Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Вид материала

Подобный материал:

1 2 3 4

Примечание: * – достоверные различия с контролем при уровне значимости р0,01, ** – достоверные различия средних исследуемых показателей ЛПС- и ФГА-индуцированной продукции цитокинов при уровне значимости р0,001.

Эти закономерности свидетельствуют, с одной стороны, о полноценности интегративных механизмов эндогенной системы цитокинов и способности к саморегуляции, а с другой стороны, о высоком активационном потенциале клеток здоровых детей к синтезу и секреции цитокинов.

Патогенетическая неоднородность или стадийность заболевания сочетается с неодинаковыми реакциями в цитокиновой сети, и по-разному от них зависят. Это подтверждается результатами исследования спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокинов ИЛ-1, ИЛ10, ИЛ-8, ИЛ-4 и ИНФ-α у детей с травматической болезнью в различные стадии процесса (табл. 2). Уже в дебюте травматической болезни резко увеличивалась спонтанная продукция как про-, так и противовоспалительных цитокинов, с максимальной концентрацией ИЛ-8. При этом спонтанная продукция ИЛ-1 в остром периоде травмы превосходила таковую у здоровых детей почти в 7 раз, в то же время продукция амбивалентного цитокина ИЛ-10 возрастала – в 15 раз. Нестимулированная выработка ИЛ-8 достоверно увеличивалась в остром периоде травматической болезни по сравнению с нормой в 4,5 раз, в то время

Таблица 2.

Показатели продукции цитокинов in vitro клетками периферической крови здоровых детей и пациентов с травматической болезнью

Показатели продукции цитокинов	Статисти- ческие показатели	Уровень продукции цитокина, пг/мл
Показатели продукции цитокинов	Статисти- ческие показатели	Здоровые дети (n=15)	Острый период (n=15)	Период развер- нутой клиники (n=15)
ИЛ-1 спонт., пг/мл	M±m	57,1±8,2	393,13±10,58*	185,67±7,45*#
ИЛ-1+ЛПС, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	1380,8±23,54 24,18±2,8	612,38±8,51* 1,56±0,02*	554,33±6,56# 2,98±0,03#
ИЛ-1+ФГА, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	226,8±5,61 3,97±0,1	514,13±9,09* 1,31±0,15*	569,33±6,98# 3,06±0,08#
ИЛ-4 спонт., пг/мл	M±m	15,5±1,9	50,25±3,03*	25,33±1,84*#
ИЛ-4+ЛПС, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	39,4±2,45 2,54±0,13	31,13±1,92* 0,62±0,03*	14,39±1,33# 0,57±0,004
ИЛ-4+ФГА, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	22,78±1,45 1,47±0,15	51,13±3,42* 1,02±0,08*	48,00±3,0* 1,89±0,02*#
ИЛ-8 спонт., пг/мл	M±m	337,0±10,1	1503,25±19,35*	867,33±11,36*#
ИЛ-8+ЛПС, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	2143,78±38,2 6,36±0,2	1845,58±14,38* 1,23±0,04*	1909,0±20,93# 2,2±0,01#
ИЛ-8+ФГА, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	1013,45±27,62 3,01±0,01	1846,25±18,13* 1,23±0,1*	1607,67±18,43# 1,85±0,006#
ИЛ-10 спонт., пг/мл	M±m	4,98±0,51	76,25±4,36*	33,67±3,84*#
ИЛ-10+ЛПС, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	197,48±37,92 39,65±1,4	42,63±5,80* 0,55±0,03*	63,0±9,43* 1,87±0,01*#
ИЛ-10+ФГА, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	43,12±4,23 8,66±0,56	280,88±24,47* 3,68±0,2*	144,67±18,64# 4,3±0,003#
ИНФ-α спонт., пг/мл	M±m	53,1±2,56	21,05±1,75*	16,45±0,57*#
ИНФ-α+ЛПС, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	1393,38±25,15 26,24±1,9	15,86±0,39* 0,75±0,01*	16,17±0,41* 0,98±0,001*#
ИНФ-α+ФГА, пг/мл ИС, усл. ед	M±m	3957,92±59,4 73,54±2,9	22,24±2,03* 1,06±0,05*	16,08±0,3# 0,98±0,002

Примечание: * – достоверные различия с нормой при уровне значимости р0,02, # – достоверные различия с острым периодом при уровне значимости р0,05.

как синтез ИЛ-4, который подавляет продукцию хемокина (Ковальчук Л.В., Сайгитов Р.Т., 2000; Фрейдлин И.С. с соавт., 2002), возрастал только в 3 раза, одновременно с этим концентрация ИЛ-8 превосходила концентрацию ИЛ-4 почти в 30 раз.

В период развернутой клиники клетки периферической крови травмированных детей (табл. 2) продолжали активно секретировать весь исследуемый спектр цитокинов даже в режиме спонтанного культивирования. Наиболее высокий уровень продукции демонстрировал ИЛ-10 и оппозитный острофазозый цитокин – ИЛ-1. Выработка ИЛ-8 в 2,6 раза была выше, чем показатели у здоровых детей, а ИЛ-4 лишь в 1,6 раза. Несмотря на относительно высокие параметры базальной продукции тестируемых медиаторов в данный период травматической болезни, нами отмечена относительная стабилизация повышенного уровня цитокинов, проявляющаяся в снижении секреции исследуемых цитокинов в среднем в 2 раза по сравнению с острым периодом, что возможно связано с активацией механизмов ауто- и паракринной регуляции секреции цитокинов (Козлов В.А., 2002).

Об относительности стабилизации и патогенетической незавершенности травматического процесса свидетельствуют и показатели соотношения оппозитных цитокинов (рис. 1). Если соотношение уровня ИЛ-1/ИЛ-10 на фоне их активной продукции не меняется, то соотношение продукции ИЛ-8 к

Примечание: * – достоверные различия с нормой при уровне значимости р0,05

Рисунок 1. Динамика соотношения оппозитных цитокинов в норме и при травматической болезни.

ИЛ-4 прогрессивно растет, что еще больше усугубляет цитокиновый дисбаланс в период развернутой клиники уже развившийся в более раннем посттравматическом периоде. При этом нарушения цитокиновой сети касаются преимущественно ее хемокинового звена, а именно снижение продукции ИЛ-4, как регулятора (ингибитора) избыточной продукции хемокинов, на фоне активной секреции ИЛ-8.

Уровень ИНФ- в раннем посттравматическом периоде достоверно уменьшался почти в 2,5 раза в сравнении с нормой и продолжал прогрессивно падать в период развернутой клинической картины болезни.

Особенности функционирования цитокиновой сети, как в норме, так и при патологических состояниях наиболее ярко проявляются в условиях активации иммунокомпетентных клеток. Нами установлено, что в раннем посттравматическом периоде ЛПС инициировал разнонаправленные эффекты цитокин-продуктивной активности клеток периферической крови. Эндотоксин и ФГА лишь умеренно стимулировали продукцию ИЛ-1. Индекс стимуляции (ИС) был в 15 раз ниже для ЛПС и в 3 раза – для ФГА. Динамика секреции ИЛ-10 в присутствии бактериального митогена была противоположной. Клетки периферической крови травмированных детей отвечали на ЛПС не усилением продукции ИЛ-10, а наоборот, ее угнетением, при этом индекс стимуляции был более чем в 70 раз ниже, чем у здоровых детей. ФГА, напротив, вызывал стимуляцию продукции ИЛ-10. В период развернутой клиники бактериальный митоген реализовывал свой стимулирующий эффект в большей степени, увеличивая секрецию ИЛ-1 в 3 раза и ИЛ-10 в 1,8 раза, что может свидетельствовать о частичном восстановлении регуляторного потенциала цитокиновой системы.

Уровни секреции оппозитных цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-10, как и уровни ИЛ-8 и ИЛ-4, продуцируемых ex vivo, в ответ на стимуляцию эндотоксином и ФГА отличались и в раннем посттравматическом, и в более позднем, периодах болезни. Их профиль не имел такого феноменологического сходства, как у здоровых детей и характеризовался асинхронностью ответа на индуктор.

Таким образом, патологическая активация фагоцитов и других иммуноцитов, проявляющаяся, в частности, в повышенной продукции острофазовых цитокинов – ИЛ-1, ИЛ-8, наиболее выраженной в ранний период посттравматической деструкции, направлена скорее на эффекторное обеспечение повреждающих, нежели репарирующих механизмов иммунного ответа. По нашему мнению, именно высокие уровни продукции цитокинов, в частности, ИЛ-8 определяют развитие мобилизационной блокады фагоцитов, подвижных продуцентов и носителей регуляторов воспаления. Поскольку эти клетки приходят в очаг воспаления или повреждения главным образом из других мест и являются необходимыми элементами процесса, то наряду с вопросами о природе медиаторов, их секреции и механизмах активации, возникает вопрос о том, как изменяется и регулируется их миграционная активность?

Локомоторная функция Нф и Мн исследовалась у 235 детей с переломами костей скелета. Контрольную группу составил 41 здоровый ребенок. В качестве хемоаттрактантов нами были использованы известные регуляторы иммунного воспаления (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-8, ГМ-КСФ, смесь ИНФ-α2(с)α2(d), лейкинферон (естественный цитокиновый комплекс), А5-пептидосодержащее вещество, выделенное из супернатантов активированных нейтрофилов). Контролем служил стандартный хемоаттрактант – С5а-фрагмент комплемента.

Установлено, что изучаемые регуляторы иммунного воспаления обладают выраженными хемокинетикотропными свойствами как по отношению к нейтрофилам, так и к моноцитам здоровых детей (рис. 2).

После травмы происходит снижение целенаправленного движения нейтрофилов и моноцитов ко всем изучаемым хемоаттрактантам (рис. 2). Такая «функциональная рефрактерность» к хемоаттрактантам развивается после контакта с раздражителем и носит системный характер, не связанный с локализацией очага воспаления. В её основе лежит сокращение числа рецепторов, доступных для взаимодействия с новыми порциями лиганда. Негативный эффект потенцируется, если за связыванием следует эндоцитоз, ведущий к структурной изоляции рецептора (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993).

Индекс хемотаксиса нейтрофилов, усл. ед.

Индекс хемотаксис моноцитов, усл. ед.

Рисунок 2. Хемотаксис фагоцитов периферической крови здоровых детей (n=41) и пациентов с ТБ (n=109) в острый период к биологически активным веществам различной природы.

Спонтанная миграция нейтрофилов

Хемокинез нейтрофилов

Примечание * – достоверность различий с нормой при р0,01.

Рисунок 3. Спонтанная миграция и хемокинез нейтрофилов периферической крови здоровых детей (n=41) и пациентов с ТБ (n=211) под действием биологически активных веществ различной природы.

Сравнение результатов исследования влияния регуляторов цитокиновой сети на хемокинетическую функцию фагоцитов здоровых и травмированных детей, показало, что характер изменений хемокинеза Нф и Мн, наблюдаемый после травмы и у здоровых детей, индуцируемых исследуемымицитокинами, почти полностью совпадает (рис. 3). По сути дела при непосредственном воздействии данными веществами на фагоциты здоровых детей in vitro мы фактически моделировали состояние этих клеток, схожее с тем, которое развивается после тканевой деструкции.

Далее предстояло выяснить, насколько изменения локомоторной функции Нф и Мн у детей с травматической болезнью играют отрицательную роль в плане развития гнойно-воспалительных осложнении. Для этого нами были обследованы 27 детей, у которых в посттравматическом периоде развились гнойно-воспалительные осложнения.

Осложненное течение травматической болезни характеризовалось еще более выраженным угнетением целенаправленной подвижности фагоцитов уже в остром периоде. Почти ко всем изучаемым регуляторным факторам отмечалось снижение направленной миграции как Нф, так и Мн. При этом Нф становились наиболее рефрактерны к ИЛ-1 и еще менее чувствительны к ИЛ-8 и ГМ-КСФ. Повышением чувствительности Нф отвечали только на смесь ИНФ α2(с)α2(d).

Таким образом, развитие гнойно-воспалительных осложнений у травмированных детей сопровождается еще более выраженным угнетением как хемокинетической, так и хемотаксической функции фагоцитов. Запоздалая миграция фагоцитов в очаг тканевой деструкции не позволяет данным клеткам эффективно реализовать элиминационный потенциал, а также участвовать в процессах репаративной регенерации костной ткани.

Далее необходимо было выяснить, как изменяется соотношение процессов формирования и резорбции костной ткани в условиях мобилизационной блокады нейтрофилов и моноцитов.

Индикаторами костного метаболизма являются маркеры костного ремоделирования – продукты костного матрикса и клеток кости.

Нами были исследованы три маркера метаболизма костной ткани кальцитонин (специфический гормональный ингибитор паратгормона), остеокальцин (костный глутаминовый белок – BGP – биохимический маркер формирования кости, характеризующий функцию остеобластов) и С-телопептиды коллагена I типа (CrossLaps) (маркер костной резорбции, характеризующий функцию остеокластов).

Содержание сывороточного кальцитонина у здоровых детей, составило 2,13±0,03 пг/мл. В раннем посттравматическом периоде отмечалась лишь тенденция к его повышению в сыворотке (3,06±0,18 пг/мл) в пределах возрастной нормы (рис. 4). В катаболическую фазу второго периода нами было зафиксировано достоверное повышение сывороточной концентрации кальцитонина более чем в 35 раз в сравнении со здоровыми детьми.

Примечание * – достоверность различий с нормой при р0,001.

Рисунок 4. Уровень кальцитонина в сыворотке крови здоровых детей (n=15) и пациентов с травматической болезнью в острый период (n=15) и катаболическую фазу (n=15) периода развернутой клинической картины.

У здоровых детей содержание остеокальцина составило 95,97±4,87 пг/мл, а С-телопептидов коллагена I типа (CrossLaps) – 0,59±0,01 нг/мл (рис. 5). При травматическом повреждении костной ткани в острый период уровень остеокальцина колебался в пределах возрастной нормы. В то время как концентрация маркера остеогенной деструкции достоверно увеличивалась почти в 2,5 раза, что свидетельствует об усилении в первые часы после травмы только резорбтивных процессов.

Уровень остекальцина

Уровень CrossLaps

Примечание * – достоверность различий с нормой при р0,01.

Рисунок 5. Уровни остеокальцина и С-телопептидов коллагена I типа (CrossLaps) в сыворотке крови здоровых детей (n=15) и пациентов с травматической болезнью в острый период (n=15) и катаболическую фазу (n=15) периода развернутой клинической картины.

Концентрация остеокальцина сыворотки крови в катаболическую фазу снижалась как по отношению к норме более чем в 3 раза и в сравнении с острым периодом – на 60%. Концентрация же маркера остеогенной резорбции продолжала увеличиваться и в катаболическую стадию процесса.

Итак, механическое повреждение костной ткани уже в первые часы после травмы индуцирует резорбтивные процессы, приводя к дисбалансу остеогенеза и резорбции, интенсивность которой коррелирует со степенью нарушения локомоторной активности фагоцитов.

Учитывая, что риск перехода «физиологического» воспаления в инфекционный процесс во многом будет зависеть от функционального кинетического резерва фагоцитов важно было установить насколько эти клетки способны в условиях посттравматического воспаления отвечать на дополнительную хемотаксическую нагрузку бактериями и их дериватами.

С этой целью мы исследовали локомоторную функцию Нф у 134 детей с неосложненной и у 27 пациентов с осложненной механической травмой скелета. Контрольную группу составил 41 здоровый ребенок. В качестве хемоаттрактантов использовали вещества как бактериального, так и небактериального происхождения. Живые суточные бактериальные культуры Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, а также супернатанты нейтрофилов, полученные после инкубации с данными микроорганизмами (САН).

Изучаемые суточные культуры живых бактерий обладали выраженной хемотаксической активностью. Индекс хемотаксиса нейтрофилов здоровых детей к бактериям достоверно превышал уровень их спонтанного радиального движения. Аналогичные изменения хемотаксиса нейтрофилов здоровых детей нами зарегистрированы и к САН (рис. 6).

Хемотаксис нейтрофилов к живым суточным культурам бактерий

Хемотаксис нейтрофилов к супернатантам нейтрофилов доноров, активированных живыми бактериями

Примечание * – достоверность различий с контролем при р0,01.

Рисунок 6. Хемотаксиса нейтрофилов здоровых детей (n=41) к живым суточным культурам бактерий и к супернатантам нейтрофилов доноров, полученных после инкубации с различными видами живых суточных культур бактерий.

После часовой инкубации нейтрофилов с живыми бактериями они утрачивали двигательную активность к бактериям того вида, которые они фагоцитировали, но при этом сохраняли способность целенаправленного движения в сторону других микроорганизмов (рис. 7). Напротив, САН, полученные при активации бактериями, вызывали выраженный положительный хемотаксис интактных нейтрофилов.

Хемотаксис нейтрофилов здоровых детей, инкубированных со St. aureus	Хемотаксис нейтрофилов здоровых детей, инкубированных со E. coli
Хемотаксис нейтрофилов здоровых детей, инкубированных с Pr. vulgaris	Хемотаксис нейтрофилов здоровых детей, инкубированных с Ps. aeruginosa

Примечание * – достоверность различий с контролем при р0,01.

Рисунок 7. Индекс хемотаксиса нейтрофилов периферической крови здоровых детей (n=41), инкубированных с различными видами бактерий, к живым суточным культурам бактерий.

Наблюдаемые нами эффекты действия секреторных продуктов нейтрофилов на хемотаксическую реакцию донорских клеток, свидетельствуют с одной стороны, о том, что «запредельная бактериальная инвитровая нагрузка» приводит к блокаде рецепторов и развитию двигательного «паралича» именно к конкретному возбудителю – бактерии, а с другой – к секреции продуктов с кинетикотропной активностью именно к тому «микробу-контактеру».

В процессе фагоцитоза бактерий происходит изменение хемотаксической активности нейтрофилов не только здоровых детей, но и пациентов с травматической болезнью, в том числе при развитии гнойно-воспалительных осложнений. При этом характер хемотаксической реакции клеток и к живым бактериям, и к САН, полученным при стимуляции бактериями, является однотипным.

САН с кинетикотропным действием являются элементом саногенеза в патогенезе травматической болезни. Они, усиливая избирательно локомоторную функцию фагоцитов в отношении этиологического фактора, вызвавшего гнойно-воспалительный процесс, эффективно противостоят антифагоцитарному эффекту бактерий. Именно поэтому, течение травматической болезни, как правило, благоприятное (по нашим данным в 88,08% случаев). Тем не менее, у части пациентов (12% случаев) гнойно-воспалительные осложнения все же развиваются. Одной из вероятных причин, по нашим данным, является подавление способности фагоцитов к продукции как неспецифических (цитокины), так и специфических (секреторные продукты нейтрофилов) регуляторов воспаления под действием дополнительных индукторов (бактерий и их дериватов). Неспособность фагоцитов отвечать на дополнительную стимуляцию, в особенности, бактериальную, связана с тем, что гиперпродукция цитокинов, гормонов и других индукторов воспаления, уже в раннем посттравматическом периоде приводит к острейшему энергетическому и пластическому дефициту. При этом многократно угнетается способность клеток секретировать необходимые в данных условиях и в данной ситуации факторы, эффективно регулирующие функциональную активность участников воспалительной реакции, потенцируя дефекты цитокиновой сети, которые сказываются на эффективности противомикробной защиты организма.

Коррекция таких дефектов, очевидно, может способствовать повышению эффективности профилактических и лечебных мер.

Традиционно в лечении хирургических инфекций основную ставку, помимо вскрытия и дренирования гнойного очага, делают на антимикробную терапию, в частности на антибиотики. Антибактериальные препараты (АБП), при явном приоритете этиотропной направленности своего действия, согласно полученных нами данных также влияют на продукцию цитокинов.

Исследуя влияние амоксиклава, гентамицина, линкомицина и цефотаксима в соответствующих концентрациях (0,15 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл) на продукцию цитокинов клетками периферической крови у детей в острый период травматической болезни, нами установлено их неоднозначные эффекты.

На фоне гиперпродукции ИЛ-1 амоксиклав, гентамицин и линкомицин индуцировали дальнейший рост спонтанной выработки ИЛ-1 (рис. 8). Наиболее выраженную стимуляцию продукции данного цитокина вызывал гентамицин. Аналогичные результаты были получены при оценке влияния анти-

Спонтанная продукция ИЛ-1 под влиянием АБ

ЛПС-продукция ИЛ-1 под влиянием АБ

Примечание: # – достоверные различия с нормой при уровне значимости р<0,001, * – достоверные различия с продукцией без АБП при уровне значимости р<0,01.

Рисунок 8. Показатели спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-1 клетками периферической крови здоровых (n=15) и травмированных детей (n=15) под действием антибактериальных препаратов.

биотиков и на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-1. Добавление амоксиклава, гентамицина и линкомицина к культуре клеток достоверно увеличивало ЛПС-секрецию ИЛ-1. Исключение составил цефотаксим, под действием которого снижалась как спонтанная, так и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-1.

Спонтанная продукция ИЛ-10 под влиянием АБ

ЛПС-продукция ИЛ-10 под влиянием АБ

Примечание: # – достоверные различия с нормой при уровне значимости р<0,01, * – достоверные различия с продукцией без АБП при уровне значимости р<0,05.

Рисунок. 9. Показатели спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-10 клетками периферической крови здоровых (n=15) и травмированных детей (n=15) под действием антибактериальных препаратов.

Все антибиотики на фоне гиперпродукции ИЛ-10 в большей или меньшей степени стимулировали его спонтанную секрецию (рис. 9). Максимум стимуляции инициировал цефотаксим. ЛПС-стимулированная секреция ИЛ-10 под действием всех АБП также достоверно увеличивалась.

Уровень спонтанной и ЛПС-продукции ИЛ-8 под влиянием практически всех изучаемых антибиотиков не изменялся (рис. 10). Исключение составили гентамицин и линкомицин. Первый, из них, достоверно стимулировал спонтанный синтез цитокина, а второй – угнетал его ЛПС-продукцию. Подобная толерантность клеток к действию антибиотиков в отношении секреции ИЛ-8, на наш взгляд, обусловлена достаточно высоким уровнем его базальной и ЛПС-стимулированной продукции, уже в раннем посттравматическом периоде, что свидетельствует о «хемокиновой» гиперактивации in vivo.

Спонтанная продукция ИЛ-8 под влиянием АБ

ЛПС-продукция ИЛ-8 под влиянием АБ

Примечание: # – достоверные различия с нормой при уровне значимости р<0,001, * – достоверные различия с продукцией без АБП при уровне значимости р<0,05.

Рисунок 10. Показатели спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-8 клетками периферической крови здоровых (n=15) и травмированных детей (n=15) под действием антибактериальных препаратов.

Спонтанная продукция ИЛ-4 под влиянием АБ

ЛПС-продукция ИЛ-4 под влиянием АБ

Blog

Автореферат диссертации на соискание ученой степени