Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика 03. 02. 03 Микробиология

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Halomonas taeanensis Thalassospira permensis 4.2. Двухкомпонентная бактериальная ассоциация, осуществляющая полную деструкцию 2,4’-дихлорбифенила Arthrobacter, Janibacter

Подобный материал:

• Рабочей программы учебной дисциплины (модуля) микробиология, 48.16kb.
• Твердофазная люминесценция полициклических ароматических углеводородов в условиях адсорбционного, 262.95kb.
• Задание егэ по теме «Углеводороды» а задания, 45.66kb.
• «Взаимосвязь предельных, непредельных и ароматических углеводородов», 11.54kb.
• Свистунова наталья Юрьевна биологические особенности лекарственных и ароматических, 416.08kb.
• Вопросы для подготовки к зачету по дисциплине: «Эксплуатационные материалы», 51.34kb.
• Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой, 331.98kb.
• Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов, 1127.13kb.
• Бактерии рода enterococcus в озере байкал: Распределение, видовой состав, механизм, 275.08kb.
• Ароматические углеводороды. Бензол представитель аренов. Строение молекулы и физические, 54.51kb.

Примечание. «+» - рост (колонии размером 1-3 мм); «» – слабый рост (колонии размером менее 1 мм); «» - отсутствие роста бактерий.

*Рост фиксировался по образованию биопленки на агаризованной среде. При росте на полноценной среде в присутствии 240 г/л и 290 г/л NaCl присутствовали только колонии штамма Chromohalobacter sp. SMB17.

Галотолерантные штаммы Arthrobacter sp. SMВ11 и Arthrobacter sp. SMВ145 филогенетически близки (99.7% сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК) к A. сrystallopoietes (см. раздел 1.1). Штаммы росли на нафталине, салицилате и ацетате (интермедиаты деструкции нафталина), а также бензойной и пара-гидроксибензойной кислотах.

Грамположительный штамм SMB14 (=ВКМ Ас-2280^Т =LMG 22207) на основании результатов изучения генотипических, хемотаксономических и морфо-физиологических характеристик был валидно описан как новый вид Brevibacterium permense. Штамм рос на бензойной, парагидроксибензойной кислотах и ацетате как единственном источнике углерода и энергии, а также на полноценной среде Раймонда без NaCl в среде культивирования и при концентрации соли до 120 г/л (табл. 6).

Штамм SMB17 - умеренно галофильная бактерия семейства Halomonadaceae, растет на средах при 30–290 г/л NaCl и не растет в отсутствии соли (табл. 6). Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (около 1470 п.н.) показал, что штамм входит в филогенетический кластер, включающий представителей рода Chromohalobacter, и наиболее близок (более 99% сходства 16S рРНК генов) к C. canadensis ATCC 43984^Т, C. beijerinckii ATCC 19372^Т и C. japonicus CECT 7219^T. Штамм растет на бензойной, парагидроксибензойной кислотах и ацетате.

Ассоциация бактерий SMB3. Изучение влияния солености среды на рост консорциума SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической плотности культуры наблюдаются при 30 г/л NaCl и в отсутствие соли. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 90 г/л приводило к снижению показателей ростовых характеристик. При более высоких концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис. 19). Из исследуемой ассоциации выделено семь штаммов бактерий (табл. 7), отличающиеся между собой и от выделенных ранее из района солеразработок бактерий по фенотипическим и генотипическим характеристикам (REP-, BOX-ПЦР и ARDRA).




Рис. 19. Рост ассоциации SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl (г/л). 1 – без соли, 2 – 30, 3 – 60, 4 – 75, 5   90.


В состав ассоциации входят Rhodococcus sp. SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38 - деструкторы нафталина (см. раздел 1.2.), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (бактерии-спутники) (табл. 7), характеристики которых приводятся ниже.


Штамм Halomonas sp. SMB31, согласно филогенетическому анализу (16S рРНК), наиболее близок к Halomonas taeanensis (уровень сходства 99.8%) и характеризуется фенотипическими признаками, свойственными роду.

Таблица 7. Рост бактерий из ассоциации SMB3 на полноценной и минеральной (с нафталином) средах в присутствии разных концентраций NaCl (г/л)

Штамм	полноценная среда *						минеральная среда с нафталином**
	0	30	80	100	170	300	0	75	90
Halomonas sp. SMB31	–	+++	+++	+++	++	+	–	–	–
Arthrobacter sp. SMB32	+++	+++	+++	+	–	–	–	–	–
Microbacterium sp. SMB33	+++	+++	+++	++	–	–	–	–	–
Thalassospira permensis SMB34	+++	+++	+++	–	–	–	–	–	–
Salinicola socius SMB35	+	+++	+++	+++	++	+	–	–	–
Rhodococcus sp. SMB37	+++	+++	+++	+	–	–	+++	+	–
Rhodococcus sp. SMB38	+++	+++	+++	+	–	–	+++	+++	+

Примечание. * – рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** – рост в жидкой минеральной среде Раймонда с нафталином, «–» – нет роста, «+» – «+++» – активность роста.

Штамм SMB35 образует периферическую ветвь в филогенетическом кластере, включающем роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter. Уровни сходства 16S рРНК гена штамма SMB35 и видов рода Halomonas - в пределах 90.6% - 95.1%. Наиболее высокие величины сходства (95.0-95.1%) обнаружены с тремя видами рода Halomonas – H. pacifica, H. taeanensis и H. ventosae. Штамм SMB35 отличается также от видов Halomonas sensu stricto и близкородственных видов Halomonas, а также от представителей других родов семейства Наlomonadaceae по фенотипическим характеристикам (подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций NaCl, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал, желатину, твин 80, мочевину). На основании вышеперечисленных характеристик, а также отличий по содержанию Г+Ц-пар в ДНК, штамм SMB35 (=ВКМ В 2397^Т =DSM 19940Т) валидно описан в качестве нового рода и вида Salinicola socius в семействе Halomonadaceae.

Штамм SMB34 (сем. Rhodospirillaceae) является аэробом, хемоорганотрофом, клетки - изогнутые палочки, подвижные (один полярный жгутик). Оксидазо- и каталазоположительные. Штамм растет как в отсутствии NaCl, так и при высокой солености среды культивирования (до 80 г/л соли). Филогенетический анализ (16S рРНК) показал, что штамм группируется с представителями рода Thalassospira и имеет наиболее высокий уровень сходства гена 16S рРНК (99.5%) с T. xiamenensis M-5^T. Уровень сходства с типовым штаммом типового вида рода Thalassospira (T. lucentensis QMT2^T) - 96.6%. Состав жирных кислот SMB34 и референтных штаммов оказался близким, преобладали C_18:1ω7, C_16:0 , C_18:0, C_16:1ω7c, C17:0 cyclo. Однако у штамма SMB34 дополнительно выявлены iso-C15:0 и anteiso-C15:0, не обнаруженные у близкородственных видов. Уровень ДНК-ДНК сходства между штаммом SMB34 и типовыми штаммами (T. xiamenensis M-5^T , T. tepidiphila 1-1B^T и T. profundimaris WPO211^T) не превышает 50%. Основываясь на перечисленных выше данных, штамм SMB34 (=ВКМ B 2527^T =NBRC 106175^T) отнесен к новому виду «Thalassospira permensis».

Штаммы SMB32 и SMB33 на основании филогенетического анализа и ряда фенотипических признаков на данном этапе исследований определены как Arthrobacter sp. (группа «A. nicotianae») и Microbacterium sp., соответственно. Штаммы являются компонентами нафталинметаболизирующего консорциума SMB3, способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии интермедиаты деструкции нафталина – салицилат и гентизат.

Галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. SMB37, Rhodococcus sp. SMB38, Arthrobacter sp. SMB32 и Microbacterium sp. SMB33 способны к росту на полноценной среде Раймонда без и в присутствии NaCl до 100 г/л , а «Thalassospira permensis» SMB34 растет при концентрации соли до 80 г/л  в среде культивирования (табл. 7). Умереннно галофильные, согласно классификации Кашнера (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998), штаммы SMB31 и SMB35 (сем. Halomonadaceae) растут на полноценной среде Раймонда при 30 - 300 г/л  NaCl; оптимальный рост – при 30-100 г/л  NaCl в среде культивирования.

Штаммы Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35 при росте в минеральной среде Раймонда с глюкозой в качестве субстрата в условиях высокой осмолярности среды (50, 100 г/л NaCl) внутриклеточно накапливали эктоин и глутамат. В клетках S. socius при росте в присутствии 100 г/л NaCl был дополнительно обнаружен гидроксиэктоин. Полученные результаты о качественном составе осмопротекторов представителей семейства Halomonadaceae согласуются с литературными данными (Calderon et al., 2004; Vargas et al., 2006).

4.1.2. Протокооперация в нафталинметаболизирующем консорциуме бактерий SMB3

Поскольку бактерии-спутники консорциума SMB3 способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (салицилате, гентизате, ацетате), было проведено исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на структуру консорциума, используя метод ДГГЭ и подсчет КОЕ. Установлено, что культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии состав стабильно сохраняется. Наблюдаемое уменьшение биоразнообразия консорциума SMB3 при смене источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими одинаковый субстрат. Полученные результаты доказывают, что в ассоциации присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член сообщества занимает определенную экологическую нишу.

Изучены кинетические параметры роста модельных смешанных культур на нафталине в условиях высокой солености среды. В экспериментах были использованы родококки - деструкторы нафталина SMB37 и SMB38, умеренно галофильный штамм Halomonas sp. SMB31 в следующих вариантах: штаммы SMB37 и SMB31 (I); штаммы SMB38 и SMB31 (II); штаммы SMB37, SMB38 и SMB31 (III). Контроль качественного состава смешанных культур бактерий осуществляли методом ДГГЭ. Результаты электрофореза подтверждают данные, полученные на основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ).

Показано, что умеренно галофильная бактерия Halomonas sp. SMB31 сохраняется в составе смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к эффективному росту (рис. 20 А,Б). При совместном культивировании штаммов-деструкторов с умеренно галофильной культурой Halomonas sp. SMB31 значительно сокращается lag-период и увеличивается удельная скорость роста Rhodococcus sp. SMB38, а также увеличивается количество клеток Rhodococcus sp. SMB37 (рис. 20 В).


I вариант II вариант






III вариант









Рис. 20. Рост модельных ассоциаций и индивидуальных штаммов-деструкторов в среде Раймонда на нафталине в присутствии 70 г/л NaCl. Не заштрихованные маркеры – индивидуальные бактерии, заштрихованные маркеры – штаммы в составе ассоциаций.








Рис. 21. Деструкция 2,4’-дихлорбифенила двухкомпонентной бактериальной ассоциацией: 1 – рост Microbacterium sp. B51; 2 – рост Arthrobacter sp. H5; 3 - Cl^-; 4 - 4ХБК; 5 - Cl^- (без внесения Arthrobacter sp. H5); 6 - 4ХБК (без внесения Arthrobacter sp. H5). Стрелкой указан момент внесения штамма Н5.