Овчарова Анастасия Никитовна Морфологическая характеристика тонкой и толстой кишки при экспериментальном первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками 03. 03. 04 клеточная биология, цитология, гистология автореферат

Вид материала

Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы через 30 сут п
Список работ, опубликованных по теме диссертации

Подобный материал:

1 2

Таблица 5. Морфометрическая характеристика функциональных зон селезенки мышей Balb/с при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками

№	Группа наблюдений		Объемная доля функциональных зон селезенки				Соотно-шение БП/КП
№	Группа наблюдений		Лимфоидные фолликулы	Светлый центр	ПАЛМ	Красная пульпа	Соотно-шение БП/КП
1	Контроль		35,9±2,0	9,6±0,9	19,3±1,3	44,8± 2,1	1,2 ± 0,2
2	Антибиотики		40,0 ±1,9	17,2± 1,2	14,7± 1,7	45,3± 2.0	1,2±0,1
3	Пробиотик Энтероцин		42,8± 3,3	18,3 ±1,5	13,4± 0,9	43,8± 2,9	1,3±0,3
4	Пробиотик колибактерин		35,6 ±1,5	21,9± 1,2	15,3± 0,6	49,1± 2,3	1,0±0,2
5	Через30сут после оконч.введ. энтероцина		37,6± 4,6	18,8 ±3,3	16,3 ±1,4	46,1± 2,2	1,1±0,1
6	Через30сут после оконч.введ. колибактерина		37,8 ±5,9	22,2± 2,1	15,7± 1,1	46,5± 2,5	1,1±0,03
Достовер-ность различий		1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 3-4 5-6	>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05	<0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 >0,05 >0,05	<0,05 <0,01 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05	>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05	> 0,05 > 0,05 > 0,05 >0,05 >0,05 > 0,05 > 0,05

Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы после курсового введения пробиотиков

После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин состав просветной микрофлоры мышей изменился: нормализовалось количество энтеробактерий, появились ферментирующие эшерихии, что отражает частичное восстановление микробиома (рис. 2).

*- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой

*

*

*

*

*

*

*

*

*

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1-

2-

3-

4-

5-

Рис. 2. Количественный и качественный состав просветной микрофлоры мышей BALB/c после курсового введения антибиотиков и после коррекции первичного дисбиоза пробиотиками энтероцин и колибактерин

На основании полученных данных нельзя сказать, что введенные мышам Balb/с пробиотические штаммы колонизировали кишечник, поскольку их способность к колонизации в суспензионной форме подвергается сомнению (Del Piano M., 2010). В связи с этим, определяемые в фекалиях ферментирующие энтеробактерии могут в действительности иметь источником пробиотический штамм, который, проходя через желудочно-кишечный тракт, активно выделяет метаболиты, позитивно действующие на барьерную функцию кишечника. Тем не менее, после курса пробиотиков, количество ферментирующих эшерихий в составе просветной микрофлоры практически сравнялось с таковым в контрольной группе животных. Возросло количество бифидобактерий и лактобацилл после введения колибактерина, после энтероцина количество как бифидо-, так и лактобактерий снижалось. Неоднозначные результаты были получены среди представителей рода Enterococcus. У животных контрольной группы статистически достоверные изменения качественного и количественного состава энтерококков на всех стадиях эксперимента не фиксировались. В группе животных, получавших пробиотик энтероцин, наблюдалось восстановление количества энтерококков. В группе мышей, получавшей колибактерин, представители рода Enterococcus в составе просветной микрофлоры обнаружены не были (Рис. 2), что может быть связано наличием антагонистических взаимодействий между ними и пробиотическим штаммом. Данные в пользу этого предположения были получены в опытах in vitro при длительном совместном культивировании в бинарных культурах на плотной питательной среде штамма E.coli M17 (штамм, на основе которого был создан колибактерин) и индигенных энтерококков (Чертович Н.Ф. с соавт., 2008).

В слизистой оболочке тонкой кишки мышей после коррекции дисбиоза при гистологическом исследовании патологических изменений не выявлялось. При морфометрическом исследовании показатель объемной доли бокаловидных клеток достигал контрольных значений. Число межэпителиальных лимфоцитов в группе мышей, получавших энтероцин, статистически значимо увеличивалось, а в группе, получавшей колибактерин, достоверно не изменялось, число нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки достоверно не менялось относительно мышей после курса антибиотиков (табл. 1). Это отражает реактивные изменения тонкой кишки в ответ на введение пробиотика и коррелирует с данными других исследователей (Калмыкова А.И. с соавт., 2005).

В слизистой оболочке толстой кишки мышей после курсового введения пробиотиков при гистологическом исследовании выявлялось большое количество бокаловидных клеток, в собственной пластинке слизистой оболочки определялась слабо выраженная очаговая инфильтрация клеточными элементами. По данным морфометрического исследования толщина слизистой оболочки толстой кишки после курса обоих пробиотиков была достоверно ниже, чем в группе мышей после курса антибиотиков, показатели достоверно не отличались от контроля. Показатель объемной доли бокаловидных клеток у мышей, получавших энтероцин, достоверно не изменялся; у мышей, получавших колибактерин, достоверно снижался, но не достигал контрольных значений. Число нейтрофилов статистически значимо не отличалось от такового у мышей после курса антибиотиков (табл. 2). По данным В.Н. Афонюшкина с соавт. (2007) у крыс после введения пробиотика SL-бактерина на фоне антибиотик-индуцированного дисбиоза наблюдалась гипертрофия и гиперплазия бокаловидных клеток в тонкой кишке, увеличивалась толщина слизистой оболочки толстой кишки и отмечалась воспалительная инфильтрация ее стромы. В исследовании И.Т. Щербакова (1999) при применении пробиотика бифидумбактерина у человека при острых кишечных инфекциях различной этиологии выявилась нормализация показателя толщины собственной пластинки слизистой оболочки толстой кишки, числа межэпителиальных лимфоцитов, уменьшалась выраженность воспалительной инфильтрации слизистой оболочки.

В печени мышей после коррекции дисбиоза пробиотиками энтероцином и колибактерином выявлялась умеренно выраженная гиалиново-капельная дистрофия гепатоцитов, преимущественно периферических отделов долек. При морфометрическом исследовании число внутридольковых лимфоцитов в группе мышей, получавших энтероцин, было достоверно ниже контрольных значений, а в группе, получавшей колибактерин, статистически значимо не изменялось. Показатель содержания неэпителиальных клеточных элементов по ходу печеночных балок по сравнению с группой мышей, получавших антибиотики, достоверно возрастал и не отличался от контроля (табл. 3).

В тимусе после коррекции нарушений состава микрофлоры энтероцином, выявлялось очаговое опустошение коркового слоя, а после применения колибактерина отмечалось его расширение. При морфометрическом исследовании тимуса после применения энтероцина показатель отношения коркового слоя к мозговому был достоверно ниже контрольных значений, и не отличался от группы мышей после курса антибиотиков. В группе мышей, получавшей колибактерин, этот показатель достигал контрольных значений (табл. 4).

В селезенке при гистологическом исследовании после применения пробиотика энтероцина преобладала белая пульпа, большая часть лимфоидных узелков была со светлыми центрами, зона ПАЛМ слабо выражена. После применения колибактерина, в селезенке также преобладала белая пульпа, в большинстве лимфоидных узелков определялись крупные зародышевые центры, зона ПАЛМ, также как и в группе, получавшей энтероцин, была выражена слабо. При морфометрическом исследовании после применения энтероцина объемная доля светлых центров и зоны ПАЛМ не отличалась от группы, получавшей антибиотики. После применения колибактерина увеличивался показатель объемной доли светлых центров лимфоидных узелков, показатель объемной доли зоны ПАЛМ достоверно не менялся по сравнению с мышами после курса антибиотиков (табл. 5).

Состав просветной микрофлоры и морфологические изменения тонкой, толстой кишки, печени и органов иммунной системы через 30 сут после курсового введения пробиотиков

При изучении действия пробиотиков энтероцина и колибактерина через 30 сут после окончания коррекции первичного дисбиотического состояния в составе просветной микрофлоры мышей произошли следующие изменения: в группе мышей, получавших энтероцин, качественный и количественный состав микрофлоры нормализовался (рис. 3). Тогда как у мышей, получавших колибактерин, не обнаруживались характерные для нормофлоры представители рода Enterococcus. В обеих группах мышей, получавших энтероцин и колибактерин, наблюдалось замещение условнопатогенных неферментирующих энтеробактерий нормальными, ферментирующими эшерихиями, но в группе, получавшей энтероцин, количество последних было на порядок больше, чем в группе, получавшей колибактерин (рис. 3). Объяснением этому факту может служить то, что оба пробиотика обладают значительным антагонизмом по отношению к систематически близким энтеробактериям и способны эффективно вытеснять их из состава микробиоты. В то же время, штамм E. coli M 17, на основе которого создан колибактерин, в отличие от штамма E. coli EB 429, послужившего основой для разработки энтероцина, не обладает достаточной адгезией к эпителию кишечника мыши и постепенно элиминируется из желудочно-кишечного тракта подопытных животных. Следствием этого было более низкое содержание ферментирующих эшерихий в группе мышей, получавших колибактерин. Количество бифидобактерий и лактобактерий в группе, получавшей энтероцин, достигло контрольных значений, в группе, получавшей колибактерин, количество бифидо- и лактобактерий понизилось.

При гистологическом исследовании слизистой оболочки тонкой кишки на 30-е сут после курсового введения колибактерина и энтероцина, показатели объемной доли бокаловидных клеток нормализовались. Число межэпителиальных лимфоцитов после применения энтероцина соответствовало контрольным значениям, а после применения колибактерина этот показатель был меньше контрольных значений. Показатель числа нейтрофилов после коррекции дисбиоза энтероцином и колибактерином нормализовался (табл. 1). В слизистой оболочке толстой кишки реактивные изменения сохранялись – толщина слизистой оболочки была ниже контрольных значений, выраженность гиперплазии бокаловидных клеток значительно уменьшалась, однако не достигала контрольных значений, сохранялась слабо выраженная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки лимфоцитами, гистиоцитами и единичными нейтрофилами (табл. 2).

*- различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой

*

*

*

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1-

2-

3-

4-

5-

Рис. 3. Количественный и качественный состав просветной микрофлоры мышей BALB/c через 30 сут после окончания курсового введения пробиотиков энтероцина и колибактерина

В печени при использовании обоих пробиотиков дистрофические изменения не выявлялись, морфологическая картина печени не отличалась от таковой у мышей контрольной группы. Тимус мышей, получавших энтероцин и колибактерин, имел нормальное строение и не отличался от такового в контрольной группе. В селезенке показатель объемной доли зоны ПАЛМ соответствовал контрольным значениям, а светлых центров лимфоидных узелков оставался выше контрольных значений (табл. 5).

Таким образом, пробиотические штаммы, несмотря на многочисленные благоприятные эффекты, не эквивалентны собственной индигенной микрофлоре и не способны размножаться в кишечнике. Одной из причин этого может быть бионесовместимость с резидентными бактериями хозяина (Глушанова Н.А., Блинов А.И., 2005). Даже наиболее эффективные пробиотики действуют только во время курса лечения и обнаруживаются в кале лишь в течение 3–7 сут после его окончания (Катт М.A., 2001). Поэтому, для достижения устойчивого терапевтического эффекта, во-первых, необходим длительный или даже постоянный прием пробиотиков, во-вторых, желательно, чтобы пробиотический препарат представлял собой штаммы нормобиоты, максимально совместимые с резидентными штаммами (Корниенко Е.А., 2007).

Курсовое введение канамицина и тетрациклина приводит к нарушению состава микрофлоры кишечника. При коррекции дисбиотического состояния пробиотиками энтероцином и колибактерином произошла нормализация микрофлоры, однако эффект пробиотика энтероцин выражен в большей степени, чем пробиотика колибактерин, о чем свидетельствует более высокое содержание ферментирующих эшерихий, нормализация количества энтерококков у мышей, получавших энтероцин, и отсутствие энтерококков у мышей, получавших колибактерин. Введение антибиотиков вызывает реактивные изменения тонкой и толстой кишки, характеризующиеся гиперплазией бокаловидных клеток, увеличением содержания межэпителиальных лимфоцитов и нейтрофилов, это коррелирует с данными Калмыковой А.И. и соавт, (2005). После коррекции первичного дисбиоза пробиотиками энтероцином и колибактерином сохраняются структурные изменения слизистой оболочки тонкой кишки в ответ на введение пробиотика. Выявленные структурно-функциональные изменения тимуса и селезенки после введения антибиотиков и пробиотиков являются неспецифической реакцией, развивающейся в ответ на их введение и с функциональной точки зрения указывают на активацию иммунной системы.

Через 30 сут после коррекции дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин морфологическая картина в тонкой кишке, печени, тимусе и селезенке практически не отличались от контроля, но сохранялись реактивные морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки. Это, видимо, обусловлено тем, что основная масса бактерий находится именно в толстой кишке, поэтому восстановление ее микрофлоры под действием пробиотиков сочетается с длительно сохраняющимися реактивными морфологическими изменениями ее слизистой оболочки.

ВЫВОДЫ

Курсовое введение канамицина и тетрациклина в терапевтических дозах (250 мг/кг) вызывает у самцов мышей линии Balb/с развитие первичного дисбиотического состояния, реактивных морфологических изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, печени и органов иммунной системы.
Первичное дисбиотическое состояние, индуцированное у мышей Balb/с курсовым введением антибиотиков широкого спектра действия, характеризуется качественным и количественным нарушением состава микрофлоры с уменьшением числа неферментирующих энтеробактерий, исчезновением ферментирующих энтеробактерий и энтерококков, сохранением лакто- и бифидофлоры.
При первичном дисбиозе реактивные изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки характеризуются статистически значимым увеличением объемной доли бокаловидных клеток и абсолютного числа нейтрофилов. В толстой кишке, кроме того, определяются гиперплазия и лимфоидно-гистиоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки, в тонкой кишке увеличивается показатель числа межэпителиальных лимфоцитов. В печени снижается абсолютное число неэпителиальных клеточных элементов и внутридольковых лимфоцитов.
Развитие первичного дисбиоза сопровождается изменением морфофункционального состояния органов иммунной системы. В тимусе уменьшается объемная доля коркового слоя, в селезенке снижается объемная доля периартериолярных лимфоидных муфт и увеличивается доля светлых центров лимфоидных узелков.
При коррекции первичного дисбиоза колибактерином и энтероцином микробиоценоз желудочно-кишечного тракта у мышей Balb/с частично восстанавливается. При применении индигенного пробиотика энтероцина наблюдается восстановление видового состава нормофлоры и количества одного из основных компонентов микробиома – бифидобактерий. При использовании препарата колибактерина среди видового состава нормофлоры не происходит восстановления группы энтерококков.

После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиками энтероцин и колибактерин выраженность реактивных морфологических изменений в тонкой и толстой кишке, в целом, уменьшается. В тонкой кишке показатель объемной доли бокаловидных клеток нормализуется, показатель числа нейтрофилов в строме слизистой оболочки снижается. Число межэпителиальных лимфоцитов при использовании пробиотика энтероцин статистически значимо увеличивается. В слизистой оболочке толстой кишки отмечается нормализация показателя толщины слизистой оболочки, снижение выраженности лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрации стромы, а показатели объемной доли бокаловидных клеток и числа нейтрофилов остаются повышенными.
После коррекции первичного дисбиотического состояния пробиотиком энтероцин объемная доля коркового слоя тимуса остается сниженной, а после применения колибактерина этот показатель нормализуется. После применения обоих пробиотиков по сравнению с контрольной группой мышей реактивные изменения в селезенке сохраняются: показатели объемной доли периартериолярных лимфоидных муфт остаются ниже контрольных значений, а светлых центров лимфоидных узелков – выше.
Выявлены принципиальные отличия взаимодействия с микробиомом пробиотиков колибактерина и энтероцина в отдаленном периоде (30 сут) после их применения. Индигенный пробиотик энтероцин приводит к восстановлению качественного и количественного состава всех групп бактерий, за исключением ферментирующих эшерихий, количество которых превышает показатели контрольной группы. При использовании для коррекции дисбиоза колибактерина восстановления энтерококков не происходит, количество лакто- и бифидобактерий по сравнению с контролем достоверно снижается и дисбиотические изменения сохраняются

По данным морфометрического исследования через 30 сут после коррекции дисбиоза обоими пробиотиками реактивные изменения сохраняются только в толстой кишке и селезенке. В толстой кишке сохраняется увеличение показателей объемной доли бокаловидных клеток и числа нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки. В селезенке сохраняется увеличение объемной доли светлых центров лимфоидных узелков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Овчарова А.Н., Алексанкин А.П., Тихонова Н.Б., Козловский Ю.Е, Серебряков С.Н. Сравнительная оценка эффективности действия пробиотиков Энтероцин и Колибактерин при экспериментальном дисбактериозе. //Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы клеточного пушного звероводства России», Москва, 2007.- с.223-227.
Овчарова А.Н. Морфологическая характеристика иммунной системы мышей BALB/с при нарушении состава микрофлоры и коррекции его пробиотиками «Энтероцин» и «Колибактерин» //Материалы научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии, Москва, 2008. - с.118-122.
Овчарова А.Н., Михайлова Л.П., Серебряков С.Н., Макарова О.В., Козловский Ю.Е., Матевосян К.Ш., Тихонова Н.Б. Морфологическая характеристика иммунной системы мышей Balb/c при нарушении состава микрофлоры и коррекции его пробиотиками «энтероцин» и «колибактерин» //Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова, 2009. - №1 - с. 8-18
Кактурский Л.В., Михайлова Л.П., Овчарова А.Н., Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н., Тихонова Н.Б.. Морфологическая характеристика тонкой и толстой кишки мышей Balb/c при нарушении состава микрофлоры, индуцированном антибиотиками.// Морфологические ведомости, 2011. - №2. - с. 36-43
Хомякова Т.И., Хомяков Ю.Н., Козловский Ю.Е., Макарова О.В., Овчарова А.Н., Михайлова Л.П. Морфологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки при первичном дисбиозе и его коррекции пробиотиками //Материалы международной научной конференции по пробиотикам и пребиотикам, Словакия, 2011, с. 43.

Соискатель А.Н. Овчарова

Blog

1