Регуляция активности свободных мультиферментных комплексов цикла кальвина у высших растений
| Вид материала | Автореферат |
- Лекция 11 Тема: Высшие растения. Происхождение высших наземных растений. Отдел Моховидные, 276.22kb.
- Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразования у картофеля in vitro, 342.87kb.
- Эпигенетическая регуляция фотосинтетической ассимиляции со 2 у хлопчатника (03. 00., 544.35kb.
- План по теме «Анатомия и морфология высших растений» Цель курса, 22.96kb.
- №3. "Фотосинтез", 852.51kb.
- Учебно-методический комплекс дисциплины "Физиология растений" вузовского компонента, 1046.86kb.
- Конференция по систематике и морфологии растений, посвященная 300-летию со дня рождения, 28.08kb.
- Синтез, исследование строения и no-донорной активности нитрозильных комплексов железа, 509.45kb.
- Рабочая программа дисциплины «ботаника» Код дисциплины по учебному плану опд., 301.75kb.
- Общая характеристика высших растений, 83.92kb.
Адаптация к высоким температурам и освещённости мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации растений.
Для хлопчатника характерен длинный вегетационный период (120-150 дней). В течение этого периода происходят значительные сезонные изменения температуры, влажности воздуха, освещённости и т.д. В годы, когда лето было прохладным, температура и освещённость понижены, нами наблюдалось увеличение содержания водорастворимых белков в листьях хлопчатника в расчёте и на г сырого веса листьев, и на дм2 площади листа (Бакаева, Бабаджанова, 1984; Бабаджанова, Мирзорахимов и др., 1993). Для других культур(Удовенко, 1979; 1979а; Дроздов и др., 1980; Акимова и др., 1982; Филимонов, 1984) также было установлено увеличение содержания водорастворимых белков как при холодовом, так и при тепловом закаливании активно вегетирующих растений.
В связи с этим представляется важным для выяснения адаптивности провести сравнительные исследования ферментативных активностей свободных мультиферментных комплексов, выделенных из листьев растений исходного сорта хлопчатника 108-Ф и его мутанта Дуплекс, высеянных как обычно весной и в августе. При посеве семян хлопчатника в августе в «естественной» лаборатории происходило постепенное или резкое изменение комплекса внешних факторов – температуры и влажности воздуха, почвы, освещённости и т.д.
В таблице 8 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф весеннего посева в фазе бутонизации растений.
Таблица 8
Активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и высокопродуктивного мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (1991).
| Мол.масса кД | Дата выделе ния МФК | Температура ºС | Тип активно сти | Субстрат | Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1 мг белка | ||
| День | Ночь | 108-Ф | Дуплекс | ||||
| 520 480 | 6-10 июля | 30-36 | 18-23 | Рибозофос- фатизо- меразная | рибозо-5- фосфат | 3119±33 2981±30 | 3237±34 3117±33 |
| 520 480 | | | | фосфорибу- локиназная | рибозо-5- фосфат | 4012±43 3575±37 | 4126±45 3680±38 |
| 520 480 | | | | РБФ-карбокси-лазная | рибулозо- 1,5-бисфосфат | 1.40±0.05 0.90±0.05 | 1.91±0.05 1.13±0.05 |
Из представленных в табл. 8 данных видно, что величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-ф и его мутанта Дуплекс, имели очень близкие величины рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности, но различались по РБФ-карбоксилазной активности. Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД, выделенный из листьев мутанта Дуплекс, по РБФ-карбоксилазной активности превосходил на 36% мультиферментный комплекс с такой же молекулярной массой, выделенный из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, была выше на 25% активности мультиферментного комплекса, выделенного из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф.
6.2. Защитно-приспособительные механизмы адаптации к пониженным температурам и освещённости активности мультиферментных комплексов листьев хлопчатника в фазе бутонизации.
В табл. 9 представлены результаты определения ферментативной активности мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при выделении их из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений, когда была солнечная погода и температура воздуха для хлопчатника днём и ночью имела благоприятные физиологические значения (1-ое выделение).
Таблица 9
Ферментативная активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (осенний посев, август 1991г.)
| Мол.масса кД | Дата выде ления МФК | Температура ºС | Тип активности | Субстрат | Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка | ||
| День | Ночь | 108-Ф | Дуплекс | ||||
| 520 480 | 8-10 октя-бря | 24-29 | 16-21 | Рибозофос фатизо меразная | Рибозо-5- фосфат | 3542±37 3388±35 | 4074±42 4049±41 |
| 520 480 | солнечно | | | Фосфорибу локиназная | Рибозо-5- фосфат | 4496±46 3345±35 | 4542±48 4113±43 |
| 520 480 | | | | РБФ-карбокси-лазная | Рибулозо- 1,5-бис фосфат | 2.52±0.05 2.0 ±0.05 | 2.72±0.05 2.31±0.05 |
Независимо от времени выделения и величины молекулярной массы мультиферментные комплексы, выделенные из листьев мутанта Дуплекс, имели большие значения величин всех типов ферментативных активностей в сравнении с мультиферментным комплексами выделенными из листьев исходного сорта хлопчатника сорта 108-Ф.
При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс выделенных из листьев хлопчатника весеннего и осеннего посева (I - выделение) в фазе бутонизации растений видно, что выделенные осенью мультиферментные комплексы имели более высокие величины всех ферментативных активностей.
Выделенный осенью из листьев хлопчатника сорта 108-Ф мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности – на 13%, по фосфорибулокиназной активности - на 11%, а по РБФ-карбоксилазной активности - на 80%. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенная весной, рибозофосфатизомеразная активность была выше на 13%, фосфорибулокиназная активность – на 12%, РБФ-карбоксилазная – в 2.2 раза.
Выделенный осенью из листьев мутанта Дуплекс мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил аналогичный мультиферментный комплекс, выделенный весной, по рибозофосфатизомеразной активности – на 25%, по фосфорибулокиназной активности - на 10%, а по РБФ-карбоксилазной активности - на 42%. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 480 кД, выделенного осенью, в сравнении с мультиферментным комплексом, выделенным весной, рибозофосфатизомеразная активность была выше на 29%, фосфорибулокиназная активность – на 24%, РБФ-карбоксилазная – в 2.0 раза.
В табл. 10 представлены результаты определения ферментативных активностей мультиферментных комплексов, выделенных через 2 недели после I-го выделения из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс осеннего посева, в фазе бутонизации растений.
Из представленных в табл. 10 данных видно, что в сравнении с первым выделением мультиферментных комплексов при втором выделении температура воздуха, снизилась на 8-9ºС, освещённость также была ниже, погода была пасмурной. При этих условиях был выделен мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД и мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД.
Таблица 10
Ферментативная активность мультиферментных комплексов (МФК) с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и мутанта Дуплекс в фазе бутонизации растений (осенний посев, август 1989г.).
| Мол.масса кД | Дата выде ления МФК | Температура ºС | Тип активности | Субстрат | Удельная активность, мкмоль продукта/ мин на 1мг белка | ||
| День | Ночь | 108-Ф | Дуплекс | ||||
| 520 480 | 24-26 октяб- ря | 15-20 | 8-12 | Рибозофос фатизо меразная | Рибозо-5- Фосфат | 3456±36 2924±31 | 3990±30 3711±39 |
| 520 480 | Пасмурно | | | Фосфорибу локиназная | Рибозо-5- Фосфат | 3470±37 2961±32 | 4425±48 3788±39 |
| 520 480 | | | | РБФ-карбоксилазная | Рибулозо- 1,5-бисфосфат | 2.21±0.05 1.64±0.05 | 2.58±0.05 2.04±0.05 |
Из представленных в табл. 10 данных видно, что выделенные из листьев обоих объектов мультиферментные комплексы с молекулярной массой 520 кД превосходили мультиферментные комплексы с молекулярной массой 400 кД по величинам рибозофосфатизомеразной, фосфорибулокиназной и РБФ-карбоксилазной активности.
У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД, выделенного из листьев мутанта Дуплекс, в сравнении с аналогичным комплексом, выделенным из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, величина рибозофосфатизомеразной активности была выше на 15%, фосфорибулокиназной на 27%, РБФ-карбоксилазной на 11%
Мультиферментный комплекс с молекулярной массой 400 кД листьев мутанта Дуплекс превосходил аналогичный комплекс листьев хлопчатника сорта 108-Ф по рибозофосфатизомеразной и фосфорибулокиназной активности на 27%, а по РБФ-карбоксилазной на 24%.
При сравнении величин ферментативных активностей мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс при I-ом и II-ом выделении видно снижение величин их активности, особенно у обнаруженного при II-ом выделении мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД, но все величины ферментативных активностей были выше, чем у мультиферментных комплексов выделенных из растений весеннего посева.
При всех условиях роста и развития растений у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев мутанта Дуплекс, величины всех ферментативных активностей были значительно выше, чем у мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф. В работе (Бабаджанова, Мирзорахимов, Алиев,. 1990; Мирзорахимов, 1992) установлено, что РБФК/О мутанта обладает большим сродством к субстратам, т.е. имеет меньшие значения величин константы Михаэлиса Км табл.11.
Таблица 11.
Величины Км(каж)s 0,5 для обоих субстратов РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс.
| О б ъ е к т | С у б с т р а т ы | |
| РБФ, Км(s 0,5)х10-4м | NaH14CO3 Км(s 0,5)х10-5м | |
| Хлопчатник, сорт 108-Ф | 0.89±0.01 | 1.75± 0.01 |
| мутант Дуплекс | 0.38±0.01 | 0.95± 0.05 |
Из представленных в табл. 11 данных видно, что в сравнении с исходным сортом хлопчатника РБФ-карбоксилаза мутанта Дуплекс имеет меньшую величину константа Михаэлиса для рибулозо-1.5-бисфосфата и NaH14CO3, что свидетельствует об увеличении сродства с субстратом фермента листьев мутанта.
6.3. Активность мультиферментных комплексов, выделенных из листьев гороха в фазе вегетации, выращенных при пониженных температурах и освещённости.
Поскольку растения гороха являются классическим объектом биохимических исследований, то представлялось важным изучить влияние пониженных температур и освещённости на образование и функциональные свойства мультиферментных комплексов. В связи с этим горох был высеян в почву (месяц - февраль) в лабораторных условиях. При зимнем посеве из листьев двухнедельных проростков гороха были выделены после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целюлозе линейным градиентом концентраций NaCl три мультиферментных комплекса с молекулярной массой 520, 480 и 400 кД. В табл. 12 приведены результаты определения величин активностей этих мультиферментных комплексов.
Таблица 12
Активность мультиферментных комплексов с различными величинами молекулярных масс, выделенных из листьев двухнедельных проростков гороха сорта Крепыш при зимнем выращивании растений (февраль).
| Ферментативная активность | Молекулярная масса | Субстрат | Активность, мкмоль продукта/ мин. на 1мг белка |
| Рибозофосфат- изомеразная | 520 480 400 | рибозо-5-фосфат | 2870±30 2742±28 2716±28 |
| Фосфорибуло- киназная | 520 480 400 | рибулозо-5-фосфат | 1863±19 1560±16 1450±15 |
| РБФ-карбоксилазная | 520 480 400 | РБФ | 1.06±0.05 0.75±0.05 0.66±0.05 |
Из представленных в табл. 12 данных видно, что мультиферментные комплексы не различались между собой по величинам рибозофосфатизомеразной активности.
По фосфорибулокиназной активности мультиферментный комплекс с молекулярной массой 520 кД превосходил мультиферментный комплекс с молекулярной массой 480 и 400 кД на 80-78% соответственно.
Наибольшие различия мультиферментные комплексы имели по величине рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазной активности. У мультиферментного комплекса с молекулярной массой 520 кД РБФ-карбоксилазная активность была выше активности мультиферментного комплекса с молекулярной массой 400 кД – на 38%. Из представленных результатов видно, что чем меньше величина молекулярной массы, тем ниже их РБФ-карбоксилазная активность.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты многолетних исследований позволяют заключить, что образующиеся на разных фазах развития растений свободные мультиферментные комплексы цикла Кальвина с различной молекулярной массой и каталитической активностью обеспечивают онтогенетические особенности изменений интенсивности фотосинтеза, связанные с необходимостью удовлетворения возрастающей потребности эпигенетических процессов в ассимилятах.
Полученные нами результаты подтверждают данные об онтогенетических изменениях интенсивности фотосинтеза и количества образующегося продукта реакции карбоксилирования ФГК у хлопчатника (Якубова, Юлдашев, 1983; Якубова, 1984; Юлдашев, 1996). Образование различных типов мультиферментных комплексов цикла Кальвина вызвано необходимостью увеличения фотосинтетической фиксации СО2 в период формирования репродуктивных органов и их созревания, так как активность ферментов фосфорибулокиназы и РБФ-карбоксилазы/оксигеназы, встроенных в мультиферментные комплексы, значительно выше, чем у свободных форм ферментов. Это обусловлено действием в мультиферментных комплексах особых регуляторных механизмов – «направленного или туннельного переноса метаболитов», координированной регуляции одними и теми же эффекторами и диссоциативного механизма регуляции.
Использование сравнительного подхода при изучении активности ферментов цикла Кальвина фазы карбоксилирования у исходных форм растений хлопчатника и арабидопсиса и их мутантов с низкой и высокой интенсивностью фотосинтеза и продуктивностью позволило выявить независимо от генотипа растения специфические физиолого-биохимические особенности, характерные для высокопродуктивных мутантов. Высокопродуктивные мутанты хлопчатника и арабидопсиса отличались от низкопродуктивных форм более высоким содержанием мультиферментных комплексов и их большей каталитической активностью.
Результаты наших исследований подтверждают данные, полученные in vivo при комплексных исследованиях листьев хлопчатника, что генотипическое разнообразие и онтогенетическая динамика фотосинтетической фиксации листа обусловлена, главным образом, концентрационными изменениями в единице листовой поверхности активного фермент – субстратного комплекса, осуществляющего первичную фиксацию СО2 (Расулов, 1994; Каспарова, 2006).
Полученные данные свидетельствуют о том, что возрастание активности ферментов фазы карбоксилирования является необходимым условием для повышения фотосинтетической фиксации растения наряду со многими другими факторами. К таким факторам относятся, прежде всего, морфофизиологические особенности растений, например, форма листьев и такое расположение их на стебле, которое способствовало бы лучшему радиационному режиму в посеве и повышению интенсивности фотосинтеза; близость плодовых органов к донорным, что оптимизировало бы донорно-акцепторные отношения и т.д.
Важным условием для нормального протекания продукционного процесса является устойчивость растений к постоянно изменяющимся факторам внешней среды. Поэтому нами была предпринята попытка моделирования изменений факторов внешней среды не в искусственной камере, как это было сделано А. Абдуллаевым (1991; 1994), а в «естественной» лаборатории при осеннем посеве (август) хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. В период выращивания растений хлопчатника с августа по ноябрь происходило постепенное снижение температуры воздуха и освещённости причём величины температуры воздуха были физиологически благоприятными, для С3 - вида растения.
Величины РБФ-карбоксилазной активности свободных мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных в начале июля (фаза бутонизации), когда была высокая освещённость, а температура воздуха днём в тени достигала 30-36ºС, были значительно ниже величин РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов, выделенных в начале октября, когда освещённость была ниже, а температура воздуха днём в тени достигала 24-29ºС. Аналогичные результаты были получены в искусственной камере (Магомедов и др., 1991.; Абдуллаев , 1994), где растения хлопчатника выращивали при температурах 25 и 35ºС комбинируя низкую и высокую освещённость. Длительное охлаждение растений (от нескольких суток до месяцев) при неповреждающей температуре, сопряжённое, как правило, с ростом их холодоустойчивости, приводит к существенным изменениям активности рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназы (Филимонов, 1984). У целого ряда объектов с различными путями ассимиляции углерода, адаптации к холоду сопровождалось ускорением карбоксилирования РБФ. Подобная закономерность показала и для растений хлопчатника (Downton, Statyer, 1972).
В работе А. Эргашева (1997) также установлено, что температуры выше 37 ºС в сочетании с воздушной засухой в период от начала бутонизации до массового формирования коробочек приводили к существенным сдвигам физиолого-биохимических процессов: снижалось содержание водорастворимых белков, хлорофилла, аскорбиновой кислоты, интенсивность фотосинтеза, сухого вещества, при этом одновременно повышалась интенсивность темнового дыхания и активность каталазы.
Важнейшим типом приспособительных реакций организма к изменяющимся температурным условиям являются изменения каталитических свойств ферментов в результате модификаций их молекул.
В результате индукции стрессовых генов при адаптации растений к температурному сдвигу могут появиться новые разновидности ферментов с кинетическими свойствами, отвечающими новым температурным условиям. Они могут появиться даже тогда, когда температура среды колеблется в пределах всего лишь 8-6ºС.
Снижение освещённости и температуры воздуха днём до 15-20ºС приводило к появлению новой разновидности мультиферментного комплекса, что является, по всей вероятности, одной из защитно-приспособительных реакций хлоропласта.
При всех вариантах варьирования факторов внешней среды (температуры и освещённости) величины ферментативных активностей мультиферментных комплексов цикла Кальвина, выделенных из листьев мутанта Дуплекс были всегда значительно выше величин активности мультиферментных комплексов, выделенных из листьев исходного сорта 108-Ф. Следовательно, стабильность при различных условиях отличий мутанта Дуплекс от исходного сорта 108-Ф по содержанию мультиферментных комплексов и их каталитической активности свидетельствует об устойчивости его фотосинтетического аппарата к воздействию таких постоянно изменяющихся факторов внешней среды как температура и освещённость.
Результаты наших исследований согласуются с данными, полученными К.А.Алиевым и Ш.А.Эсаналиевой (2010) при изучении у четырёх генотипов хлопчатника влияния пониженных температур и освещённости на РБФ-карбоксилазную активность свободных мультиферментных комплексов. У продуктивных инбредных линий хлопчатника Л-461 и Л-601мультиферментные комплексы цикла Кальвина оказались более устойчивыми к продолжительному действию положительных пониженных температур и освещённости, компенсируя их влияние на скорость реакций мультиферментного комплекса двумя путями – снижением каталитической активности ферментов в пределах физиологической нормы и увеличением содержания ферментов в единице площади листа.
Познание регуляторных механизмов адаптации растений к изменяющимся факторам внешней среды имеет важное значение для управления продукционным процессом. Фотосинтез не только обеспечивает строительным материалом и энергией процессы роста, но и генерирует вещества гормональной и ингибиторной природы, которые сами являются регуляторами дифференциальной активности генов, т.е. фотосинтез участвует в реализации генетической программы развития и, следовательно, активно воздействует на процессы эпигенеза. Таким образом происходит интеграция фотосинтеза и роста (Мокроносов, 1981; 1981а; Кефели, 1992; Кузнецов, Дмитриева, 2006; Алёхина, Балнокин и др., 2007; Якубова, 2011).
Совокупность литературных данных и полученных нами результатов экспериментальных исследований позволяет заключить, что в селекционной работе на высокую продуктивность растений необходимо сочетать генетико-селекционное совершенствование различных функциональных систем хлоропласта методами направленной мутационной селекции с традиционными методами селекции на улучшение морфофизиологических особенностей растения, оптимизации донорно-акцепторных отношений и повышение устойчивости (приспособляемости) к различным факторам внешней среды и т.д.