYS, а у крыс Вистар способствует повышению пиковых значений костной массы в молодом возрасте.
   

Апробация результатов

Полученные результаты были представлены и обсуждены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Четвертой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2008, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.

Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы из 263 источников (15 отечественных и 248 – иностранных). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 4 таблицы.


МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Эксперименты выполнены на 334 самцах и 32 самках крыс OXYS и Вистар (возраст от 10 дней до 24 мес.) на базе Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» ИЦиГ СО РАН. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище группами по 5 особей в клетках размером 57×36×20 см при температуре 22±2⁰С.

Оценка влияния АЛН на состояние костной ткани выполнена на 32 самках и 32 самцах крыс OXYS и Вистар в возрасте 8 мес. Крысы опытных групп получали по 1,26 мг на кг массы тела АЛН 6 раз в неделю в течение 60 дней. В каждой группе n=8. Через 14 дней после окончания курса лечения исследовали МПКТ, прочность бедренной кости и маркеры костного ремоделирования в сыворотке крови и моче.

Влияние ГАСАК и её комплекса с ДГК на состояние костной ткани исследовали на 120 самцах крыс OXYS и Вистар. С возраста 8 мес. в течение 60 дней 6 раз в неделю животные получали на кг массы тела: 1,26 мг ГАСАК или 1,26 мг ГАСАК и 5,06 мг ДГК; часть животных получала 1,26 мг препарата сравнения - АЛН. Контролем служили интактные крысы обеих линий. В каждой группе n=15.Эффективность оценивали, как описано выше.

Оценка состояния костной ткани

Минеральную плотность костной ткани (МПКТ) измеряли в возрасте от 3 до 17 мес. под легким эфирным наркозом методом дихроматической рентгеновской абсорбциометрии (DEХА) на рентгеновском костном денситометре «HOLOGIC Discovery-A» (USA), используя специальную программу для мелких животных. Оценивали МПКТ всего скелета и его частей: позвоночника, бедренной и плечевой костей. Данные представлены в г/см². В возрасте 10 дней МПКТ оценивали на дентальной рентгеновской установке «SIRONA» (Gemany), используя программу AnviDent 5.01.

Содержание Са, P и Sr в костной ткани определяли методом рентгено-флуоресцентного анализа на синхротронном излучении (РФА СИ) на станции элементного анализа Центра SR VEPP-3 в ИЯФ СО РАН (Гончар А.М. и др., 2003). Образцы бедренной кости после очистки от мягких тканей и обработки протеиназами высушивали, растирали в агатовой ступке, таблетировали аликвоты и исследовали их эмиссионные спектры, которые анализировали с помощью программы АХIL, используя сертифицированный образец фосфорита BCR (Объединённое бюро стандартов ЕЭС, Брюссель) как стандарт. Результаты содержания Са и P представлены в процентном соотношении от общего содержания минеральных веществ.

Прочность костной ткани – стандартизованных образцов бедренной кости длиной 8 мм – испытывали на установке ZWICK TC-FR100TL.A4K (Германия). Приложенную силу измеряли нагрузочным модулем TC-LC100kN.G02 (диапазон измерения от 0 до 100 H, точность – 0,1 H). Нагрузку по продольной оси осуществляли со скоростью деформации 0,1 мм/мин. Площадь поперечного сечения бедренной кости рассчитывали, используя программу Scion Image 4.0.2 Scion, США. Удельную силу вычисляли по формуле: F=Fmax/S, где Fmax – величина предельной нагрузки, приложенной по продольной оси (H), S – площадь поперечного сечения бедренной кости (мм²). Модуль Юнга высчитывали по формуле: Е=F L/S X, где F – сила в ньютонах, L – длина деформируемого образца (8мм); Х – укорочение образца; S – площадь поперечного сечения кости, на которую действует сила.

Гистологическое исследование тел позвонков поясничного отдела выполнено методами световой микроскопии (микроскоп Axioskop 40, Carl Zeiss, Германия). Морфометрическую обработку данных проводили с использованием программы AxioVision 6.2. Образцы фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и в 4%-ном растворе параформа на растворе Хенкса. Декальцинацию костной ткани проводили в забуференном растворе 14 % ЭДТА, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. Серийные срезы (3-5 мкм) получали на санном микротоме и окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Реакцию на содержание суммарных кислых гликозаминогликанов (ГАГ) ставили с альциановым синим по методу С. Стидмена и коллаген – по Малори.

Биохимические методы исследования. В сыворотке крови определяли: активность щелочной фосфатазы (ЩФ) кинетическим методом с остановкой реакции (DGKC) на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир-400» (Tokyo Boeki Medical System, Япония), используя набор реактивов «Вектор-Бест» (Россия); остеокальцин с помощью набора реактивов «Rat Gla-OC Competitive EIA Kit Manual» (Takara Bio Inc., Japan); паратиреодный гормон (ПТГ) в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов «PTH (Intact, Rat) ELISA» (ALPCO Immunoassays, USA) согласно протоколу; С-концевые телопептиды α-цепи коллагена I типа, используя набор реактивов «RatLaps^TM EIA» (Immunodiagnostic Systems, UK) на аппарате иммуно-ферментного анализа TEKAN (GmbH Austria). Пиридинолин и дезоксипиридинолин в моче определяли набором реактивов «Pyridinium-Crosslinks» (Immunodiagnostik, Germany) согласно протоколу. Кальций в сыворотке крови и в моче определяли на автоматическом анализаторе «Biolis 24 i» (Tokyo Boeki Medical System. Japan) используя набор реактивов «Вектор-Бест» (Россия).

Статистический анализ результатов проводили, используя программы Statisticа-6.0 для Windows, применяя однофакторный и дисперсионный ANOVA анализ с последующими post hoc сравнениями групповых средних (Newman Keul test). Как независимые рассматривали факторы «генотип», «возраст» и «препарат». Связи между параметрами выявляли корреляционным анализом с использованием критерия Спирмена. Данные представлены как M±S.D. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение состояния костной ткани и маркеров её метаболизма у крыс OXYS и Вистар с возрастом

Минеральная плотность костной ткани (МПКТ) у крыс менялась с возрастом (F_1,58=124,6; p<0,000) и зависела от генотипа (F_3,58=47; p<0,000), что было обусловлено межлинейными различиями её возрастных изменений. Факторы «генотип» и «возраст» взаимодействовали (F_3,58=125; p<0,000). В возрасте 10 дней МПКТ крыс OXYS не отличалась от Вистар, а в период активного роста динамика её формирования различалась (рис. 1): у крыс обеих линий увеличивалась, но у крыс OXYS медленнее, чем у крыс Вистар и в возрасте 6 мес. она была у крыс OXYS ниже, чем у крыс Вистар. Пиковые значения МПКТ у крыс OXYS формировались к возрасту 6 мес., тогда как у крыс Вистар продолжали накапливаться до годовалого возраста (рис.1 а). У полугодовалых крыс OXYS, судя по данным денситометрии, уже сформированная пиковая костная масса была на 10% ниже той, которую достигали крысы Вистар к возрасту 12 мес. У годовалых животных межлинейные различия в МПКТ составили 11% (р<0,003) и сохранялись в дальнейшем. Таким образом, результаты настоящего исследования согласуются с полученными ранее данными в отношении возраста, в котором формируется пиковая масса костной ткани у крыс Вистар и OXYS.

Направленность возрастных изменений МПКТ была общей для всех исследованных отделов скелета. Исключением стала МПКТ плечевой кости, которая уже в возрасте 3 мес. у крыс OXYS была на 20% ниже, чем у крыс Вистар (р<0,000). Межлинейные различия с возрастом сохранялись (рис. 1 б).

Таким образом, к возрасту 6 мес. у крыс OXYS было выявлено снижение МПКТ относительно контрольных крыс Вистар по всем отделам скелета более чем на 10%, что служит диагностическим признаком остеопороза.

Рис. 1. Минеральная плотность костной ткани крыс Вистар и OXYS разного возраста: а) всего скелета; б) плечевой кости (M±S.D.). Различия значимы: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).


Возрастные особенности ремоделирования костной ткани у крыс

OXYS и Вистар

Определение содержания метаболитов коллагена в моче и сыворотке крови включено в диагностику остеопороза у людей для определения активности костной резорбции. Содержание пиридинолина (ПН), маркёра костной резорбции, зависело от возраста (F_4,64=51,0; p<0,000) и генотипа (F_1,64=28,1; p<0,000) животных, при этом факторы взаимодействовали (F_4,120=2,1; p<0,030), что обусловлено межлинейными различиями его содержания в моче с возрастом. Максимальное содержание ПН у крыс обеих линий выявлен в возрасте 3 мес., когда его содержание у крыс OXYS было несколько выше, чем у Вистар. Направленность возрастных изменений этого показателя сходна у крыс Вистар и OXYS, но их темпы отличались (рис. 2 а). К возрасту 6 мес. содержание ПН в моче крыс Вистар снижалось, что привело к нарастанию межлинейных различий, которые сохранялись до возраста 17 мес., что свидетельствует о повышенной интенсивности костного ремоделирования в этот период. К возрасту 24 мес. межлинейные различия нивелировались (рис. 2 а).

Содержание в моче дезоксипиридинолина (ДПН), маркера резорбции, менялось с возрастом (F_4,64=28,6; p<0,000) и на него влиял генотип (F_1,64=48,1; p<0,000). Динамика возрастных изменений ДПН у крыс обеих линий была аналогичной динамике изменений содержания ПН в моче (рис. 2): в возрасте 3 мес. выявлено максимальное содержание ДПН у крыс обеих линий и несколько более высокие значения – у крыс OXYS. С возраста 6 мес. ДПН был снижен в моче крыс OXYS относительно Вистар. Межлинейные различия сохранялись до возраста 17 мес., а к возрасту 24 мес. исчезали (рис. 2 б). В соответствии с литературными данными, у животных всех исследованных групп содержание ДПН было в 4 раза ниже содержания ПН.


Рис. 2. Изменения содержания метаболитов коллагена в моче крыс Вистар и OXYS с возрастом: а) пиридинолина; б) дезоксипиридинолина (M±S.D.). Различия значимы: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).


Содержание С-концевых телопептидов коллагена I типа – специфичных продуктов деградации – было выше у крыс OXYS (F_1,40=12,0; p<0,001) и изменялось с возрастом (F_3,64=90,9; p<0,000). Максимальные значения показателя зарегистрированы у 10-дневных крыс OXYS и Вистар (рис. 3). К возрасту 3 мес. содержание С-концевых телопептидов в сыворотке крови резко снижалось и в возрасте 3 мес. и 12 мес. у крыс OXYS было достоверно выше, чем у крыс Вистар (p<0,023 и p<0,035, соответственно), что свидетельствует о повышенной активности резорбции кости.