Isbn 978-5-7262-1377 нейроинформатика 2011

Вид материала

Документы

Содержание Ключевые слова Сеть внутриклеточных сигнальных путей Экспериментальный анализ моделей пластичности

Подобный материал:

• Isbn 978-5-7262-1377 нейроинформатика 2011, 107.92kb.
• Isbn 978-5-7262-1377 нейроинформатика 2011, 136.96kb.
• Isbn 978-5-7262-1377 нейроинформатика 2011, 97.16kb.
• Isbn 978-5-7262-1375 нейроинформатика 2011, 127.94kb.
• Isbn 978-5-7262-1375 нейроинформатика 2011, 25.66kb.
• Isbn 978-5-7262-1375 нейроинформатика 2011, 105.62kb.
• Isbn 978-5-7262-1226 нейроинформатика 2010, 142.85kb.
• Isbn 978-5-7262-1376 нейроинформатика 2011, 103.58kb.
• Isbn 978-5-7262-1375 нейроинформатика 2011, 79.42kb.
• Isbn 978-5-7262-1226 нейроинформатика 2010, 136.25kb.

А.Л. ПРОСКУРА, И.А. МАЛАХИН, Т.А. ЗАПАРА,

А.С. РАТУШНЯК

Конструкторско-технологический институт вычислительной техники СО РАН,

Новосибирск

ratush@mail.ru


ИНФОРМАЦИОННЫЕ ФУНКЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПЛАСТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

В НЕЙРОННЫХ СИСТЕМАХ


В работе на основе литературных и экспериментальных данных проведен теоретико-экспериментальный анализ временной последовательности пластических процессов, создана сеть белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе механизмов локальной пластичности.

Предложена концептуальная модель нейрональной пластичности. Применение такой модели при разработке информационных систем, возможно, позволит приблизить их функциональные возможности к характеристикам биологических прототипов.


Ключевые слова: нейрональная пластичность, обучение, память


Введение


Одной из ключевых проблем бионейроинформатики является поиск молекулярных механизмов записи и долговременного хранения информации в нейронных системах. В клетке описаны универсальные системы передачи внешних воздействий от рецепторов на внутриклеточные молекулярные мишени – эффекторы.

В комплексе нейробиологических и клеточно-молекулярных исследований за последние несколько десятков лет накоплен огромный объем экспериментальных данных. Список путей внутриклеточной передачи сигналов, молекул, ферментов, генов участвующих в информационных процессах в клетке огромен. Это должно было позволить приблизиться к пониманию основных принципов организации и функционирования молекулярных информационных устройств – нейронов. Однако основные концептуальные вопросы бионейроинформатики до сих пор остаются без однозначного ответа. Есть мнение, что такой аналитический “подход уже исчерпал себя”, “мы имеем другую и, возможно, еще более тяжелую проблему. Мы буквально тонем в данных”. “Вы можете собрать все данные в мире, но без модели данных никогда не будет достаточно” [1]. Большое количество усилий приложено к изучению безусловно важных деталей работы клетки но отсутствие концептуальных моделей не позволяет объединить эти данные превратить их в знания и в конечном итоге приводит к непродуктивности прилагаемых усилий и затрат.

Для создания концептуальной модели нейрона необходима интеграция основных экспериментальных данных. Нейрональная пластичность, дифференцировка, основные этапы процессов долговременной потенциации и депрессии уже представлены в современных базах данных. Однако, синтез знаний из имеющегося разнообразия данных достаточно сложен, и пока не получены однозначные ответы на основные вопросы. Нам представляется актуальным дополнение уже существующих схем и создание модели сети белок-белковых и генных взаимодействий. Задачи такой сети описать пути внутриклеточной передачи сигнала в нервной клетке от рецепторов к эффекторам с запуском каскада реакций, обеспечивающих морфо-функциональные пластические перестройки в нейроне и активации экспрессии ранних генов. В данной работе нами предпринята попытка разработки сети белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе механизмов локальной пластичности зон обеспечивающих изменение и сохранение активности глутаматэргических синапсов (эффективности синаптической передачи) дендритных шипиков гиппокампа и локальной пластичности нейронов. Проведена экспериментальная проверка некоторых предположений возникающих в результате анализа такой сети.


Сеть внутриклеточных сигнальных путей


Большая часть нейробиологических исследований посвящена анализу процессов, происходящих при обучении и запоминании в синапсах. Синаптическая пластичность – фундаментальное свойство нервных систем и является существенной для выживания.

Одной из наиболее охарактеризованных форм синаптической пластичности является гипокампальная долговременная потенциация (ДП).

Согласно современной концепции, дендритный шипик представляет высоко упорядоченную структуру и имеет микродоменную организацию. Микродомены – функциональные комплексы рецепторных, сигнальных, цитоскелетных и эффекторных белков и липидов, которые позволяют осуществлять физическое взаимодействие и позиционирование молекул партнеров определенного процесса в надмолекулярные комплексы [2].

На основе анализа литературных данных построена сеть белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе изменения эффективности синаптической передачи для дендритного шипика пирамидных нейронов области СА1 гиппокампа мыши. Разработанная модель отражает реконструкцию процессов, происходящих в ранней фазе ДП.

В настоящий момент сеть включает описание около сотни наиболее значимых, на наш взгляд, компонентов. Начальным событием, в описываемом процессе, является индуцируемый внешним сигналом вход ионов Са²⁺. Ответ постсинаптического нейрона на высокочастотную стимуляцию представлен в сети как ряд молекулярных событий в дендритном шипике: высокочастотная стимуляция инициирует выброс нейромедиатора (НМ) из пресинаптической терминали. В мембранном компартменте взаимодействие НМ с ионотронными АМПАР приводит к входу ионов натрия, деполяризации синаптической мембраны, что в свою очередь приводит к активации НМДАР (N-метил-D-аспарагин чувствительные рецепторы) и входу ионов кальция в клетку; входящий кальций в цитоплазматическом компартменте запускает каскады регуляторных событий, обеспечивающих перемещение АМПАР (2-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4- пропион чувствительные рецепторы) и сопутствующих белков в составе эндосом при помощи актин зависимых моторных белков из цитоплазматического пула шипика к мембране и встраивание дополнительных АМПАР в активную зону синапса. Активация метаботропных рецепторов инициирует ремоделирование отдельных микрофиламентов и сети актинового цитосцелета.

В синапсах пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа возбуждающий НМ глютамат, взаимодействует с метаботропными и ионотропных рецепторами. Два типа ионотропных рецепторов – AMPA и NMDA имеют разное физиологическое значение. AMPAР являются в некотором смысле "рабочими" рецепторами синапса, ответственными за передачу сигнала. Открытие каналов этих рецепторов происходит при любых потенциалах постсинаптической мембраны и они проницаемы преимущественно для ионов Na+. Каналы NMDAР являются селективными Ca2+-каналами; их открытие происходит только при деполяризации постсинаптической мембраны; при потенциалах, близких к потенциалу покоя, NMDA-каналы заблокированы ионами Mg2+ внеклеточной среды.

Сеть не отражает в полной мере архитектуры белок-белковых взаимодействий в пределах шипика. Однако, в целом в ней отражена высоко упорядоченная структура шипика, с определенной горизонтальной и вертикальной организацией на всех уровнях – мембранном (синаптическая, перисинаптическая и экстрасинаптические зоны, подмембранном (цитоплазматические участки рецепторов и подмембранные белки, образующие зону постсинаптического уплотнения (ПСУ)) и цитоплазматическом уровне (сеть актиновых филаментов, наличие внутриклеточных депо рецепторов и других белков) [3]. Размером и стабильностью ПСУ управляют скэфолдные белки. Их PDZ-домены осуществляют высоко аффинное не ферментативное взаимодействие между протеинами. Масс-спектрометрия и другие методы определяют примерно 60-400 главных молекул скэфолдов в ПСУ (PSD-95, GKAP/SAPAP, SAP97, shank, и homer). Эти протеины собирают и удерживают ПСУ, образуя ортогональную решетку из вертикальных и горизонтальных филаментов, обеспечивающих закрепление глутаматных рецепторов в активной зоне шипика. Число разных типов рецепторов в активной зоне синапса различается. АМПАР – в диапазоне 5-200. Число НМДАР менее вариабельно (1–5) [4].

Высокочастотная стимуляция инициирует быстрое (30–60 сек) встраивание в мембрану из депо глутаматных рецепторов при участии транспортных белков (миозины 5 и 6). На этом этапе важна сложившаяся организация цитоскелета и его стабильность [5]. Итогом перемещения эндосом к мембране является встраивание дополнительных рецепторов, что приводит к увеличению синаптической эффективности, площади активной зоны и объема шипика (за счет мембран встраивающихся эндосом).

Активация метаботропных АМПАР инициирует ремоделирование актинового цитоскелета. В настоящее время на роль главных регуляторов сигнальных путей от рецепторов мембраны к цитоскелету выдвигаются белки семейства малых ГТФаз. Они циркулируют между активным ГТФ- и не нактивным ГДФ-связанным состояниями, что регулируется белками-регуляторами, такими как GEFs (nucleotide exchange factors), GAPs (GTPase activating proteins) и GDI (guanine–nucleotide dissociation inhibitors). Активные ГТФазы могут связываться со своими мишенями.

В ходе ранней фазы ДП запускается два независимых регуляторных пути, связанных с работой малых ГТФ-аз. Один из них способствует процессам полимеризации актина (RhoA-ROCK-LIMK-Cofilin), второй же путь – стабилизации образуемой цитоархитектуры шипика (Rac1/Cdc42-PAK). Эти сигнальные пути работают параллельно, что обеспечивает не только параллельность регуляторных путей, но и временное разделение процессов, происходящих при активации синапса. Комбинация работы этих путей необходима для полного завершения фазы консолидации ДП.

В первом регуляторном пути происходит активация ROCK (Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase 1), активирующей LIM-киназу которая фосфорилирует кофилин, переводя его в неактивное состояние и стабилизируя F-актин. Этот каскад сопряжен с работой G-белков (через метаботропные АМПАР) и активируется входящим через ионотропные глутаматные рецепторы током ионов кальция [6].

Образование и ветвление новых нитей происходит через активирование Arp2/3 комплекса [7]. Этот процесс также вносит вклад в регуляцию эндоцитоза АМПАР, опосредуемую активацией НМДАР [8]. Процессы образования нового F-актина и его ветвления через комплекс Arp2/3 регулируются Cdc42, N-WASP, Abp1, кортактином. N-WASP здесь выступает и как активатор, и как эффектор – активатор Arp2/3, и эффектор для Cdc42. Белок WAVE1 также регулирует работу комплекса Arp2/3, вероятно, по параллельному пути, не связанному с Cdc42 [6].

Регуляция морфологии шипиковой сети осуществляется белками, регулирующими длину нитей F-актина, главными из которых являются профилин, кофилин, дребрин. Активный кофилин взаимодействует с F-актином, способствуя его ломкости. Профилин связывается с мономерным актином, ускоряет АДФ – АТФ обмен и таким образом содействует полимеризации актина. Дребрин А является стабилизатором нитей актина. Его аффинность снижается связанным с актином кофилином. Это расширяет механистические возможности, посредством которых фосфорилирование кофилина в пределах шипика может регулировать размер шипика: прямо через разрыв F-актина и непрямо через регуляцию активности других актин-связывающих белков [9]. Регуляция работы кофилина осуществляется киназами и фосфотазами. В процессе стабилизации вновь образуемой актиновой сети происходит активация LIMK через путь Rac1-PAK-LIMK. Дефосфорилирование кофилина регулируется фосфатазами (PP1 и кальцинерином) [10]. Графическое изображение сети будет представлено в докладе. На основе разработанной сети создана модель локальной нейрональной пластичности.


Экспериментальный анализ моделей пластичности


Экспериментальный анализ процессов локальной синаптической пластичности исследовался по стандартной методике на срезах гиппокампа. Одним из ключевых механизмов, индуцирующих морфологические изменения в дендритных шипиках, является модификация ионной проводимости мембраны, а также активация процессов перестроек цитоскелетных структур. Исследовано влияние на динамику развития ДП веществ, модифицирующих цитоскелет и модулирующие кальциевую проводимость. Исследовалось влияние хинина, кальциевого ионофора А23187, колхицина и винбластина (в физиологических концентрациях).

Показано что при блокаде кальций зависимых калиевых каналов хинином происходит блокирование развития ДП. Эффект действия кальциевого ионофора зависит от времени его применения. При его кратковременном действии в момент тетанизации происходит увеличение эффективности развития потенциации. В других случаях достоверных различий не отмечено. Деполяризация тубулинов колхицином приводит к сохранению посттетанического увеличения амплитуды популяционного спайка и блокаде развития потенциации популяционных ответов. Блокада полимеризации тубулина винбластином приводит к блокаде развития ДП.

Инструментальные исследования молекулярных процессов, происходящих в синапсах живых нейронов в процессе пластических реакций, ограничены размерами синаптических зон и труднодоступностью для регистрации характеристик и воздействий. Учитывая, что морфологические изменения в активных зонах нейрональных входов, появление и исчезновение синаптических контактов происходит за времена от десятков секунд до нескольких минут, мы попытались создать подобие таких входов на соме изолированного нейрона.

Экспериментальный анализ работы изолированных нейронов ограничены, прежде всего, значительными методическими трудностями, которые, в силу своего многообразия, переходят в принципиальные. Вероятно, это обуславливает сравнительно небольшое число работ направленных на экспериментальный анализ информационных свойств нейрона [11, 12].

Организация внешних электрических входов, регистрация функционирования ионных каналов (молекул, формирующих выходной сигнал) на микроучастках и результирующего клеточного ответа потенциалов действия, осуществлялась с помощью присасывающихся микропипеток с диаметром кончика 5 мкм. Подведение веществ осуществлялось под давлением, через позиционируемый внутри этих пипеток микрокапилляр. Таким методом моделировались несколько электрических или химических входов [13].

Пластические реакции изолированных нейронов возникают при стимуляции участков сомы. Исследованы изменения исходной реакции на стимул, переход спайковых ответов в подпороговые и переход подпороговых ответов в надпороговые. Применялись алгоритмы воздействий, вызывающие увеличения или уменьшения эффективности таких ответов на сигнал, подаваемый на пространственно разделенные входы. В качестве таких алгоритмов были выбраны неассоциированная стимуляция, ассоциированная стимуляция и автоподкрепления [14].

При реализации программы одиночных неассоциированных сигналов многократные, одиночные, внеклеточные импульсы тока подавались на один или несколько входов. Регистрировалась динамика изменения ответов на стимул и их восстановление после прекращения стимуляции. Последовательное нанесение таких стимулов на участок сомы (ограниченный кончиком микропипетки) вызывало сокращение числа потенциалов действия (ПД) и затем полное прекращение ответов. Изменение амплитуды, длительности и формы стимула восстанавливало ответы [15].

При ассоциированном воздействии на разные участки нейрона подавалось последовательно два стимула. Первый из стимул вызывал небольшие колебаниям мембранного потенциала, а второй генерацию ПД. Нанесение серии подобных воздействий приводило к нарастанию амплитуды ответа на исходно не эффективный стимул и переходу от подпороговых ответов к генерации ПД. Реакция клетки на стимулы, наносимые не ассоциировано на другие участки клетки, как правило, постепенно угашалась[15].

В качестве третьей программы выработки нейрональной пластической реакции была выбрана модель с автостимуляцией [14, 16]. При этом вне клеточной системы организовывалась обратная связь, программно корректирующая подачу стимулов по выходному сигналу нейрона. Использовалось две программы внешней обратной связи – подкрепление длинных и подкрепление коротких межимпульсных интервалов (МИ). При этом в первом случае на клетку подавался стимул, в случае если длина МИ превышала заданный порог. Во втором случае стимул следовал спустя время равное 5-10% от значения рассчитанного на участке до включения стимуляции текущего среднего МИ. Подкрепление длинных МИ приводило к переходу клетки в режим более частой генерации ПД. При подкреплении коротких интервалов значение МИ увеличивалось. В ряде случаев клетка при этом переходила в режим генерации пачек состоящих из 3–7 ПД разделенных интервалом между пачками превышающим пороговое значение [16]. Такие разнонаправленные реакции могли вырабатываться на разных участках нейрона многократно в течение эксперимента.

На разных этапах выработки реакции проводилась регистрация ионных токов, протекающих на контрольных и стимулируемых микроучастках клетки. Изменения компонент токов наблюдались на этапе перестройки ответов: Входящие (кальциевые) токи увеличивались на 50–200 % в сравнении с токами, до проведения стимуляции, токами после перестройки ответов и токами на контрольных участках [15].

Исследовалось влияние локальных модификаций ионной проводимости на пластические свойства нейрона. Для этой цели были использованы кальциевый ионофор и хинин. Оба эти вещества изменяют пластические свойства нейронов. В случае введения кальциевого ионофора в микропипетку было обнаружено, что спайковые ответы на подаваемые через нее стимулы прекращались после предъявления первых 4–5 воздействий. При стимуляции не обработанного участка не было обнаружено изменение динамики перестройки ответов [17].

В случае введения хинина в микропипетку оказалось, что ответы на стимулы, наносимые через нее, не изменялись в течение 30–60 минут стимуляции. Обработка одного участка нейрона не оказывала влияния на развитие перестройки ответов на не обработанных участках [17].

Локальная реорганизация молекулярных структур осуществлялась с помощью высокоселективных химических веществ, вводимых в локальные участки клетки. Трансформация молекулярной морфологии оценивалась по клеточным реакциям, электрофизиологическими и имиджинговымы методами [14].

Воздействие на систему микрофиламентов цитоскелета нейронов осуществлялось введением в раствор микропипетки фаллоидина или цитохалазина-В. Введение в раствор микропипетки фаллоидина блокировало изменение реакций нейрона на стимул на уровне, достигнутом к моменту введения стабилизатора актина переводя кратковременные изменения ответов в долговременные. Цитохалазин-В тормозил развитие перестроек ответов [15].

Воздействие на систему микротрубочек осуществлялось введением в раствор микропипетки колхицина или таксола. Колхицин тормозил развитие пластических реакций и ускорял восстановление ответов после прекращения стимуляции. Эффект таксола обнаруживался при повторении серий стимуляции. Таксол, блокируя микротрубочки, не менял реакцию при первой серии и затруднял ее развитие от серии к серии [15].

Исследованные реакции развивались локально на участке подвергавшемуся воздействию. Приведенные результаты статистически значимы.

Заключение


Таким образом, на основе литературных и экспериментальных данных создана сеть внутриклеточных сигнальных белок-белковых взаимодействий и проведена экспериментальная проверка некоторых из предположений, вытекающих из анализа этой сети. Выделено и экспериментально проверено предположение, что основным элементом нейрона, используемым им при реализации его основной информационной функции, записи и хранения информации является структурный (позиционный) микродомен, образующийся в процессе взаимодействия с внешней средой и сохраняющийся системами стабилизации структуры клетки с участием цитоскелета.

Можно предположить, что в молекулярной информационной системе нейрона на основе множества доменов возникающих при обучении, формируется матрица памяти, позволяющая в дальнейшем распознавать, классифицировать и использовать для управления многомерные векторы внешних сигналов. Эта матрица может включать как элементы всех входных сигналов (условного и безусловного стимулов) так и элементы ответов на них. Опознание образа (даже в отсутствии некоторых элементов многомерного вектора) может приводить к “предсказанию” ранее связанных, вероятных событий (корреляция значащего и подпорогового сигнала). Осуществляться такое опознание, вероятно, может благодаря определяемой матрицей динамике распространения волны возбуждения от одного к другому структурно-функциональному элементу клетки. Активизация в результате распознавания вектора включенных в него эффекторных элементов клетки может приводить к формированию ответа, позволяющего избежать или минимизировать внешние воздействия.

Таким образом, основными функциями нервной клетки, как и биологических систем других уровней организации [18, 19], вероятно, является распознающая, классифицирующая, предсказательная и управляющая. Использование концептуальной модели нейрона, учитывающей его основные свойства при разработке имитационных систем, возможно, позволит приблизить функциональные возможности таких систем к их биологическим прототипам, а с другой стороны, приблизит возможность целенаправленно решать задачи медицинской коррекции патологических и когнитивных изменений в нейронных системах.

Высказанные предположения, естественно, нуждаются в дальнейшем теоретико-экспериментальном анализе и требуют развития концептуальных моделей биологических информационных систем.


Список литературы

1. Markram H. The blue brain project // Nat. Rev. Neurosci. 2006. V. 7. P. 153–160.
   
2. Tsunoda S., Sierralta J., Sun Y., Bodner R., Suzuki E., Becker A., Socolich M., Zuker C.S. A multivalent PDZ-domain protein assembles signaling complexes in a G-protein-coupled cascade // Nature. 1997. V. 388. P. 243–249.
   
3. Calabrese B., Wilson M., Halpain S. Development and regulation of dendritic spine synapses // Physiology. 2006. V. 21. P. 38–47.
   
4. Racca C., Stephenson F.A., Streit P., Roberts J.D., Somogyi P. NMDA receptor content of synapses in stratum radiatum of the hippocampal CA1 area // J. Neurosci. 2000. V. 20. P. 2512–2522.
   
5. Krucker T., Siggins G.R., Halpain S. Dynamic actin filaments are required for stable long-term potentiation (LTP) in area CA1 of the hippocampus // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 6856–6861.
   
6. Rex C.S., Chen L.Y., Sharma A., Liu J., Babayan A.H., Gall C.M., Lynch G. Different Rho GTPase-dependent signaling pathways initiate sequential steps in the consolidation of long-term potentiation // J. Cell. Biol. 2009. V. 186. P. 85–97.
   
7. Racz B., Weinberg R.J. Organization of the Arp2/3 Complex in Hippocampal Spines // J. Neurosci. 2008. V. 28. P. 5654–5659.
   
8. Rocca D.L., Martin S., Jenkins E.L., Hanley J.G. Inhibition of Arp2/3-mediated actin polymerization by PICK1 regulates neuronal morphology and AMPA receptor endocytosis // Nat. Cell. Biol. 2008. V. 10. P. 259–271.
   
9. Ivanov A., Esclapez M., Pellegrino C., Shirao T., Ferhat L. Drebrin A regulates dendritic spine plasticity and synaptic function in mature cultured hippocampal neurons // J. Cell Sci. 2009. V. 122. P. 524–534.
   
10. McGough A., Pope B., Chiu W., Weeds A. Cofilin changes the twist of F-actin: implications for actin filament dynamics and cellular function // J. Cell. Biol. 1997. V. 138. P. 771–781.
    
11. Дьяконова Т.Л. Пластичность электровозбудимой мембраны: блокирование хинином привыкания нейрона к ритмической внутриклеточной стимуляции // Докл. АН СССР. 1984. т. 277. С. 240–243.
    
12. Махновский Д.А., Третьякова М.С., Мурзина Г.Б., Пивоваров А.С. Эндоцитоз холинорецепторов в механизме депрессии холиночувствительных нейронов виноградной улитки на клеточной модели привыкания // Журн. высш. нерв. деят. 2010. Т. 60. С. 206–216.
    
13. Ратушняк А.С., Запара Т.А. Влияние на перестройку реакции нейрона стабилизации микрофиламентов // Докл. АН СССР. 1991. Т. 318. С. 492–495.
    
14. Ratushnyak A.S., Zapara T.A. Principles and cellular-molecular mechanisms underlying neuron functions // J. Integr. Neurosci. 2009. V. 8. P. 453–469.
    
15. Запара Т.А., Симонова О.Г., Жарких А.А., Ратушняк А.С. Влияние динамического состояния цитоскелета на нейрональную пластичность // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1999. Т. 85. С. 128–138.
    
16. Ратушняк А.С., Воскресенская Л.В., Панкова Т.М. О следовых электрических реакциях нейронов гиппокампа в культуре ткани. Докл. АН СССР. 1976. Т. 228. С. 1479–1481.
    
17. Ратушняк А.С., Запара Т.А. Перестройка реакции нейрона при локальной модификации мембраны // Докл. АН СССР. 1989. Т. 309. С. 1012–1014.
    
18. Анохин П.К. Системный анализ интегративной деятельности нейрона // П.К. Анохин. Очерки по физиологии функциональных систем. М.: Медицина, 1975. 444 с.
    
19. Витяев Е.Е. Извлечение знаний из данных. Компьютерное познание. Моделирование когнитивных процессов. Новосибирск, НГУ, 2006. 293 с.