Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных рнк-содержащими вирусами 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология

Вид материала

Автореферат

Содержание Сомова Лариса Михайловна Анисимов Алим Петрович Общая характеристика работы Цель работы Задачи исследования Научная новизна Теоретическое значение Практическое значение Материалы диссертации были использованы при подготовке Апробация работы. Объем и структура работы. Собственные исследования Bunyaviridae, Hantavirus Условия эксперимента. Цитологические исследования Результаты исследования и их обсуждение Цитохимические изменения макрофагов Энтеровирус ЕСНО11 и полиовирус Энтеровирус ЕСНО11 ВКЭ – зернистая дистрофия цитоплазмы, образование виропластов и специфических псевдоподий Энтеровирусы ... Полное содержание

Подобный материал:

• Морфофункциональная характеристика пульпы зуба и оценка иммунного статуса при кариесе,, 552.48kb.
• Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки кишечника потомства самок крыс, 303.36kb.
• Овчарова Анастасия Никитовна Морфологическая характеристика тонкой и толстой кишки, 377.67kb.
• Структурно-функциональная характеристика нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной, 343.48kb.
• Закономерности дегенерации и адаптации сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях,, 745.16kb.
• Влияние биологически активных клеточных компонентов растений на структурные изменения, 324.85kb.
• Экспериментальное обоснование применения нейропептидов в комплексной терапии острого, 259.86kb.
• Цитологические особенности вторичных миелодисплазий при лимфомах 03. 00. 25 гистология,, 526.98kb.
• Эколого-морфологическая характеристика репродуктивной активности рыжей полёвки (clethrionomys, 243.57kb.
• Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе 14. 00. 16 патологическая, 606.37kb.

На правах рукописи


ПЛЕХОВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА


УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ И ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА МАКРОФАГОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ РНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ


03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Владивосток – 2008 г

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН


Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Сомова Лариса Михайловна


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Максимович Александр Александрович

доктор биологических наук, профессор

Анисимов Алим Петрович

доктор медицинских наук

Шаркова Валентина Александровна


Ведущая организация: ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»


Защита диссертации состоится «_27_» _марта_____ 2009 г. в «_10_» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете, 690002, г. Владивосток, Острякова, 2.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» (корпус 3).


Автореферат разослан «_______» ___________ 2008 года


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Г.В. Рева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Характерной чертой современной вирусологии является развитие молекулярно-генетических исследований структуры и патогенности вирусов. Вместе с тем, что теоретическое и практическое значение таких исследований не вызывает сомнений, изучение сложного процесса взаимодействия вируса и клетки с позиций морфологии остается не менее актуальным. Так, если в 50-80-х гг. прошлого столетия имелись многочисленные публикации российских и зарубежных ученых, посвященные исследованиям морфологической структуры как вирусов, так и зараженных ими клеток, то на данный момент последняя российская монография, посвященная вопросам вирусной цитопатологии, была опубликована в 1986 г (Букринская, 1986). Начиная с 2000 годов, в зарубежной литературе появились сообщения о необходимости возобновления ультраструктурных исследований в клеточной биологии, интерес к которым был снижен в конце прошлого столетия по разным причинам, в частности: ограниченности методологических подходов, перенаправленности исследований в сторону молекулярно-генетических методов, а также малочисленности специалистов-морфологов, способных дать точную интерпретацию данных (Kopecky, 1991; Afzelius, 2004; Griffiths, 2004). Последняя причина особенно характерна для России, так как на настоящий момент в области медицинской вирусологии практически не существует школы морфологов.

Известно, что в результате взаимодействия клетки и вируса возникает сложный комплекс морфологических и цитофизиологических изменений, которые специфичны только для данного типа взаимоотношений и не встречаются при других патологических состояниях клеток (Альштейн, 1982). Детальное ультраструктурное исследование взаимоотношений «вирус-клетка» позволяет решать как общебиологические проблемы (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эндо- и экзоцитоза и другие), так и медицинские, связанные с пониманием механизмов развития патологического процесса в макроорганизме. Не менее важно, параллельно ультраструктурному, проводить исследование функциональной и ферментативной активности инфицированных вирусом клеток, так как при синтезе нуклеиновых кислот и белковых компонентов вирусов могут использоваться ферментные системы самой клетки без их модификации, либо индуцируется синтез новых, не свойственных ей ферментов. Одномоментно, активность собственных клеточных энзимов резко угнетается. Таким образом, применение высокочувствительных методов определения ферментативной активности зараженных вирусом клеток является важным способом индикации вирусной репродукции, дифференцировки цитопатогенного действия вирусов, а также характера и формы инфекционного процесса в клетках (Greenberg, 2002). Несмотря на важность подобной информации, в литературе последних лет такие работы встречаются редко.

При защите организма от инфекционного агента клетки моноцитарной линии функционируют в качестве одного из основных компонентов его резистентности к возбудителю. Данные клетки в силу доступности методов их выделения, фракционирования и культивирования из периферической крови и перитонеального экссудата служат прекрасной моделью для изучения ряда общих цитофизиологических закономерностей. Клетки моноцитарной линии филогенетически относятся к самой древней системе защиты организма и являются эффекторами и модуляторами различных инфекционных процессов. На поверхности плазматической мембраны макрофагов выявлены многочисленные рецепторы, принимающие участие в процессах адгезии, эндо- и фагоцитоза, межклеточных взаимодействий, восприятия регуляторных воздействий, причем часть из них относится к рецепторам, присутствующим на всех стадиях созревания этих клеток от моноцитов до макрофагов (Купер, 1980; Cooper, 2002; Helmy, 2006). Несмотря на то, что с помощью специфических сывороток, включая моноклональные антитела, на мембране этих клеток выявлены различные категории антигенов, фагоциты различных видов млекопитающих связаны единством происхождения, общностью основных функций и сходством структур и метаболических процессов, обеспечивающих реализацию их функций. Используя в качестве модельной системы макрофаги перитонеального экссудата мышей без применения каких-либо индукторов воспаления и достигнув функциональной однородности клеточной популяции путем их культивирования, результаты исследований взаимодействия этих клеток с инфектами можно экстраполировать в целом на клетки моноцитарного происхождения класса млекопитающих. Данная популяция клеток соответствует резидентным макрофагов, а при воздействии инфекта они определяются как активированные.

Известно, что в процессе адгезии различных типов вирусов участвуют интегрины (гликопротеины, состоящие из различных комбинаций - и –цепей), которые также присутствуют на мембране макрофагов (Hynes, 1992, Roivainen, 1994, Гавриловская, 1999). На настоящий момент различными исследователями доказано участие клеток моноцитарного происхождения в развитии защитного ответа организма при вирусном инфицировании. В основном, в подобных исследованиях очерчивается функциональная характеристика этих клеток, связанная с их способностью к синтезу различных цитокинов (Morahan et al., 1985; Mogensen, 1988; Wu and Morahan, 1992, Marcotic, 1996). Так, противовирусная активность моноцитов/макрофагов подразделяется на прямую и опосредованную (Baskin et al., 1997). Первая определяется внутриклеточной способностью макрофагов нарушать вирусную репликацию либо ей способствовать, а вторая обусловливается внеклеточной активностью макрофага влиять на вирус. Что же касается непосредственного взаимодействия вирусов с макрофагами, то существует мнение, что их участие в развитии вирусных болезней ограничено свойствами «профессионального» фагоцита, способного только к фагоцитозу зараженных вирусом клеток-мишеней и их фрагментов (Семенов, 1982; Смородинцев, 1975, 1983). Известны единичные работы, в которых с позиции вирусной цитопатологии частично описаны морфологические внутриклеточные изменения макрофагов после их заражения вирусами: гриппа (Скрипченко и др., 1997), Денге (Mosquera, 2005) и вируса иммунодефицита человека (Pelchen-Matthews, 2003). Однако оценка цитохимического состояния макрофагов не приводилась. Тем не менее, немаловажны сообщения, что при размножении, в частности, вируса иммунодефицита человека в макрофагах, при невыявляемом цитопатическом действии определяется снижение бактерицидного потенциала и синтезирующей активности клеток. Это, в последующем, может выражаться в реализации потенциала макрофагов как инициаторов иммунного ответа организма (Schrier, 1993).

На настоящий момент, при исследовании патогенеза вирусных инфекций, к важному и нерешенному вопросу относится определение в начальный период заболевания места кодирования главных детерминант вирусов. Это включает: 1) выявление типа клеток, поддерживающих первый этап размножения вируса при естественной инфекции; 2) обнаружение локализации рецепторов, используемых вирусами при адгезии на поверхность клеток; 3) выявление механизма тропизма вирусов к тканям, где они также могут размножаться. В этой связи весьма актуальными являются исследования, связанные со значением клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Для комплексной оценки процесса взаимодействия вируса и макрофага в качестве инфекционных агентов мы использовали вирусы, принадлежащие к трем семействам: Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae. Несмотря на то, что все эти вирусы являются РНК-содержащими, мы руководствовались их структурными различиями. Так, Picornaviridae относятся к вирусам без наличия суперкапсида, тогда как вирусы остальных двух семейств имеют липопротеиновый суперкапсид. Нами также взято во внимание, что Hantavirus, сем. Bunyaviridae, отличается структурой нуклеокапсида – спиральной и отрицательной нитью РНК, тогда как вирусы семейств Picornaviridae и Flaviviridae – икосаэдральной и положительными нитями РНК. Эти признаки могут определять специфичность взаимодействия данных вирусов с макрофагами.

Цель работы: дать комплексную ультраструктурную и цитохимическую характеристику резидентных макрофагов в процессе взаимодействия с РНК-содержащими вирусами, патогенными для человека. Установить механизмы развития цитофизиологических изменений, специфичных для макрофагов, инфицированных различными видами РНК-содержащих вирусов.

Задачи исследования:

1. С помощью вирусологических методов (ПЦР, нМФА, ИФА и метод титрования на клеточных культурах) определить адсорбцию и возможную репликацию РНК-содержащих вирусов (вирус клещевого энцефалита, хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae) в первичной культуре макрофагов.
   
2. С помощью электронной микроскопии исследовать механизмы проникновения и выхода РНК-содержащих вирусов в резидентных макрофагах.
   
3. Выявить локализацию центров репродукции РНК-содержащих вирусов в макрофагах.
   
4. Изучить ультраструктурные изменения инфицированных РНК-содержащими вирусами макрофагов и выявить вирусспецифические структуры в этих клетках.
   
5. Исследовать активность эктоферментов плазмалеммы и цитоплазматических ферментов резидентных макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами.
   
6. Изучить нитроксидобразующую активность макрофагов, зараженных указанными вирусами. Провести сравнительный анализ ультраструктурных и цитохимических изменений макрофагов, зараженных различными видами вирусов.
   

Научная новизна:

• С помощью морфологических и вирусологических методов установлена способность РНК-содержащих вирусов (энтеровирусов, вируса клещевого энцефалита и вируса Хантаан) к адсорбции и репродукции в макрофагах.
  
• Раскрыты этапы входа и выхода РНК-содержащих вирусов в макрофагах в связи со структурными особенностями их видов. Вирусы с наличием суперкапсида (ВКЭ, хантавирус) входят в макрофаги путем локального лизиса плазмалеммы, тогда как вирусы без липопротеиновой оболочки (полиовирус, энтеровирусы ECHO11, Коксаки В1, 71) используют различные способы (локальный лизис плазмалеммы, кавеолы, эндосомы) проникновения в фагоциты. Выход хантавируса и ВКЭ, в отношении которых была установлена репродукция в макрофагах, осуществлялся подобно входу, тогда как для энтеровируса ECHO 11 выявлено два способа – путем локального лизиса мембраны и клазматоза.
  
• Дана ультраструктурная характеристика центров репродукции РНК-содержащих вирусов и их компонентов в инфицированных макрофагах.
  
• На основании электронномикроскопического исследования классифицирована морфология вирусспецифических и вирусиндуцированных структур в макрофагах при репродукции в них РНК-содержащих вирусов.
  
• На основании комплексного исследования ферментативной активности зараженных макрофагов выявлены метаболические изменения в процессе репродукции в них вирусов. Определены типы цитопатогенного действия указанных вирусов на макрофаги, а также формы вирусной инфекции этих клеток.
  
• Определены цитофизиологические критерии специфичности противовирусной защиты макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами.
  

Теоретическое значение

В работе раскрыты клеточные и молекулярные основы взаимодействия макрофагов с вирусными агентами, охарактеризована роль этих клеток в качестве как эффекторов фагоцитоза, так и триггера вирусной инфекции.

Полученные сравнительные данные о способах входа в макрофаги РНК-содержащих вирусов с наличием суперкапсида и без него расширяет общетеоретические представления о механизмах проникновения вирусов в клетки.

Установленные закономерности изменений структуры и функций макрофагов в процессе их взаимодействия с РНК-содержащими вирусами позволили выявить особенности защитной реакции этих клеток при вирусной инфекции. Эти новые данные имеют значение для понимания общебиологических процессов (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эндо- и эктоцитоза и других), а также для выявления патологических изменений эукариотических клеток, что позволит подойти к обоснованию подходов к контролируемой коррекции клеточных процессов.

В целом, полученные в работе комплексные данные о морфофункциональном состоянии макрофагов, зараженных вирусами семейств Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae, вносят вклад в проблему вирусной цитопатологии, а также способствуют углублению знаний о патогенезе вирусных инфекций.

Практическое значение

Решение актуальной проблемы взаимоотношений макрофагов с РНК-содержащими вирусами с помощью современных методов иммуноэлектронной микроскопии позволяет выявить критерии для ультраструктурной идентификации вызываемых ими вирусных заболеваний. Подобные исследования смогут обеспечить понимание не только процесса инфицирования и стратегии вирусного заражения клетки, но и дать возможность воздействия на этот процесс с целью определения терапевтических подходов для лечения вызываемых ими заболеваний.

Тестирование ферментативной активности макрофагов может быть использовано для исследования эффективности биологически-активных веществ при вирусной патологии, направленной как в отношении вирусов (влияя на их репродукцию), так и в отношении макрофагов (стимулируя их противовирусную защиту).

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

• методических рекомендаций «Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Авторы: Л.М. Сомова, Н.Г. Плехова, Н.М. Кон драшева, Т.С. Запорожец). Утверждены Департаментом здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток.- 2005.
  

• патента РФ «Способ определения биологической активности вещества (варианты)» (Патент 2270251 РФ от 10.09.2003) Авторы: Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. – 2003109097/12; Заявл. 10.07.03. Опубл. 10.07.03., Бюлл. № 5.- 7 с.).
  
• патента РФ «Способ оценки состояния иммунитета» (Патент РФ от 02.04.2007) Авторы: Н.Г. Плехова, Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.М. Кондрашова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. рег. № 2007111666/15(012676).
  
• п
  8
  атента РФ «Способ оценки влияния фармакологических препаратов на местные факторы защиты организма на примере бронхолегочных заболеваний» (Патент РФ 2337620 от 09.01.2007). Авторы: Л.М. Сомова, Д.В. Заворуева, Н.Г. Плехова, Н.М. Кондрашова, Б.И. Гельцер. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. – 2007100308/14. Заявл. 09.01.07. Опубл. 10.11.08, Бюлл. № 31.
  

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Резидентные макрофаги являются клетками-мишенями при инфицировании РНК-содержащими вирусами, имеющими липопротеиновый суперкапсид (вирус клещевого энцефалита и хантавирус), а также энтеровирусами ECHO11, неимеющими его.
   
2. Характерным свойством группы вирусов, имеющих липопротеиновый суперкапсид, является их способность осуществлять вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней, тем самым не оказывая выраженного цитопатогенного эффекта на макрофаги, тогда как вирусы без липопротеновой оболочки обладают подобным воздействием на эти клетки.
   
3. Тип инфицирования макрофагов РНК-содержащими вирусами является автономным, так как активация их генома происходит в цитоплазме, независимо от клеточного. При репродукции указанных вирусов в резидентных макрофагах выявляется острая, литическая инфекция, причем при заражении фагоцитов вирусами с наличием суперкапсида и энтеровирусом ECHO 11 установлена продуктивная инфекция, а в случае заражения энтеровирусами Коксаки В1 и 71 – абортивная.
   
4. В цитоплазме макрофагов, инфицированных Хантавирусом, имеющим в составе своего генома РНК отрицательной полярности, формируются вирусиндуцированные структуры, морфологически отличающихся от структур, образующихся в результате репродукции вирусов с РНК положительной полярности (вирус клещевого энцефалита, энтеровирусы).
   
5. Одним из механизмов воздействия РНК-содержащих вирусов на макрофаги является стимуляция кислородзависимой и нитроксидобразующей активности клеток. К специфическим механизмам воздействия на фагоциты группы вирусов с наличием суперкапсида (ВКЭ, хантавирус) относится их способность активировать фермент – кислую фосфатазу, участвующую в процессе расщепления макромолекул их оболочки, тогда как группа вирусов без суперкапсида (полиовирус и энтеровирусы ECHO11, Коксаки В1 и 71) стимулирует неспецифическую эстеразу – фермент отвечающий за иммунологическую стимуляцию макрофагов.
   

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены на: научно-практической конференции “Инфекционная патология в Приморском крае” (Владивосток, 1994); научно-практической конференции “Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере” (Новосибирск, 1996); региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998); Всероссийской научно-практической конференции “Актуальные вопросы инфекционной патологии“ (Ростов-на-Дону, 1999); III научно-практической конференции “Инфекционная патология на Дальнем Востоке” (Новосибирск, 1999); XIX и XXII Российских конференциях по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000, 2008); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург 2003); научно-практической конференции «Хантавирусы и хантавирусные инфекции (к 70-летию изучения ГЛПС на Дальнем Востоке России)» (Владивосток, 2003); 13-м, 14-м конгрессах европейских микроскопистов (Бельгия, 2004; Германия, 2008); 8-м Азиатско-Тихоокеанской конференции по электронной микроскопии (Япония, Каназава, 2004); 16-м международном конгрессе по микроскопии (Япония, Саппоро, 2006); юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Владивосток, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007); III научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); 16-м международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология» (Владивосток, 2008); IV съезде Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 44 научных работах, в том числе: 8 – в международной печати, 16 – в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 1 методических рекомендациях и 3 патентах на изобретение.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 330 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 514 источников, - из них 63 отечественных, 451-зарубежных. Работа иллюстрирована 1 схемой, 69 рисунками и 2 таблицами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГУ Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.


СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Эксперименты на модели in vitro проводились на первичной культуре макрофагов, полученной от 350 беспородных половозрелых белых мышей-самцов массой 18-25 гр. по методу Simonet (1992) в нашей модификации (Plekhova et al., 2003). Животные были получены из питомника РАМН "Столбовая" и находились на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции.

В качестве инфекционных агентов использовались следующие виды вирусов: семейства Bunyaviridae, Hantavirus (хантавирус); семейства Flaviviridae, Tick-Borne Encephalitis Virus (вирус клещевого энцефалита, ВКЭ); семейства Picornaviridae, вирус полиомиелита, энтеровирусы 71, ECHO 11 и Коксаки В1. В экспериментах использовали супернатантную культуральную жидкость перевиваемых линий клеток, содержащую вирус в количестве 2 единицы титра цитопатогенного действия на 50% клеточных культур в 0,2 мл, что составляло около 0,5 инфекционных единиц на 1 макрофаг, исходя из посадочной концентрации клеток и количества титра вируса, используемого для заражения.

Условия эксперимента. Время контакта первичной культуры макрофагов с вируссодержащей жидкостью составило от 15 (с хантавирусом) до 60 мин, после чего монослой клеток дважды промывали средой 199 для удаления внеклеточных вирусных частиц, и продолжали инкубацию в течение 90 мин, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 18, 24, 48 и 72 ч. Эксперименты повторяли трижды.

Оценку динамики накопления вирусного антигена в клетках проводили с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА). Для выявления специфических антигенов в макрофагах применяли гомологичную иммуно-асцитическую жидкость к вирусам (ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва; ГУ НИИЭМ СО РАМН, г. Владивосток) и диагностическую флюоресцирующую сыворотку против иммуноглобулинов G мыши (ICN, USA), по стандартной методике (Кармышева, 1979). Детекцию вирусной РНК в макрофагах осуществляли с помощью ПЦР метода с использованием тест-системы «Амплисенс Энтеровирусы» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ, г. Москва). Измерение концентрации РНК энтеровирусов проводили с применением метода ли митирующих разведений с вышеуказанной тест-системой. Для количественной идентификации антигенов вирусов в макрофагах использовали иммуноферментную тест-систему (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ, г. Минск). Выявление комплекса антиген-антитело в клеточных образцах проводилось с помощью иммуноферментного антивидового коньюгата, который окрашивается при добавлении субстрат-индикаторного раствора в коричневый цвет различной интенсивности. Учет реакции осуществляли на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.", Финляндия) при длине волны 492 нм.

Определение инфекционного титра вирусов проводили по цитопатогенному действию ВКЭ и вируса Коксаки В1 на перевиваемую культуру клеток эпителия почек эмбриона свиньи (СПЭВ), хантавируса – на Vero, полиовируса, энтеровируса 71 и ECHO 11 – на культуру клеток RD. Бактерицидную активность макрофагов, предварительно зараженных вирусами, определяли по методу P. Garlinski et al. (1987). Данные выражали в виде индекса переваривания тест-бактерий.

Оценка ферментативной активности макрофагов проводилась в динамике.

а) Спектрофотометрические исследования

• НСТ-тест (тест с нитросиним тетразолием) по методу, модифицированному А.А. Бутаковым (1991).
  
• Содержание метаболитов NO - нитритов (NO^-₂) проводили с использованием Griess реактива (Schulz et al., 1999).
  
• Активность аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы) и 5’-нуклеотидазы определяли по методу Г.Б Кириличевой и соавт. (1988) в собственной модификации. В качестве субстратов использовали adenosine-5’-triphosphate и adenosine-5’-mono phosphate (производства ICN) соответственно.
  
• Активность цитохромоксидазы (ЦХО) определяли по методу A.B. Novikoff и соавт. (1969) в собственной модификации, используя в качестве субстрата 3,3 ^*- diaminobenzidine.
  
• Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определяли по методу З. Лойда (1965) в собственной модификации. В качестве субстратов взяты 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide и iodonitrotetrazolium violet (ICN) соответственно.
  
• Активность кислой фосфатазы (КФ) проводили по методике, модифицированной А.А. Бутаковым (1991), с добавлением паранитрофенилфосфата (ICN).
  
• Активность неспецифической эстеразы (НЭ) проводили по методу Хейхоу и Кваглино (Хейхоу, 1983) в собственной модификации. В качестве субстратов использован нафтил AS ацетат и синий прочного ВВ.
  

В качестве контроля использовали образцы с добавлением ингибитора реакции – NaF (ICN, 1,5 мг/мл).

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No - N_k)/ N_k х 100; где N_k – средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных макрофагах; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных макрофагах.

Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) в фагоцитах использовали субстрат на основе 0,05 М кальций фосфатного буфера (рН 7,8), включавшего 0,05 М Na2CO3, 0,25 мМ ксантина, 0,2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,025 мМ нитросинего тетразолия и 0,025 ед. ксантиноксидазы («ICN», Бельгия). Оптическую плотность раствора в отсутствии суспензии разрушенных клеток принимали за 100%, активность СОД выражали в единице, равной количеству фермента, подавляющего активность ксантиноксидазы на 50 %.

б) Цитохимические исследования

• Активность кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы выявляли по методу Хейхоу и Кваглино (1983).
  
• Активность НАДФН-диафоразы (аналога NO-синтазы) выявляли по методу Hope, Vincent (1989).
  
• активность индуцибельной NO – синтазы (iNOS) в макрофагах проводили методом иммуномечения (Webb et al., 2001). В качестве первичных антител использовали кроличью поликлональную сыворотку к iNOS (SIGMA; 1:400), в качестве вторичных – диагностическую флюоресцирующую сыворотку против иммуноглобулинов G мыши (ICN).
  

Цитологические исследования проводили с помощью световой микроскопии монослоя макрофагов, окрашенных по Нохт-Максимову.

Электронномикроскопические исследования

Для выявления морфологических изменений структуры плазматической мембраны макрофагов в процессе проникновения в них вирусов использовали комплексный фиксатор, предложенный Ито с соавт. (1975). Помимо этого, для определения зоны гликокаликса наружной мембраны макрофагов мы применили цитохимический метод, в основе которого лежат анионные свойства кислых остатков полисахаридов гликокаликса, при взаимодействии с которыми способен избирательно присоединяться краситель – рутениевый красный (Marechal et al., 2001). Для дофиксации использовали 1% раствор OsO₄ (Serva), дегидратацию проводили в этаноле с возрастающей концентрацией, и образцы заключали в эпон-аралдит (Serva) с использованием метода плоскопараллельной заливки. Образцы контрастировали цитратом свинца по стандартной методике (Уикли, 1975) и исследовали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония). Параллельно просматрива лись препараты, приготовленные с помощью классических электронномикроскопических методов обработки.

Ультраструктурное исследование активности NO-диафоразы (аналога NO синтазы) клеток проводили с помощью цитохимического метода, путем инкубации образцов в фиксаторе по Ито при 37 ⁰С в течение 90 мин, включающем тетразолиевую соль – 2-[2'-бензотилазолил]-5-стирил-3-[4'-фталгидрозидил] тетразолия хлорид (Sigma, БСПТ), являющуюся субстратом для НАДФ диафоразы (Faber-Zuschratter, 1994). В результате этой реакции образуется осмиофильный формазан. Помимо БСПТ субстратный раствор включал 10 мг НАДФ (Sigma). Контрольные образцы инкубировали без НАДФ. После дофиксации образцов в 1% растворе OsO₄ и заключения в эпон-аралдит с использованием плоскопараллельной заливки, ультратонкие срезы, полученные в плоскости, параллельной монослою клеток, контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония).

Полученные результаты обрабатывали с помощью приложения Microsoft Excel с определением средней арифметической (М), ее ошибки (±m), достоверности различий (р), а также были использованы методы корреляционного и регрессионного анализов и применены известные графические приемы выражения статистических данных (Мисюк, 1975).