«Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова»

Вид материала

Содержание

Материалы и методы
результаты исследования и их обсуждение
Иммуногематологическая характеристика населения п. Красный Бор
Структура иммунозависимой заболеваемости населения п. Красный Бор
Интегральная оценка состояния иммунной системы
Практические рекомендации

Подобный материал:

1 2 3 4

На правах рукописи

Голубков

Александр Викторович

Исследование изменений иммунного статуса у лиц, проживающих в условиях химического загрязнения

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

14.03.04 – токсикология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

САНКТ–ПЕТЕРБУРГ

2011

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия

им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук ПЕТЛЕНКО Сергей Викторович

доктор медицинских наук ИВАНОВ Максим Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор КАЛИНИНА Наталья Михайловна

доктор медицинских наук профессор ГОЛОВКО Александр Иванович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «ГНЦ Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «___» июня 2011 г. в _______ на заседании совета по защите докторских и кандидатских Д 215.002.08 в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан «___» мая 2011 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

МИТИН Юрий Алексеевич

Актуальность. В настоящее время одним из главных направлений в работе здравоохранения на государственном уровне является снижение вредного воздействия окружающей среды на организм человека, более всего проявляющегося в виде повышения уровня инфекционных и онкологических заболеваний (Андрианов Л.А. и соавт., 1971; Бандман А.Л. и соавт., 1990; Худолей В.В., Филатов В.А., 1993; Петленко С.В., 1999; Золотникова Г.П. и соавт., 2001; Прокопенко Ю.И. и соавт., 2001; Аликбаева Л.А и соавт., 2007; Коробицын Б.А., Сухорукова Э.В., 2008; Минигалиева И.А. и соавт., 2008; Соболева Ю.И., 2008). Это связано, в свою очередь, с нарушением структурной целостности и функциональной полноценности иммунитета на организменном уровне (Петленко С.В., 2007).

Дезинтеграция иммунной системы (ИС) чаще всего проявляется при воздействии на организм человека факторов химической этиологии (Беженарь В.Ф. и соавт., 2001; Куценко С.А., 2004; Бастрон А.С. и соавт., 2005; Азарин К.В., 2008; Бодиенкова Г.Н., 2008). Внедрение химических технологий во все отрасли хозяйства и сферу быта, активное использование химических пищевых добавок и консервантов создает условия обитания, с которыми человек прежде никогда не встречался. Как в России, так и за рубежом одной из нерешенных актуальных задач является исследование пролонгированного низкодозового воздействия химических соединений, сопровождающегося разнообразными проявлениями токсического процесса на системном, организменном (в виде аллобиотических состояний) и популяционном уровнях (Буковский М.И. и соавт., 1984; Василенко И.Я., 2001; Голденков В.А., 2002; Куценко С.А., 2004; Bendich A. et al., 1981; Brown D.R. et al., 1985). При этом в практическом здравоохранении все более остро ощущается нехватка методов адекватной объективной оценки иммунной системы при подобного рода воздействиях (Хаитов Р.М. и соавт., 1995; Беженарь В.Ф. и соавт., 2001; Куценко и соавт., 2001; Шубик В.М. и соавт., 2001; Дранник Г.Н., 2003; Беляева Н.Н., 2008).

Согласно данным литературы, иммунная система высокочувствительна к воздействию различных неблагоприятных экологических факторов, в том числе химической природы (Алексеева О.Г., Дуева Л.А., 1978; Беклемишев Н.Д., 1986; Смирнов В.С., 1992; Бонитенко Ю.Ю., Ващенко В.И. и соавт., 2001; Давыдова Е.В. и соавт., 2001; Никифоров А.М., 2004), а изменение ее состояния может выступать в качестве одного из объективных критериев воздействия (Орадовская И.В., 1991; Смирнов В.С. и соавт., 1992; Петленко С.В. и соавт., 2001; Пройнова В.А. и соавт., 2001).

В этой связи, очевидно, что выполнение иммуноэпидемиологических исследований должно включать использование методов, позволяющих наряду с закономерностями адаптивного реагирования иммунной системы в популяции оценить и индивидуальную (конституциональную) чувствительность системы иммунитета к комплексу неблагоприятных ксенобиотических воздействий (Петров Р.В., Орадовская И.В., 1987; Забродский П.Ф., 1998; Ентус В.А. и соавт., 2001; Киселев В.В., Коржов Л.Н., 2001; Петленко С.В. и соавт., 2004). Это является важным для оценки здоровья лиц, проживающих в условиях химического загрязнения окружающей среды (Петров Р.В. и соавт., 1992; Куценко С.А., 2001; Мамонтова Е.А. и соавт., 2008; Прусаков В.М. и соавт., 2008; Van Loveren et al., 1998). Кумуляция изменений отдельных компартментов иммунной защиты может привести к нарушениям структурной целостности и функциональной полноценности всей системы регуляции иммунного гомеостаза (Бубнова В.И. и соавт., 1980; Ершов Ю.А., Плетнева Т.В., 1989; Гребенюк А.Н., 2001; Епифанцев А.В. и соавт., 2001). Показано, что даже незначительные изменения иммунологической реактивности могут служить предпосылкой для развития целого ряда тяжелых соматических заболеваний, таких как сердечно-сосудистые и нервные болезни, хронические инфекции, аллергические, аутоиммунные и пролиферативные процессы (Задорожный Б.В., 1971; Дикун П.П., 1990; Забродский П.Ф., 1998; Епифанцев А.В. и соавт, 2001; Калинина Н.М., Давыдова Н.И., 2001; Измеров Н.Ф., Ткачева Т.А., 2008).

Вышеизложенное свидетельствует о том, что иммуноэпидемиологический мониторинг должен стать одним из приоритетных направлений в системе медицинского обеспечения лиц, длительное время проживающих в условиях химического загрязнения окружающей среды. Модельной ситуацией длительного воздействия на организм человека химических соединений может служить поселок Красный Бор, расположенный в пределах санитарно–защитной зоны предприятия по захоронению и уничтожению высокотоксичных промышленных отходов (Гольцова Н.И, и соавт., 1996, 2004; Гордиенко С.Г., Самофалов Д.П., 1998). В ряде исследований, выполненных в основном в конце ХХ века, показано негативное влияние загрязнения окружающей среды токсикантами на уровень и структуру заболеваемости населения (Калоянова-Симеонова Ф., Попов Т., 1989; Козлов В.А., 1998; Ингель Ф.И. и соавт., 2001; Мешков Н.А., 2001; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007;). При этом, изменения состояния иммунной системы лиц, проживающих в условиях напряженной экологической ситуации, обусловленной загрязнением среды обитания компонентами промышленных токсичных отходов, изучены недостаточно полно. Это обусловило актуальность настоящей работы, посвященной исследованию состояния системы иммунитета и ее связи с заболеваемостью у данной категории лиц в зависимости от времени проживания на химически загрязненной территории.

Целью исследования явилось изучение закономерностей реагирования иммунной системы человека при формировании токсического процесса в ответ на пролонгированное воздействие факторов химической природы (на примере населения поселка Красный Бор).

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи исследования:

1. Изучить экологическую обстановку в поселке Красный Бор.

2. Оценить гематологический статус, состояние клеточного, гуморального иммунитета и факторов неспецифической резистентности у жителей поселка Красный Бор в зависимости от времени проживания вблизи химически опасного объекта и от химических веществ, загрязняющих окружающую среду.

3. Провести анализ иммунологической патологии, иммунозависимой заболеваемости и характера реагирования иммунной системы в зависимости от времени проживания на

загрязненной территории.

4. Выявить наиболее информативные иммуноэпидемиологические критерии для оценки проявлений форм токсического процесса на организменном и популяционном уровнях в ответ на пролонгированное воздействие факторов химической природы.

Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные положения, выносимые на защиту:

1. Проживание в условиях загрязнения среды обитания токсикантами сопровождается формированием особой формы токсического процесса на уровне организма – аллобиоза, проявляющегося изменением иммунологической реактивности, выраженность которого зависит от времени проживания вблизи химически опасного объекта и характера химических веществ, загрязняющих окружающую среду.

2. Отражением формирования токсического процесса на уровне популяции в ответ на пролонгированне воздействие комплекса неблагоприятных факторов химической природы является повышение уровня и изменения структуры иммунозависимой патологии.

3. В системе иммуноэпидемиологического мониторинга населения, проживающего в условиях химического загрязнения окружающей среды, в качестве интегрального показателя оценки проявлений форм токсического процесса на организменном и популяционном уровнях целесообразно использовать индекс дезинтеграции иммунной системы.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые установлены основные закономерности реагирования иммунной системы у лиц, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды токсикантами. В результате комплексного изучения иммуногематологических показателей, включающих состояние клеточного, гуморального иммунитета и факторов неспецифической резистентности и их сравнения с уровнем и структурой иммунозависимой патологии разработаны новые подходы к совершенствованию системы иммуноэпидемиологического мониторинга населения, проживающего в условиях химического загрязнения. На основе полученных данных проведена оценка проявлений различных форм токсического процесса на системном (иммунотоксическое действие), организменном (изменение иммунной реактивности) и популяционном (изменение структуры иммунозависимой заболеваемости) уровнях.

Практическая значимость. Разработаны новые подходы к комплексной оценке структурно-функционального состояния иммунной системы у лиц, длительное время проживающих в условиях химического загрязнения окружающей среды. Показано, что одним из объективных критериев оценки коллективного риска у лиц, подвергающихся воздействию химического загрязнения окружающей среды, может служить индекс дезинтеграции иммунной системы, отражающий изменение структуры и направленности устойчивых корреляционных связей между отдельными элементами иммунной системы у лиц групп риска по сравнению с аналогичными параметрами практически здоровых людей. Показана возможность использования интегральной оценки состояний иммунной системы, уровня и структуры иммунозависимой патологии для выявления токсического процесса на популяционном уровне с целью решения медико-социальных задач в отношении лиц, проживающих в условиях комплексного загрязнения среды обитания приоритетными токсикантами.

Апробация работы. Основные материалы диссертационного исследования доложены на: 4-й международной научной конференции «Донозология-2008» (2008 г.); всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (2010 г.); заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийского общества токсикологов (2010 г.); межкафедральных совещаниях Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (2010-2011 гг.).

Реализация результатов исследования. Полученные в ходе диссертационного исследования материалы:

– внедрены в учебный процесс на профильных кафедрах Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования и Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова при рассмотрении вопросов иммуно- и экотоксикологии.

– использованы при выполнении научно-исследовательской работы Военно-

медицинской академии им. С.М. Кирова (НИР шифр «Имитатор», шифр «Компонент», «Мишень»), 1410 центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора МО РФ, ФГУ «985 центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Западного военного округа» МО РФ, кафедры медицины труда СПб МАПО.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 публикации в центральных медицинских изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 15 рисунков и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 280 библиографических источников, из них 216 отечественных и 64 зарубежных публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для оценки влияния неблагоприятных факторов химической природы на иммунную систему проведено углубленное лабораторное и санитарно-эпидемиологическое обследование 128 человек, проживающих в поселке городского типа (ПГТ) Красный Бор (таблица 1).

Таблица 1

Характеристика групп сравнения

Характеристика групп	Группы сравнения
Характеристика групп	I группа	II группа	III группа	В среднем по п. Красный Бор
Время проживания	До 5 лет	5-10 лет	Более 10 лет	3-12 лет
Численность групп	41	44	43	435
Мужчины/женщины (%)	46,3 / 53,7	45,4 / 54,6	44,1 / 55,9	48,6/51,4
Средний возраст	31,4±5,2	34,6±6,3	37,9±6,8	41,3±10,2
Средняя зарплата	13800±2200	14300±3100	12700±2800	14800±3400
Рабочие/служащие (%)	39,0 / 61,0	34,1 / 65,9	30,2 / 69,8	35,2/64,8

Группу контроля составили 318 лиц, не имеющих профессионального и экологического контакта с токсичными соединениями.

В качестве методологической основы работы использована трехэтапная схема иммуноэпидемиологического мониторинга (Петров Р.В. и соавт., 1987, 1992; Орадовская И.В., 1991; Смирнов В.С. и соавт., 1991, 1992, 1999; Петленко С.В. и соавт., 1995, 1999; Хаитов Р.М. и соавт.,1995; Филиппов В.Л. и соавт., 2004). Существенным моментом выбранной схемы являлось использование на этапе скрининга анкеты-опросника для выявления из всей массы обследованных лиц, составляющих группу риска развития иммунологической недостаточности (Орадовская И.В., 1991; Смирнов В.С. и соавт., 1991, 1992, 1999), модифицированной С.В.Петленко (2007).

Для оценки уровня и структуры анамнестической и накопленной заболеваемости изучена и проанализирована отчетная документация медицинских учреждений ПГТ Красный Бор за период с 1990 по 2009 гг. и амбулаторные карты лиц, длительное время проживающих в условиях напряженной экологической ситуации, обусловленной загрязнением среды обитания промышленными токсичными отходами. В последующем у данной категории лиц выполнены скрининговые и углубленные лабораторные исследования состояния иммунной системы, для выявления нарушений, индуцированных неблагоприятными воздействиями факторов химической природы.

Лабораторные исследования выполнены в подразделениях НИЛ военной терапии, клинической и токсикологической лабораторий кафедры военно-полевой терапии (ВПТ) Военно-медицинской академии, медицинских учреждений (клинико-диагностических центров (КДЦ) Министерства здравоохранения и лабораторного отделения «Иммунобиосервис».

Гематологические исследования выполнены с использованием автоматических гематологических анализаторов «BECMAN-COULTER AcT-diff» (ФРГ), «ABACUS» (Англия), «ARCUS» (Австрия) и включали количественное определение клеток, их морфологические характеристики, оценку среднепараметрических данных. Аппаратное клиническое исследование крови дополнялось мануальными методиками с определением СОЭ (по методу Вестергрена), цветового показателя и оценки (подсчета) относительного и абсолютного содержания ретикулоцитов.

Выделение лимфоцитов проводили из гепаринизированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности FICOLL-PAQUE p=1,077 (Pharmacia, Швеция) по микро-методике в модификации О.Д. Долгого (1988).

Количественные параметры состояния клеточного иммунитета оценивали по содержанию различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток (ИКК) путем иммунофенотипирования с моноклональными антителами при помощи микролимфоцитотоксического теста.

Идентификацию субпопуляций лимфоцитов проводили путем применения двух люминесцентных зондов (Janossy G. et al., 1986), имеющих максимум флуоресценции в разных зонах видимого спектра. В качестве витального красителя использован карбоксифлуоресцеин диацетат (CFDA) (Serva, ФРГ), тропный к мембранным структурам живых клеток и имеющий свечение в зеленой зоне спектра (длина волны 530-560 нм). Для выявления лизированных клеток, использовали интерколятор – пропидиум йодид (PI) (SIGMA, США). Этот зонд способен селективно окрашивать ДНК погибших клеток с максимумом свечения в пределах красной зоны (650-710 нм) видимого спектра. Для гашения спонтанной люминесценции PI, добавляемого в заведомо избыточном количестве, применяли фирменный гаситель (FALCON, США) или смесь индийских чернил с добавлением человеческого гемоглобина.

Процентное содержание различных субпопуляций лимфоцитов оценивалось по соотношению живых и погибших клеток. В качестве положительного и отрицательного контролей применяли антилимфоцитарный глобулин (FREZENIUS, ФРГ).

Регистрацию результатов производили с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ Р-8 (светофильтры с полосой пропускания 400-590 нм и 650-750 нм), в котором в качестве источника возбуждения люминесценции использована ртутная (200 Вт) лампа высокого давления. Учет результатов реакции проводили путем подсчета 100 клеток в одном поле зрения. Процентное содержание различных субпопуляций лимфоцитов получали расчетным способом по соотношению живых и лизированных клеток.

Оценка функциональной активности клеточных механизмов иммунного ответа включала определение пролиферативной способности (реакция бластной трансформации) и цитокинообразующей (миграционная активность) составляющей.

Из методов оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток (ИКК) реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) является наиболее простой и легко воспроизводимой, в связи с чем данный метод предложено использовать для скрининговой оценки состояния ИС людей, работающих и проживающих в условиях химической опасности.

РТМЛ проводили по стандартной методике в присутствии митогенов (конкавалин А, фитогемагглютинин Р). В ходе выполнения исследования также использована модифицированная методика РТМЛ, где в качестве индукторов выступают вещества, с которыми у обследованных контингентов возможен пролонгированный экологический контакт (Петленко С.В., 2007). В нашем исследовании для оценки индивидуальной чувствительности (сенсибилизации) иммунной системы использованы химические вещества из группы так называемых «маркерных» или «приоритетных» загрязнителей ГУПП «Полигон «Красный Бор» (таблица 2). При постановке методики концентрации химических веществ подбирались таким образом, чтобы исключить возможность прямого токсического (повреждающего) воздействия на клетки. Раститровкой ксенобиотиков (1:1000 – 1:12000) добивались нормального уровня реагирования (до величины индекса миграции (ИМ) 80-120%) у лиц контрольной группы, не имеющих контакта с токсичными веществами. Кроме этого, используемые для постановки РТМЛ вещества тестировали на отсутствие цитотоксичности по оценке жизнеспособности лимфоцитов в течение 36 часов.

Таблица 2

Приоритетные токсиканты, использованные для оценки реакции иммунной системы населения п. Красный Бор при проведения иммуноэпидемиологического мониторинга

Группа приоритетных токсикантов	Класс опасности	Вещества (или их группы), использованные при постановке РТМЛ
Полигалогенированные углеводороды	II-III	Перхлорэтилен+трихлорэтилен
Полицикличенские ароматические углеводороды	I-II	Бенз(а)пирен, дибензантрацен
Альдегиды	II	Формалин
Циклоалканы	II – III	Ортоксилол+циклогексан+толуол
Ароматические углеводороды	IV	Фенол
Тяжелые металлы и их соединения	II-III	Кобальт+цинк+никель (в виде сернокислых солей)
	I	Хром (CrO₃), Кадмий
	II	Ртуть, Свинец

Оценка гуморального звена иммунной системы включала исследования количественных и функциональных параметров. Для этого применяли комплекс методик, включавший определение содержания в крови зрелых форм В-лимфоцитов (CD20⁺) и концентрацию в сыворотке иммуноглобулинов классов M, G и A.

Количественное определение IgM, IgG, IgA проводили по методу радиальной иммунодиффузии (РИД) или при помощи иммуноферментного анализа (ИФА).

Учет результатов РИД проводили на аппарате «ИМАТЕСТ 01» производства НИИ аналитического приборостроения (Россия), предназначенного для автоматического учета колец преципитации в агарозном геле. Расчет концентрации иммуноглобулинов выполняли с использованием компьютерной программы «IMMUN» (Долгий О.Д. и соавт., 1988).

Методы оценки факторов неспецифичекой защиты включали определение относительного и абсолютного содержания моноцитов и различных классов гранулоцитов, естественных киллеров (NK) – клеток с фенотипом CD56, а так же показателей функциональной активности полиморфноядерных нейтрофильных гранулоцитов (ПМН).

Оценка функциональной активности кислородзависимого метаболизма системы полиморфноядерных нейтрофилов проводилась по способности клеток данной популяции к восстановлению тетра-нитросинего тетразоля в диформазан (цитохимический вариант НСТ-теста). НСТ-активность системы ПМН проводилась в присутствии физиологического раствора (базальная активность) и стандартного стимулятора (зимозан – опсонизированный пулированной человеческой сывороткой). Расчет резервной метаболической емкости проводили путем вычисления отношения стимулированной активности клеток к базальной. Кислороднезависимую микробицидность клеток оценивали по активности катионных белков (лизосомально-катионный тест – ЛКТ) в результате поглощения клетками специального красителя (Fast-green, Sigma, США).

Фагоцитарную активность ПМН и МФ у обследованных лиц оценивали по способности клеток к поглощению и перевариванию стандартной культуры Staphil. Aureus (штамм № 209). Заключение о состоянии фагоцитарной активности проводили по относительному содержанию фагоцитирующих клеток (фагоцитарный индекс - ФИ), среднему числу микроорганизмов поглощенных одним фагоцитом (фагоцитарное число - ФЧ) и величине дезинтеграции микроорганизмов (показатель завершенности фагоцитоза - (ПЗФ).

Хроматографическое исследование крови на наличие алкоголя и его дериватов, а также летучих органических соединений проводили стандартным методом газохроматографического анализа равновесной паровой фазы на газо-жидкостном хроматографе «Кристалл 2000» (Россия). Фенол в накопительных средах определяли флюорометрическим методом на приборе «Флюорат-02» фирмы «Люмэкс». Наличие бенз(а)пирена выявляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Тяжелые металлы определяли методом инверсионной вольтамперометрии на анализаторе вольтамперометрическом «АКВ-07МК». Бензол в средах определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе «Кристалл-2000М».

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием стандартного пакета статистических программ «STATISTICA 6.0». Массивы данных, имеющие параметрический характер распределения выборки, подвергали статистической обработке с расчетом средних показателей, средней стандартной ошибки и сигмальных отклонений. Достоверность показателей средних величин оценивали по показателю t-критерия Стьюдента. Математическую значимость различий между группами сравнения выявляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и критерия X². Критический уровень достижения нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 95% (p≤ 0,05) или 99% (p≤ 0,01).

Для анализа данных, имеющих непараметрический характер распределения в выборке, использовали корреляционной метод с определением дисперсии и расчетом коэффициентов корреляции по Спирмену и Кендаллу для 95% и 99% уровней значимости. При выявлении устойчивых корреляционных связей для определения характера математической зависимости между отдельными компартментами применяли регрессионный анализ.

Blog

«Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова»

Содержание