Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание 1. Общая характеристика работы Цель работы. Основные положения, выносимые на защиту. Научная новизна. Практическая значимость. Личное участие автора Апробация работы. Реализация работы. Структура и объем диссертации. 2. Материалы и методы Оценка популяционного состава лимфоцитов. Оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелию. Определение липидов в сыворотке крови Оценка интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови или эндотелиальными клетками линии EA.Hy926. Оценку концентрации растворимых форм мембранных рецепторов в сыворотке крови Оценка продукции цитокинов и растворимых форм мембранных рецепторов тканью плаценты. Иммуногистохимический анализ экспрессии факторов клетками плаценты. Статистический анализ Результаты исследования и их обсуждение Популяционный состав лимфоцитов периферической крови и функция адгезии мононуклеаров периферической крови беременных женщин. ... Полное содержание

Подобный материал:

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
• Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
• Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
• L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.

На правах рукописи


СОКОЛОВ

Дмитрий Игоревич


РОЛЬ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ

ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ

РАЗВИТИЯ ПЛАЦЕНТЫ В НОРМЕ И ПРИ ГЕСТОЗЕ


14.00.36 – аллергология и иммунология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Санкт-Петербург, 2009

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта Северо-Западного отделения РАМН


Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Айламазян Эдуард Карпович


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

доктор медицинских наук, профессор Малинин Владимир Викторович


Ведущая организация: Государственный Научный Центр «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»


Защита состоится « » _____________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан « » _____________ 2009 г.


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Успешное развитие беременности зависит от иммунологического контроля взаимоотношений матери и плода. Одной из наиболее тяжелых форм патологии беременности, связанной с нарушением регуляторных механизмов, является гестоз, проявляющийся полиорганной функциональной недостаточностью, развитием гипертензии, отеков и протеинурии после 20 недели беременности. Частота гестоза в различных странах колеблется от 2 до 14% к числу всех беременностей [Douglas K.A., 1994; Cавельева Г. М., 2000]. Гестоз остается одной из ведущих причин материнской смертности и составляет в ее структуре 25%. Наиболее часто гестоз развивается у женщин, страдающих соматическими заболеваниями, а также у первородящих и у беременных старше 30 лет. Преждевременные роды при гестозе наблюдаются в 25-41%, частота оперативного родоразрешения составляет 40% [Савельева Г.М., 1996; Серов В.Н., 1997]. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий, до сих пор не существует единых четких представлений об этиологии и патогенезе данного заболевания. К настоящему времени изучены механизмы иммунологического контроля инвазии трофобласта в стенку матки, механизмы создания иммунологической толерантности в системе мать – плод, факторы, действие которых может приводить к патологическому течению беременности. Вместе с тем, до сих пор не проанализированы иммунологические механизмы, связывающие особенности функционирования клеток иммунной системы, эндотелиальных клеток сосудистого русла беременной женщины, эндотелиальных и других клеток плаценты при ее физиологическом развитии и при патологическом течении беременности. Недостаточно изучен до сих пор характер изменений цитокиновой сети плаценты при ее физиологическом развитии и при гестозе. В литературе представлены разрозненные сведения о локализации ростовых факторов в плаценте на ранних и поздних этапах физиологически протекающей беременности. Изучение секреции тканью плаценты цитокинов и других факторов проводилось, как правило, без иммуногистохимического подтверждения наличия или отсутствия исследуемых факторов в плаценте. Комплексное сравнительное изучение иммунологических механизмов регуляции, роли гуморальных и клеточных факторов в контроле развития плаценты в норме и при патологии позволит конкретизировать отдельные звенья иммунопатогенеза гестоза.

Цель работы. Оценить роль иммунологических механизмов в регуляции формирования плаценты при физиологически протекающей беременности и при гестозе.

Задачи исследования.

1. Провести сравнительную оценку популяционного состава лимфоцитов периферической крови женщин с физиологически протекающей беременностью и при гестозе.
   
2. Сравнить функцию адгезии мононуклеаров периферической крови беременных женщин к эндотелиальным клеткам при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
   
3. Изучить интенсивность поглощения липидов сыворотки крови моноцитами периферической крови и эндотелиальными клетками при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
   
4. Сопоставить особенности продукции иммунологически значимых секреторных вариантов поверхностных молекул, ростовых факторов, хемокинов, цитокинов тканью плаценты на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
   
5. Охарактеризовать экспрессию и локализацию ангиогенных и антиангиогенных факторов в плаценте на различных этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
   
6. Оценить характер экспрессии и локализации апоптогенных и антиапоптогенных факторов, а также определить степень выраженности апоптоза в плаценте на ранних и поздних этапах ее развития при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
   

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Беременность, осложненная гестозом, характеризуется нарушением иммунологической регуляции развития плаценты, проявляющимся выраженными изменениями морфологии ткани плаценты и секреции биологически активных молекул клетками плаценты.
   
2. Сбалансированная продукция ангиогенных и антиангиогенных, антиапоптогенных и проапоптогенных факторов, а также цитокинов клетками плаценты определяет ее нормальное развитие и препятствует проявлению цитотоксических эффектов лимфоцитов матери. При этом антиангиогенные и проапоптогенные факторы на ранних этапах физиологически протекающей беременности ограничивают избыточную пролиферацию клеток плаценты, а в третьем триместре способствуют формированию структуры плаценты. Напротив, при гестозе в третьем триместре беременности происходит повышение продукции IL-6, IL-8, антиангиогенных и проапоптогенных факторов, сопровождающееся повышенной гибелью клеток трофобласта.
   
3. Физиологическое развитие плаценты сопровождается изменением локализации процессов апоптоза при сохранении их интенсивности, что позволяет плаценте выполнять свои функции и обеспечивать растущие потребности плода вплоть до родоразрешения.
   
4. В плаценте при гестозе запускаются компенсаторные механизмы защиты против избыточных антиангиогенных, апоптогенных стимулов и цитотоксических эффектов лимфоцитов матери, к которым относится повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGFβ и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL при одновременном снижении экспрессии Fas, FasL и повышенной экспрессии TRAIL.
   
5. Некоторые из обнаруженных нами изменений, в частности, увеличение продукции тканью плаценты при гестозе секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1 и sVE-cadherin, являются отражением нарушения функций клеток плаценты. Повышение концентрации sICAM-1 в сыворотке периферической крови беременных с гестозом свидетельствует об активации лейкоцитов периферической крови и нарушении функций эндотелиальных клеток кровеносного русла.
   

Научная новизна. Впервые проведено комплексное сопоставление иммунологических механизмов, контролирующих физиологическое развитие плаценты и особенностей иммунологической регуляции и иммунопатологических механизмов при гестозе.

Впервые выявлено усиление функции адгезии к эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926 у мононуклеаров периферической крови беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными.

Впервые показана более выраженная способность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 поглощать липиды из сывороток беременных с гестозом по сравнению с сыворотками здоровых беременных. Также впервые выявлена повышенная способность моноцитов периферической крови беременных с гестозом в сравнении с моноцитами периферической крови здоровых беременных поглощать липиды из аутологичной сыворотки крови.

Установлено, что продукция тканью плаценты секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1, sVE-cadherin, sICAM-1, sFas, sFasL не вносит существенного вклада в их накопление в периферической крови. В то же время, повышение в сыворотке крови беременных женщин уровня sICAM-1 можно расценивать как отражение системной эндотелиальной дисфункции и активации лейкоцитов при гестозе.

Впервые продемонстрировано, что снижение экспрессии проангиогенных и антиангиогенных факторов, секреции IL-6, IL-8, а также увеличение секреции IFNγ, IL-4, IL-10 в плаценте в динамике от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности не сопровождается изменением интенсивности апоптоза. В отличие от этого при гестозе снижение экспрессии ангиогенных факторов, увеличение секреции IL-6, IL-8 и экспрессии антиангиогенных и проапоптогенных факторов в плаценте сопровождается апоптотической гибелью преимущественно клеток трофобласта и эндотелиальных клеток плодовых сосудов.

Впервые обнаружено, что повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGFβ и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL, а также снижение экспрессии мембранных рецепторов Fas, FasL и повышение экспрессии рецептора TRAIL отражают реализацию компенсаторных механизмов защиты клеток плаценты при гестозе.

Практическая значимость. Среди общепринятых иммунологических тестов отобраны наиболее информативные, позволяющие уточнить раннюю диагностику гестоза, начиная с первого триместра беременности: определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови, оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелиальным клеткам, оценка поглощения липидов эндотелиальными клетками и моноцитами.

Разработана модификация метода для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 из сыворотки крови. Метод позволяет изучать механизмы, лежащие в основе нарушений липидного обмена, в том числе при гестозе, оценивать риск развития эндотелиальной дисфункции и тяжесть гестоза. Метод также может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Модифицированный метод оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови беременных из аутологичной сыворотки крови позволяет оценить функциональную активность моноцитов и их потенциальную способность образовывать пенистые клетки при гестозе. Метод может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови может использоваться в качестве прогностического критерия развития гестоза, а также для оценки выраженности эндотелиальной дисфункции при различных заболеваниях.

Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, обобщении и анализе полученных результатов, написании статей. Проведение морфологического и иммуногистохимического анализа осуществлялось при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, анализ содержания липидов в сыворотке крови осуществлялся при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII, VIII, IX, X конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), конференции «Объединенный иммунологический форум - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), 2-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008г.), конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007г.), первом региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007г), конференции II-го междисциплинарного конгресса «Ребенок, врач, лекарство», (Санкт-Петербург, 2007г.), I съезде патологоанатомов Республики Беларусь (Беларусь, г. Минск, 2006г), конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г.), девятой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007 г.), первом международном конгрессе по репродуктивной медицины (Москва, 2006 г.).

По теме диссертации опубликовано 29 работ, в том числе глава в учебнике для
ВУЗ`ов; журнальных статей 14, из них 12 статей в рекомендованных ВАК РФ журналах; 14 тезисов докладов.

Реализация работы. Диссертация выполнена на базе НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН. Результаты исследований внедрены в практическую и научную деятельность лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, научную деятельность отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН. Материалы диссертации использованы в учебнике для ВУЗ`ов «Руководство по нейроиммуноэндокринологии». Основные положения, материалы и выводы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный Университет».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 344 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Текст диссертации иллюстрирован 88 рисунками и 21 таблицей. Список литературы включает 671 источник, из них 75 отечественных и 596 зарубежных.


2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе работы обследовано 450 женщин во время и вне беременности. В первую группу вошли беременные с гестозом первой и второй степени тяжести без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования в III триместре беременности. Вторую группу составили беременные на сроке 32-39 недель с физиологическим течением беременности. В третью группу включены здоровые небеременные женщины без признаков воспалительных изменений и гиперлипидемии. Диагноз гестоза у женщин первой группы установлен в Отделении физиологии и патологии беременности НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности – наличия протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм. рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм. рт. ст. и выше). При оценке тяжести гестоза использовали классификацию акад. РАМН Г.М. Савельевой, принятую на форуме «Мать и Дитя» в 2005 году. Степень тяжести гестоза оценивали по бальной системе: до 7 баллов – легкая степень тяжести; 8-11 баллов – средняя; 12 и более – тяжелая. Отечественная классификация адекватно сочетается с Международной классификацией болезней Х пересмотра. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, паритету родов и акушерскому анамнезу. Периферическую кровь здоровых небеременных женщин получали в отделении переливания крови НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН. Объектом исследования также явились 80 плацент, полученных на разных сроках беременности. Обследованы плаценты, полученные при искусственном аборте у женщин с физиологическим течением беременности (9-11 недель); плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений (38-39 недель); плаценты женщин с течением беременности, осложненным гестозом (38-39 недель). Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. У обследованных женщин оценивали содержание и свойства мононуклеаров периферической крови и содержание иммунологически значимых молекул в сыворотке крови.

Оценка популяционного состава лимфоцитов. Использовали стандартный набор для определения популяций лимфоцитов периферической крови IMKPlus (BD, США), позволяющий определять количество: CD3+ лимфоцитов, CD19+ (B-лимфоцитов), CD3+\CD4+ лимфоцитов, CD3+CD8+ лимфоцитов, CD3+\CD4+\CD8+ лимфоцитов, CD3+\HLA-DR лимфоцитов, CD3–\CD16+\CD56+ натуральных киллеров, CD3+\CD16+\CD56+ NKT лимфоцитов. Гепаринизированную периферическую кровь обрабатывали антителами в соответствии с рекомендациями производителя (BD, США). Учет проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США).

Оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелию. В работе использовали эндотелиальные клетки линии EA.hy926, воспроизводящие характеристики эндотелия крупных сосудов [Edgell C.J., 1983]. Клетки линии EA.hy926 культивировали 24 часа (5% СО₂, 37°С) в плоскодонном 24-луночном планшете. Затем в часть лунок вносили 100 ЕД/мл рекомбинантного TNFα («Рефнолин», Латвия) и инкубировали 22 часа. Затем отмывали теплым раствором Хенкса. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин. В лунки c монослоем интактных или активированных TNFα клеток линии EA.Hy926 вносили 1×10⁶ мононуклеаров и культивировали 30 минут. Затем отмывали теплым раствором Хенкса от неадгезированных клеток. Адгезированные клетки вместе с монослоем эндотелиальных клеток переводили в суспензию раствором версена. Суспензию клеток обрабатывали моноклональными антителами в комбинациях: анти-VEGF-R1+анти-CD45; анти-CD3(FITC)+анти-CD16+56(PE); анти-CD3(PerCP)+анти-CD4(FITC)+анти-CD8(PE), анти-CD14(FITC) +анти-CD16(PE); контрольными изотип-антителами (BD, США). Анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США). При анализе в координатах прямого и бокового светорассеяния контролировали наличие эндотелиальных клеток, моноцитов и лимфоцитов в суспензии, полученной после их совместного культивирования. Лимфоциты и моноциты экспрессировали CD45, но обладали низкой экспрессией VEGF-R1. Эндотелиальные клетки экспрессировали VEGF-R1, но не экспрессировали CD45. Затем настройку проточного цитофлюориметра проводили так, чтобы выделить области, занимаемые лимфоцитами и мононуклеарными фагоцитами. Обладающие большими размерами эндотелиальные клетки находились вне пределов выделенных областей. Проводили гейтирование исследуемых клеток в координатах FSC и SSC, анализировали на наличие флюоресценции лимфоциты и моноциты. При анализе данных дополнительно определяли соотношения популяций мононуклеаров периферической крови среди мононуклеаров, адгезировавших к эндотелию. После отсечения зоны дебриса число клеток в популяциях мононуклеаров периферической крови пересчитывали на 100 эндотелиальных клеток.

Определение липидов в сыворотке крови проводили в соответствии с протоколом производителя стандартного набора фирмы Dia Sys (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе Alcyon 300 (Abbot , США). Определение концентрации триглицеридов, липопротеинов высокой плотности, ЛПНП, ЛПОНП, холестерина и оценку индекса атерогенности проводили при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Оценка интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови или эндотелиальными клетками линии EA.Hy926. Метод окраски липидов красителем OIL RED O [Luna, L.G., 1968] модифицировали для оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови в культуре. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин и культивировали 3 часа (5% СО₂, 37ºС) в среде RPMI1640, 10% ЭТС («ICN», США) в лунках стерильного предметного стекла с 4-луночной камерой (3×10⁶ клеток на лунку в 1000 мкл среды). Затем отмывали от неприлипших лимфоцитов теплым раствором Хенкса, и культивировали в 1000 мкл среды 24 часа. Затем из лунок отбирали по 500 мкл среды и добавляли в первую лунку 500 мкл ЭТС (контроль), во вторую лунку с клетками того же пациента 500 мкл аутологичной сыворотки крови (опыт), инкубировали 24 часа.

Для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальные клетки линии EA.Hy926 помещали в концентрации 8×10⁵ клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды на стерильное предметное стекло, снабженное 4-луночной камерой, культивировали 24 часа (5% СО₂, 37ºС). Затем в лунки вносили 500 мкл сыворотки здоровых небеременных, здоровых беременных или беременных женщин с гестозом. В контрольные лунки вносили 500 мкл ЭТС, инкубировали 24 часа.

После инкубации моноциты или клетки линии EA.Hy926 отмывали теплым раствором Хенкса, фиксировали 10% формалином 10 минут, отмывали дистилированой водой 15 минут. Подготовленные таким образом препараты моноцитов или эндотелиальных клеток промывали 70% изопропанолом 10 минут и окрашивали 0,25% раствором OIL RED O («ICN», США) в 70% изопропаноле 10 минут; промывали дистилированой водой 10 минут; окрашивали гематоксилином 5 минут и промывали дистилированой водой. Препараты фиксировали в глицерин-желатине. Анализировали площадь липидных включений при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 4.0 (Видеотест, Россия). Площадь липидов в каждом поле зрения делили на количество ядер и умножали на 100. Из полученных значений площади липидов в клетках, проинкубированных в присутствии сывороток крови, вычитали значение площади экспрессии липидов, полученное для тех же клеток, но проинкубированных в обычной среде с добавлением 500 мкл ЭТС.

Оценку концентрации растворимых форм мембранных рецепторов в сыворотке крови проводили при помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа: sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1, sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия).

Оценка продукции цитокинов и растворимых форм мембранных рецепторов тканью плаценты. Для иммуногистохимического анализа экспрессии различных факторов экспланты из центральной части плацент фиксировали в 10% формалине. Экспланты из центральной части тех же плацент культивировали в среде DMEM\F12, 10% ЭТС (Sigma, США) 24 часа. Кондиционированные среды собирали и замораживали. Экспланты плацент взвешивали для пересчета концентрации факторов на 1мг ткани. В полученных кондиционированных средах определяли содержание ангиогенина, VEGF, bFGF, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, RANTES, TNFα, IFNγ, IL-12p70, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-5, IL-10 с использованием тест-систем BD Cytometric Bead Array (BD, США) и цитофлюориметра FACSCanto II (BD, США) в соответствии с указаниями производителя. При помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа определяли содержание sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1 и sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия). Концентрация указанных факторов в среде DMEM\F12, 10% ЭТС не превышала 2 пг/мл.

Иммуногистохимический анализ экспрессии факторов клетками плаценты. Зафиксированные в 10% формалине экспланты из центральной части плацент использовали для иммуногистохимического анализа на серийных срезах экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGFβ, TGFβ-R, CD105, TSP-1, Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1. Визуализацию проводили с применением универсального набора иммуноглобулинов (Novocastra, UK) и стандартного проявляющего набора (ABC-kit, Novocastra, UK). Для контроля использовали антитела против гемоцианина. Анализ площади экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGFβ, TGFβ-R, CD105, TSP-1 в ткани плаценты, выраженную в процентах от площади поля зрения, проводили при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 5.0. Локализацию апоптоза в ткани плаценты оценивали TUNEL-методом при помощи стандартного набора (Chemicon, США). Анализ площади экспрессии Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1 в ткани плаценты, проводили при помощи микроскопа Leica DMR и программы Leica QWin. Иммуногистохимический анализ проводился при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, за что автор выражает благодарность д.м.н., профессору Кветному И.М., к.м.н. Колобову А.В. и Соповой Е.С.

Статистический анализ проводили при помощи критерия Манна-Уитни, медианного теста, используемого для определения тенденции изменения признака [Makhseed M., 2001], и корреляционного анализа Спирмена в программе STATISTICA 6.0.