Автореферат диссертации на соискание ученой степени
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
- Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
- Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
- L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.
Рис. 3. Содержание С-концевого телопептида в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS разного возраста (M±S.D.). Различия значимы: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).
Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (относительного маркера костеобразования) с возрастом снижалась (F4,120=33; p<0,000) и во всех исследованных возрастных группах за исключением 10-дневных животных была ниже, чем у крыс Вистар соответствующего возраста (рис. 4 а). В возрасте 10 дней активность ЩФ была у крыс OXYS выше, а в 3 мес. становилась, напротив, в 1,7 раза ниже, чем у крыс Вистар. В возрасте 6 мес., когда у крыс OXYS завершается формирование пиковых значений МПКТ, активность ЩФ в сыворотке крови была у них вдвое ниже, чем у крыс Вистар, в возрасте 12 мес. – в 2,4, в 17 мес. – в 2, а в возрасте 24 мес. – в 1,8 раза.
 |  |
Рис. 4. Изменение с возрастом активности щелочной фосфатазы (а) и содержания остеокальцина (б) в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS (M±S.D.). Различия достоверны: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).
Содержание остеокальцина, маркёра костеобразования, в сыворотке крови, изменялось с возрастом (F2,48=50,0; p<0,000). Его минимальные значения выявлены у 10-дневных животных (рис. 4 б) и с возрастом увеличивались. Только в возрасте 12 мес. межлинейные различия в содержании остеокальцина в сыворотке крови были значимыми (p<0,015), что свидетельствует о снижении активности формирования костной ткани у крыс OXYS за счет уменьшения количества и/или активности остеобластов.
Содержание Са в сыворотке крови и моче с возрастом у крыс OXYS и Вистар изменялось (рис. 5). В возрасте 10 дней содержание Са в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS не различалось, а в возрасте 3 и 6 мес. у крыс OXYS было ниже, чем у Вистар (рис. 5 а).
К возрасту 12 мес. содержание Са в сыворотке крыс OXYS увеличивалось до уровня крыс Вистар, в этом возрасте, и в 17 мес. межлинейные различия по этому показателю отсутствовали (рис. 5 а). Но у годовалых крыс OXYS на фоне нормализации содержания Са в сыворотке крови нарастало его выведение с мочой и было выше, чем у крыс Вистар как в 12 мес. (р<0,02), так и в 17 мес. (р<0,027) и, как показано на рис. 5 б, не различалось у 24-месячных животных (р<0,09). Усиленная экскреция Са, можно полагать, явилась одной из причин пониженного по сравнению с крысами Вистар содержания этого элемента в сыворотке крови крыс OXYS в возрасте 24 мес.
 |  |
Рис. 5. Возрастные изменения содержания Са а) в сыворотке крови и б) моче крыс Вистар и OXYS (M±S.D.). Различия значимы: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).
Содержание паратиреодного гормона (ПТГ) в сыворотке крови значительно изменялось с возрастом (F5,40=28,2; p<0,000). В возрасте 10 дней межлинейные различий в содержании ПТГ отсутствовали (рис. 6). В возрасте 3 мес. содержание ПТГ у крыс Вистар и OXYS несколько выше у крыс OXYS (p<0,06). У крыс Вистар содержание ПТГ в сыворотке крови постепенно снижалось до возраста 17 мес., а у крыс OXYS практически не менялся до года, но к возрасту 17 мес. – достоверно выросло и стало выше, чем у крыс Вистар. Однако к возрасту 24 мес. и по этому показателю межлинейные различия нивелировались (рис. 6).
Рис. 6. Содержание ПТГ в сыворотке крови крыс Вистар и OXYS разного возраста (M±S.D.). Различия достоверны: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05).
Минеральные элементы костной ткани. Содержание Са в костной ткани у крыс OXYS и Вистар зависело от генотипа (F1,108=9,4; р<0,003) и изменялось с возрастом (F3,108=23,7; р<0,000). В возрасте 3 мес. межлинейные различия в содержании Са не выявлены (табл. 1). Активное накопление Са у крыс Вистар продолжалось до 12 мес., у OXYS – до 6 мес. Его содержание в костной ткани полугодовалых крыс OXYS было достоверно ниже, чем у крыс Вистар этого возраста на 8%. В возрасте 12 мес. различия сохранялись лишь на уровне тенденции, а к 24 мес. межлинейные различия отсутствовали (табл.1). Анализ результатов исследования возрастных изменений содержания Са в костной ткани крыс OXYS и Вистар показал, что они сопоставимы и соответствуют динамике формирования пика костной массы.
Динамика изменений содержания фосфора (Р) была сходна в костной ткани крыс обеих линий (табл.1) и зависела от возраста животных (F3,108=8,6; р<0,000), но на него не влиял генотип (F1,108=8,6; р<0,1). Максимальных значений содержание Р у крыс OXYS достигало к возрасту 6 мес., а у крыс Вистар накопление Р продолжалось до возраста 12 мес. После достижения пиковых значений содержание Р в костной ткани крыс OXYS и Вистар снижалось, и в возрасте 24 мес. достигало уровня 3-месячных животных.
Таблица 1. Возрастные изменения содержания Ca, P и Sr в бедренной кости крыс OXYS и Вистар
| Возраст (мес.) | Вистар | OXYS | ||||
| Са, % (n=15) | Р, % (n=15) | Sr, мкг/г (n=15) | Са, % (n=15) | Р, % (n=15) | Sr, мкг/г (n=15) | |
| 3 | 18,5±0,7 | 6,5±0,5 | 163±11 | 16,7±0,8 | 5,6±0,4 | 139±7 |
| 6 | 23,7±0,6* | 7,2±0,6* | 204±24 | 21,8±0,6* | 7,9±0,6* | 96±5* |
| 12 | 24,6±1,2 | 8,7±0,7* | 160±16* | 20,9±1,5 | 7,1±1,2 | 95±3 |
| 24 | 16,7±1,4* | 6,4±0,3* | 91±6* | 16,4±1,0* | 5,7±0,35* | 98±2 |
Примечание: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS, * - по сравнению с предыдущим возрастом животных одной линии (p<0,05), % - от общего содержания минеральных веществ (M±S.D.).
Содержание стронция (Sr) в костях с возрастом менялось (F5,108=9; р<0,000) и зависело от генотипа животных (F1,108=10,8; р<0,001). При этом факторы взаимодействовали (F5,108=6,4; р<0,000), поскольку с возрастом этот показатель у крыс Вистар и OXYS изменялся не одинаково (табл. 1). В возрасте 3 мес. содержание Sr в костной ткани крыс не различалось. В возрасте 6 и 12 мес. этот показатель был достоверно ниже у крыс OXYS, чем у Вистар. К возрасту 24 мес. содержание Sr в костях крыс Вистар становилось таким же, как у крыс OXYS.
Прочность костной ткани. Анализ полученных результатов показал, что абсолютная величина предельной нагрузки, приводящая к нарушению структуры бедренной кости – максимальная сила (Fмах) – зависит от генотипа, и у крыс Вистар она в 1,5 выше, чем у крыс OXYS (F1,16=19,3, p<0,001). Площадь поперечного сечения бедренной кости зависела от генотипа (F1,16=410,0; p<0,000): у крыс Вистар она была в 1,7 раза больше, чем у OXYS (табл. 2). В пересчете предельной нагрузки на площадь поперечного сечения прочность бедренной кости, на которую производилась нагрузка, крыс OXYS и Вистар не различались, так же как Модуль Юнга – величина, характеризующая упругость материала, в нашем случае – кости животных (табл. 2).
Таблица 2. Значения максимальной силы, площади поперечного сечения и модуля Юнга бедренной кости крыс Вистар и OXYS в возрасте 12 мес.
| Линия | Мах сила, Н | Удельная сила, Н/мм2 | Площадь сечения кости, мм2 | Модуль Юнга |
| Вистар | 1415±308 | 141±19 | 11,1±1,31 | 7,32±1,13 |
| OXYS | 892±148 | 132±20 | 6,73±0,29 | 7,16±1,15 |
Примечание: - между одновозрастными крысами Вистар и OXYS (p<0,05). M±S.D.
Гистологическое исследование тел позвонков показало, что в возрасте 6 мес. у крыс обеих линий резорбция матрикса костной ткани преимущественно затрагивает вертикальные трабекулы губчатого слоя (рис.7 А, Б). Отличительная особенность костной ткани крыс OXYS – отсутствие гаушиптовых лакун на поверхности костных балок. Интенсивность остеолиза костных трабекул у крыс OXYS в возрасте 6 мес. более выражена, чем у крыс Вистар. Однако присутствие в поле зрения единичных малоактивных остеокластов указывает на отсутствие доминирования остеокластического типа резорбции костной ткани крыс OXYS. Ведущим механизмом резорбции матрикса костной ткани у крыс OXYS является периканаликулярный с локализацией процесса вокруг сосудов эндоста и периоста.
В возрасте 21 месяца различия в структурной организации костной ткани тел позвонков крыс OXYS и Вистар ярко выражены. На обзорных препаратах у крыс OXYS выявляются истончение и лизис вертикальных трабекул губчатого слоя компактной костной ткани, а объем губчатой костной ткани и ширина трабекул у крыс OXYS меньше, чем у крыс Вистар на 74 и 39%, соответственно (р<0,05). Согласно данным гистохимического анализа, основными механизмами остеолиза и в этом возрасте у крыс OXYS остается гладкая резорбция, которая реализуется без участия остеокластов и обеспечивает аутолиз костных структур в области расположения кровеносных сосудов периоста (рис. 8 А). Гистохимическое исследование выявило у крыс OXYS отчетливое расширение лакун остеоцитов и локальные участки костного матрикса с демаскированным коллагеном, что является морфологическим проявлением остеоцитарного остеолиза. У крыс Вистар в возрасте 21 мес. выявлено усиление резорбции костной ткани за счет повышенной активности остеокластов (рис. 8 Б). На поверхности кортикальной кости среди клеток внутреннего слоя периоста идентифицируются функционально активные остеобласты и остеокласты, расположенные в гаушиптовых лакунах.
Рис. 7. Тела позвонков крыс OXYS (А) и Вистар (Б) в возрасте 6 мес. Темной стрелкой обозначены костные балки; двойной темной – дорсальная кортикальная пластинка; двойной белой – вентральная кортикальная пластинка. Гематоксилин и эозин. Ув. 40 х.
Рис. 8. Кортикальная пластинка тел позвонков крыс OXYS (А) и Вистар (Б) в возрасте 21 мес. (дорсальная поверхность). А – темная стрелка - резорбция костного матрикса на периферии кровеносного сосуда. Б – темная стрелка – гаушиптовы лакуны, светлая – остеокласт. Гематоксилин и эозин. Ув. 400 х.
Термином «остеопороз» на сегодня обозначают заболевания разной этиологии, общим для которых становится уменьшение массы костной ткани на единицу ее объёма, препятствующее осуществлению адекватной механической функции скелета. Этому критерию, без сомнения, соответствует остеопороз, развивающийся у крыс OXYS, однако результаты наших исследований не позволяют рассматривать его как сенильный. Развитие остеопороза у крыс OXYS, как и у людей, тесно связано с нарушениями процессов костного ремоделирования. Пиковые значения костной массы у крыс OXYS достигаются к возрасту 6 мес., и в этом же возрасте появляются значимые отличия от крыс Вистар в МПКТ. Формирование пиковых значений у крыс OXYS происходит на фоне снижения накопления в костной ткани минеральных компонентов – Ca, P и Sr, а также снижения содержания Са в сыворотке крови, что определяет его вымывание из костной ткани. По времени это совпадает с усилением дисбаланса в процессах костного ремоделирования: нарастанием экскреции продуктов распада коллагена с мочой (ПН и ДПН) и снижением, по сравнению с крысами Вистар, содержания остеокальцина в крови, что косвенно указывает на уменьшение количества активных остеобластов. Нарушение ремоделирования костной ткани, лежащего в основе остеопороза, у крыс OXYS не носит врожденного характера. В возрасте 10 дней по ряду ключевых маркеров костного метаболизма крысы OXYS не отличаются от крыс Вистар. Так, содержание остеокальцина и С-концевых телопептидов α-цепи коллагена I типа одинаковы. Однако уже в возрасте 3 мес., когда у крыс OXYS ещё отсутствует основной признак остеопороза – снижение МПКТ, процессы резорбции протекают интенсивнее, чем у крыс Вистар. Об этом свидетельствуют повышенное содержание в крови С-концевых телопептидов коллагена I типа, а также некоторое увеличение экскреции с мочой ПН – продуктов распада коллагена. С возрастом дисбаланс процессов ремоделирования у крыс OXYS продолжает нарастать, и структурные изменения костной ткани приобретают необратимый характер. Принципиально важно, что остеолиз матрикса костной ткани у них не осуществляется по механизму классической резорбции за счет повышенной активности остеокластов, а за счет остеоцитов.
Влияние стандартной антирезорбтивной терапии – алендроната натрия (АЛН) - на состояние костной ткани
Терапевтический эффект АЛН оценивали у самок и самцов крыс OXYS в возрасте 8 мес., когда клиническая картина остеопороза уже сформирована, и контрольных крыс Вистар. Положительными критериями служили повышение или стабилизация МПКТ и снижение концентрации маркеров резорбции кости в биологических образцах, определяемых лабораторными методами.
Изменение минеральной плотности костной ткани на фоне приёма АЛН. Эффект препарата на МПКТ проявился у крыс обеих линий (F4,72=3,3; p<0,017), он зависел от генотипа (F4,72=5,7; p<0,001) и пола животных. АЛН максимально повлиял на самок крыс OXYS (табл. 3): повысил МПКТ всего скелета на 5% (p<0,034) и на 18% (p<0,000) – бедра (табл. 3), а у самцов – повысил МПКТ бедра на 11% (p<0,015). Ни у самцов, ни у самок крыс Вистар значимого повышения МПКТ всего скелета не произошло, и АЛН повысил только МПКТ бедра у самцов крыс Вистар (на 10%, p<0,013).
Таблица 3. МПКТ всего скелета, бедренной кости и содержание Са в сыворотке крови и моче контрольных и получавших АЛН крыс OXYS и Вистар
| | Самцы | Самки | |||
| Показатель | Контроль | АЛН | Контроль | АЛН | |
| Вистар | МПКТ всего скелета, г/см2 | 0,180±0,003 | 0,181±0,002 | 0,170±0,002# | 0,174±0,003 |
| МПКТ бедренной кости, г/см2 | 0,181±0,004 | 0,202±0,006* | 0,229±0,007# | 0,211±0,013 | |
| Са сыворотки, ммоль/л | 2,62±0,03 | 2,59±0,02 | 2,51±0,03# | 2,57±0,03 | |
| Са мочи, ммоль/л | 3,8±0,98 | 9,8±1,68* | 5,7±1,05# | 19,9±3,24* | |
| OXYS | МПКТ всего скелета, г/см2 | 0,162±0,004 | 0,163±0,003 | 0,154±0,001# | 0,161±0,002* |
| МПКТ бедренной кости, г/см2 | 0,164±0,011 | 0,181±0,007* | 0,131±0,030 | 0,161±0,005* | |
| Са сыворотки, ммоль/л | 2,36±0,03 | 2,39±0,04 | 2,46±0,05 | 2,37±0,02 | |
| Са мочи, ммоль/л | 6,3±1,39 | 10,7±3,59 | 7,6±1,32 | 12,9±1,77* |
Примечание: # - между самцами и самками крыс одной линии (p<0,05), - между крысами Вистар и OXYS одного пола (p<0,05), * - значимый эффект препарата (p<0,05). M±S.D.
Влияние АЛН на содержание Са в сыворотке крови и моче крыс OXYS и Вистар. АЛН не повлиял на содержание Са в сыворотке крови (F1,72=0,02; p<0,9), однако факторы «генотип» и «препарат» взаимодействовали (F1,72=5,12; p<0,028), что было обусловлено более низким, чем у крыс Вистар, содержанием Са в крови крыс OXYS (F1,40=57,7; p<0,000). У самок крыс Вистар этот показатель был ниже, чем у самцов (p<0,042), в то время как у крыс OXYS от пола животных не зависел (табл. 3). Экскреция Са с мочой у самок крыс обеих линий была выше, чем у самцов (F1,40=7,4; p<0,009). АЛН существенно повлиял на этот показатель (F1,72=27,4; p<0,000). На фоне приёма препарата произошло повышение экскреции Са и у самцов (в 2,5 раза), и у самок (в 3,5 раза) крыс Вистар, в то время как у крыс OXYS она увеличилась только у самок (p<0,036) и не изменилась у самцов (p<0,23) (табл. 3).
Изменение прочностных характеристик бедренной кости, содержания пиридинолина и дезоксипиридинолина на фоне приёма АЛН. АЛН повысил Fмах бедренной кости крыс OXYS (р<0,04). На фоне приёма АЛН также произошло увеличение площади поперечного сечения бедренной кости у крыс Вистар на 12% и OXYS – на 9% за счет сужения костномозгового канала, что свидетельствует о замедлении резорбции костной ткани (табл. 4).
Содержание маркера костной резорбции – ПН в моче крыс зависело от генотипа (F2,32=13,2; p<0,001) и изменялось под влиянием препарата (F2,32=11,0; p<0,003). В контрольных группах содержание ПН в моче крыс Вистар был ниже, чем у крыс OXYS (p<0,032) (табл.4). АЛН повлиял на данный показатель у всех экспериментальных животных: у крыс OXYS понизил его (p<0,014), а у крыс Вистар выявил тенденцию к снижению (p<0,067).
Таблица 4. Влияние АЛН на прочность и площадь поперечного сечения бедренной кости, модуль Юнга и содержание пиридинолина в моче самцов крыс OXYS и Вистар
| Показатель | Вистар | OXYS | ||
| Контроль | АЛН | Контроль | АЛН | |
| Удельная прочность, Н/мм2 | 141,0±19,1 | 130,8±15,6 | 132,3±20,2 | 151,7±32,08 |
| Площадь сечения кости, мм2 | 11,1±1,3 | 12,5±1,2* | 6,7±0,3 | 7,4±0,5* |
| Модуль Юнга | 7,3±1,1 | 6,5±0,9 | 7,2±1,2 | 8,2±2,4 |
| Пиридинолин пмоль/мл | 317,9±11,5 | 292,3±6,9 | 356,4±11,3 | 320,9±3,4* |
Примечание: - между крысами Вистар и OXYS (p<0,05), * - значимый эффект препарата (p<0,05). M±S.D.
Таким образом, АЛН положительно повлиял на крыс OXYS с характерными признаками нарушения процессов ремоделирования костной ткани и с уже сформированной пиковой костной массой. Эффект АНЛ проявился у самок крыс OXYS с минимальной исходной МПКТ повышением этого показателя, а так же и у самцов повышением активности костной резорбции и повышением прочности костной ткани.
Реакция на воздействие стандартного для лечения остеопороза препарата свидетельствует о том, что крысы OXYS могут служить моделью этого заболевания и использоваться для оценки эффективности новых методов лечения.