Структура и экспрессия mmtv-родственного провируса у больных раком молочной железы

Вид материала

Автореферат

Содержание 1.3. Научная новизна Научно-практическая значимость работы. Апробация работы. Структура и объем диссертации 2.1. Обзор литературы 2.2. Материалы и методы 2.2.2. Сбор биологического материала и выделение нуклеиновых кислот 2.2.3. Постановка ПЦР и ОТ ПЦР 2.2.4. Анализ гомологии ПЦР-продуктов и экспрессии генов gag и env. 2.2.5. Определение сайтов интеграции провируса 2.2.6. Трансформация клеток эпителия почки человека 2.3. Результаты и обсуждение 2.3.2. MMTV-гомологичные последовательности у пациенток с РМЖ, ассоциированным с беременностью (РМЖАБ). Ttgtttgttgctttccccgcggggtgtgtt—tc-ccttct-gggttttcct-gc-tgt-tccttt—3’ (2) ttttt 2.3.3. MMTV-гомологичные последовательности у мужчин с РМЖ и гинекомастией 2.3.4.MMTV-гомологичные последовательности у больных 2.3.5. MMTV–гомологичные последовательности у больных листовидными опухолями молочной железы. 2.3.6. MMTV-гомологичные последовательности у больных РМЖ и неходжкинскими Т-клеточными лимфомами. 2.3.8. MMTV-гомологичные последовательности у пациентки с РМЖ и другими неоплазиями 2.3.9. MMTV-гомологичные последовательности в отдаленных метастазах у пациенток с РМЖ. ... Полное содержание

Подобный материал:

• На правах рукописи бурлаков александр Сергеевич реконструктивная хирургия в лечении, 750.38kb.
• «Воронежская государственная медицинская академия имени Н. Н. Бурденко Федерального, 241.98kb.
• Иммунодиагностика и иммунотерапия рака молочной железы, 241.98kb.
• 20 октября в Украине ежегодно проводиться День борьбы с раком молочной железы. Внашей, 156.69kb.
• Иммунодиагностика и иммунотерапия рака молочной железы, 212.29kb.
• Радионуклидная терапия костных метастазов у больных раком молочной железы, 41.13kb.
• Роль тиреоидной патологии в развитии дисгормональных заболеваний молочной железы, 224.5kb.
• «Медицинский радиологический научный центр», 269.03kb.
• Лучевая терапия различными видами ионизирующего излучения в комплексном лечении больных, 785.18kb.
• Рак молочной железы: вопросы-ответы, 70.08kb.

На правах рукописи


Лушникова Анна Александровна


Структура и экспрессия MMTV-родственного провируса

у больных раком молочной железы


А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


14.01.12. - Онкология


Москва 2010


Работа выполнена в НИИ канцерогенеза, Учреждения Российской Академии медицинских наук Российского Онкологического Научного Центра им.Н.Н.Блохина РАМН; директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов.


Научный консультант:

Доктор биологических наук И.Н.Крюкова


Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе

Доктор биологических наук, профессор Г.Г.Миллер

Доктор биологических наук, профессор В.С.Прасолов


Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН


Защита состоится « 28 » октября 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.001.017.02 РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478 Москва , Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН


Автореферат разослан « » 2010 г.


Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ю.В.Шишкин

1. Общая характеристика работы
   

1.1. Актуальность проблемы


Рак молочной железы (РМЖ) составляет около 15% всех злокачественных неоплазий человека и занимает первое место по заболеваемости и по смертности от онкологических заболеваний[ среди российских женщин. (Чистяков и др., 2009, Любченко Л.Н., 2009). Существуют значительные межпопуляционные различия частот заболеваемости РМЖ, причем у мигрантов, приезжающих в страны с высокой частотой РМЖ заболеваемость со временем также растет. Это указывает на специфичные факторы риска РМЖ. В последнее десятилетие появилось множество работ, посвященных вирусной этиологии РМЖ. В частности, были проанализированы частоты распределения в ткани РМЖ штаммов HPV высокого риска и их ассоциация с онкопатологией молочной железы (Khan N.A. et al. 2008, Mendizabad-Ruiz A.P. et al. 2008). В качестве возможного этиологического агента РМЖ в некоторых популяциях рассматривается также вирус Эпштейна-Барр (EBV). Однако, вероятность участия этих вирусов в развитии РМЖ у человека мала и доказательств в пользу данной гипотезы пока недостаточно (Mant C., Cason J. , 2009; Lawson J.S., Gunzburg W.H., Whitaker N.J., 2006). В литературе широко обсуждается роль в канцерогенезе молочных желез семейства эндогенных бета-ретровирусов человека (HERV), которое содержит около 830 элементов и составляет 8-9% от генома человека. С помощью микрочипов было показано, что уровень транскрипции 18 членов семейства, включая HERV-T, HERV-F, HML-6 и др., в нормальной и опухолевой ткани протокового РМЖ различен (O.Frank et al. 2008). В других исследованиях была выявлена корреляция между высоким уровнем экспрессии в опухолевой ткани провирусов группы HERV-K и РМЖ (Flockerzi A. еt al. 2008) . Однако, значимых различий по уровню транскрипции наиболее специфичных для РМЖ провирусов HERV-K113 и HERV-K115 между здоровыми женщинами и пациентками с РМЖ соответствующего возраста не обнаружено (Burmeister et al. 2004).

В последнее время появились новые данные, проливающие свет на роль в канцерогенезе МЖ человека ретровируса, родственного вирусу опухолей молочных желез мышей (MMTV). Этот ретровирус, впервые описанный Дж. Биттнером в 1936 г., относится к онкогенным ретровирусам типа В (Betaretroviruses) и индуцирует РМЖ у мышей (Coffin J.M et al. 1999). Жизненный цикл MMTV связан с лимфоцитарным путем циркуляции в организме и вертикальной (эндогенный mmtv) или горизонтальной (экзогенный MMTV) передачей потомству. В геноме человека выявлено несколько классов MMTV-гомологичных последовательностей эндогенного (НML-2, HML-6, HERV-K) и экзогенного происхождения (hMTV, HMTV, HBRV). Экзогенные MMTV–родственные ретровирусы были обнаружены как в ткани РМЖ, так и в перипортальных лимфатических узлах, а также в эпителии печеночных протоков у пациентов с первичным билиарным циррозом (L.Hu et al. 2009). Последовательности с высокой гомологией гену env MMTV выявлены с помощью гнездовой ПЦР в опухолевых клетках, экспрессирующих рецепторы к прогестерону (PrR), в 16% (14/89) образцов рака яичников, 36% (53/147) - рака простаты, 10% (5/50) - рака эндометрия, 9% (13/141) - рака кожи ( Johal H. et al. 2010). В сыворотках крови и в опухолевой ткани российских больных РМЖ и некоторых здоровых женщин были обнаружены антигены, иммунологически родственные белкам MMTV (Kryukova I.N., Komarova E.A., 1980; А.А.Лушникова и др. 1998). Была выявлена экспрессия этих белков in vitro в 13% опухолевых клеток из нескольких первичных культур РМЖ человека. (Melana S.M. et al. 2009; Taneja P. et al. 2009).

Вопрос об участии MMTV-родственного ретровируса в кацерогенезе ряда опухолей МЖ человека активно обсуждается, начиная с 1970-1980 гг., и по-прежнему актуален (Zotter S. еt al. 1981; Westley B. Et al., 1984; Salmons B. et al., 1987; Лушникова А.А. 2007). Какова роль hMTV в патогенезе и его вклад в прогрессию РМЖ и других неоплазий человека? Существуют ли принципиальные структурно-функциональные отличия мышиного и человеческого ретровирусов и в чем они заключаются? Каковы особеннсти биологии hMTV: его циркуляции в организме человека, путях передачи и возможных механизмах канцерогенеза? Несмотря на то, что известны некоторые структурные элементы генома и соответствующие нуклеотидные последовательности провируса hMTV, остается неясным, ассоциированы ли они с онкопатологиями молочной железы и другими неоплазиями человека. Решение этих вопросов важно для фундаментальной вирусологии и молекулярной биологии ретровирусов; ответ на них позволит обосновать риск заболеваемости РМЖ и сочетанными неоплазиями, расширить возможности предклинической диагностики РМЖ .

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение особенностей структуры и экспрессии MMTV-родственного провируса (hMTV) в лимфоидной и опухолевой ткани больных с различными типами РМЖ. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить и проанализировать особенности геномной структуры hMTV в разных группах больных РМЖ.
   
2. Сравнить их структуру с каноническими геномными последовательностями МMTV.
   
3. Охарактеризовать специфичные функционально значимые области генома МMTV-родственного провируса (hMTV).
   
4. Изучить экспрессию этих областей генома hMTV в лимфоидной и опухолевой ткани больных, страдающих РМЖ с помощью ОТ ПЦР, нозерн- и/или вестерн-гибридизации.
   
5. Предложить доступный метод обнаружения экспрессирующегося провируса в периферической крови и/или опухолевой ткани МЖ, пригодный для клинической практики.
   

1.3. Научная новизна

Впервые в России нами проанализирована структура и экспрессия hMTV в группах больных с различными клиническими характеристиками: со спорадическим и наследственным РМЖ, ассоциированным с беременностью и лактацией РМЖ (РМЖАБ), с листовидными опухолями молочной железы, с двусторонним РМЖ, РМЖ в сочетании с неоплазиями ЖКТ и гемобластозами, с РМЖ и гинекомастией у мужчин. Были обнаружены структурные особенности провирусного генома и высокий уровень экспрессии провируса в быстро прогрессирующих опухолях молочной железы при РМЖАБ и в рецидивирующих листовидных опухолях. Впервые выявлены специфичные особенности структуры hMTV: нуклеотидные замены в сайте рибосомного фреймшифта и делеции в Sag-кодирующей области 3’LTR, которые могут обусловить неконтагиозность обнаруживаемых в человеческом молоке вирусных частиц за счет дефектного корового белка Gag и нарушения активации клеток-мишеней с участием вирусного суперантигена.

Впервые предложена экспериментальная модель: трансформированные MMTV клетки эпителия эмбриональной почки человека, позволяющая изучить интеграцию провируса в геном человека, его геномную структуру и экспрессию. С помощью экспериментальной клеточной модели и гибридизации in situ, а также ПЦР-анализа геномной ДНК из опухолевой и нормальной тканей доказана экзогенность hMTV для человека и способность эпителиальных клеток человека поддерживать вирусную инфекцию с последующей трансформацией этих клеток.

Впервые описана циркуляция hMTV в организме: экспрессирующиеся провирусные последовательности обнаружены в лимфоидных клетках периферической крови, в опухолевой ткани молочной железы, в отдаленных метастазах у больных РМЖ, в гиперплазированных лимфатических узлах и в костном мозге у некоторых больных гемобластозами.

Впервые сделана попытка многофакторного анализа носительства hMTV в ассоциации с мутациями в генах-супрессорах BRCA1/2 и TP53, экспрессией EsR, PrR и Her2/neu (по результатам иммуногистохимии).

Впервые предложен доступный метод детекции в плазме крови и опухолевых лизатах РМЖ продукта гена env hMTV, кодирующего аминокислотные мотивы в составе клеточных иммунорецепторов и играющего роль в трансформации эпителиальных клеток. Результаты позволяют обосновать роль экзогенного MMTV- родственного ретровируса (hMTV) в индукции и прогрессии РМЖ, и возможно, ряда других неоплазий (неходжкинских лимфом и ювенильного острого миелобластного лейкоза).

4. Научно-практическая значимость работы.
   

Полученные результаты вносят вклад в представления о возможных механизмах индукции опухолей молочной железы, связанных с носительством экзогенных ретровирусов и нестабильностью генома.

В сотрудничестве с профильными отделениями НИИ клинической онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина и лабораторией клинической онкогенетики расширена компьютерная база медико-генетических и молекулярно-биологических данных, создан и пополняется банк образцов биологического материала и ДНК. Предложена методика ПЦР- и иммунодиагностики для различных групп пациентов, страдающих РМЖ и сочетанными неоплазиями, позволяющая улучшить раннюю диагностику, лечение и профилактику РМЖ с целью снижения заболеваемости и смертности пациентов.

4. Апробация работы.
   

Диссертация была апробирована 28 января 2010 г. на совместной конференции лабораторий онкогеномики, лаборатории вирусного канцерогенеза, лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории иммунохимии, и отдела молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Основные результаты работы были представлены в виде стендовых сообщений и тезисов на 19 Российских и международных конференциях и конгрессах, а также доложены на Съездах онкологов и радиологов СНГ, Минск, 2004, Баку, 2006, Ташкент, 2008; Международных конференциях «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы», Санкт-Петербург, 1997, 1998, 2000 гг.; Российских Онкологических Конгрессах, Москва, 2006, 2008 гг.; 4-ой Российской конференции по фундаментальной онкологии, Санкт-Петербург, 2008; VII Milan Breast Cancer Conference, Мilan, 2007; 19^th International Congress on Anti-Cancer Treatment (ICACT), Paris, France, 2008; 3-rd Familial Cancer Conference, Madrid, Spain, 2008; European Human Genetics Conference, Barselona, Spain, 2008 и Vienna, Austria, 2009.

По теме диссертации опубликовано 58 печатных работ в российских и зарубежных, включая рецензируемые журналы.

4. Структура и объем диссертации
   

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы . Диссертационная работа изложена на 230 страницах машинописного текста, включает 68 рисунков, 13 таблиц и список литературы из 329 источников.

2. Содержание работы
   

2.1. Обзор литературы

В обзоре литературы описываются геномная структура MMTV, регуляция транскрипции и экспрессии провируса, обсуждаются этапы и механизмы ретровирусной инфекции с последующей трансформацией клеток-мишеней, а также и циркуляция MMTV в организме хозяина, приведены литературные данные о MMTV-родственных последовательностях, обнаруженных в геноме человека, обсуждаются возможные пути передачи MMTV-родственного ретровируса (hMTV) человеку, дается заключение по исследованной проблеме.

2.2. Материалы и методы


2.2.1. Характеристика больных

Неотобранные выборки пациентов, страдающих различными формами спорадического и наследственного РМЖ, в основном , были сформированы в соответствующих хирургических отделениях НИИ Клинической онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, а группы пациенток с доброкачественными новообразованиями МЖ - на базе отделения амбулаторных методов диагностики и лечения НИИ Клинической онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Контрольная группа здоровых женщин в возрасте до 40 лет была отобрана на базе женской консультации и родильного дома №16 СЗАО г.Москвы (беременные и не рожавшие женщины ) и в Центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (здоровые беременные женщины). Донорами крови были спортсменки общества «Динамо» г.Москвы сравнимого возраста, не имеющие в анамнезе и в родословной онкологических заболеваний.

Таблица 1. Характеристика исследованных групп пациентов и контроля.

Группа	Размер выборки	Возраст диагноза
Спорадический РМЖ	n=104 (6 - из онкологически отягощенных семей)	19-65 (47,7±5,6)
2РМЖ	n=83; n= 51 – наследственный РМЖ, n=32- спорадический РМЖ	25-58(43,0±2,6) 27-75(51,4±5,8)
Наследственный РМЖ	n=26 (пациентки из наследственно отягощенных семей со злокачественными новообразованиями разной локализации, вкл. РМЖ)	25-53 (38,0±4,2)
РМЖАБ	n=68; n= 36 - РМЖ на фоне беременности, n=24- РМЖ на фоне лактации, n= 8-в течение 1-го года после завершения беременности )	21-46(32,7±5,24)
РМЖ у мужчин	n=6	27-72 (48,2±6,43)
ЛО МЖ	n=8	19-36 (27,2±3,5)
ФА	n=17 (без других онкопатологий)	19-75 ( 4,6±5,6)
Гинекомастия	n=11	37-58(41,4±3,8)
Здоровые (без онкопатологии в семьях)	n=20 (здоровые беременные ) n=45 ( доноры)	18-37(25,4±3,1) 20-36 (26,2±2,7)

Анамнез всех исследованных пациентов был проведен либо путем опроса пробанда и членов семьи при медико-генетическом консультировании, либо при анализе записей в истории болезни. Гистологические препараты были пересмотрены в отделении патанатомии РОНЦ. Общую и безрецедивную выживаемость определяли с помощью программы PrismPad. Для проведения сравнительного многофакторного анализа была отобрана группа пациенток молодого возраста n=57, страдающих спорадическим РМЖ, в семьях которых не было случаев онкологических заболеваний. С целью получения корректных оценок пациентки этой группы были отобраны по возрасту, стадии заболевания и сходной терапии. С помощью унифицированного кода был сформирован компьютерный банк данных, учитывающий наследственную отягощенность пациентов. Молекулярно-генетическая диагностика для выявления герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и TP53 и подтверждения генетического диагноза наследственного рака проводилась совместно с лабораторией генетики редких наследственных болезней МГНЦ РАМН.

2.2.2. Сбор биологического материала и выделение нуклеиновых кислот

Образцы периферической крови были получены от нелеченых первичных больных, образцы опухолевых и нормальных тканей – после хирургического вмешательства; их помещали в стерильный физиологический раствор или сжиженный азот и немедленно выделяли ДНК/РНК, затем оставшуюся ткань хранили при -70⁰С. Во избежание контаминации выделение нуклеиновых кислот из биологического материала, ПЦР и клонирование ПЦР-продуктов проводили в стерильных пространственно разделенных боксах с использованием одноразового пластика, дозаторов и наконечников с фильтрами, стерильных рабочих растворов. Полученные образцы ткани хранились при -70⁰С, образцы ДНК/РНК – при -20⁰С, в виде аликвот. При постановке ПЦР был предусмотрен отрицательный (ПЦР-смесь без добавления матрицы) и бланк-контроли (вода). Для внутреннего контроля ПЦР использовали праймеры к клеточным генам, кодирующим GAPDH и β-актин человека. Геномную ДНК из цельной крови и тканей выделяли несколькими стандартными методами, включая фенольную экстракцию и выделение ДНК после частичного гемолиза крови с помощью лизирующего буфера с последующим осаждением этанолом или буфером Extra Gene (ООО Изоген, ИОГен РАН, Москва). Для выделения геномной ДНК хорошего качества из архивного материала и опухолевой ткани использовали наборы DNA MiniPrep (ЗАО Силекс, Москва) и Invisorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Германия), по инструкции производителей. Для выделения вирусного генетического материала из крови и опухолей использовали набор RTP DNA/RNA Virus MiniKit (Invitek, Германия), по инструкции производителя. При выделении эписомной фракции из высокомолекулярной геномной ДНК охлажденную суспензию опухолевых клеток инкубировали при перемешивании 3 часа при 50⁰С в 10 объемах буфера, содержащего 0,5М ЭДТА, рН 8,0, 100 мг/мл протеиназы К и 0,5% саркозила, затем трижды экстрагировали насыщенным фенолом и отбирали нижнюю ДНК - содержащую фазу. После диализа с использованием буфера, содержащего 50мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10мМ ЭДТА, 10мМ NaCl, в течение часа при комнатной температуре инкубировали препарат с РНКазой (10мкг/мл ) и разделяли водную фазу на колонке с Biogel А-150 (Boehringer Mannheim, Германия) с буфером ТЕ, рН 8,0 и 0,1% SDS. Для отбора низкомолекулярных фракций использовали электрофорез в 1,5%-ной агарозе. ДНК осаждали на ночь 5M CH₃OONa, рН 5,2 и этанолом (1:20 по объему) с последующим центрифугированием 10 мин при 14000 об/мин. Для выделения тотальной РНК применяли стандартный метод с использованием ГИТЦ (Трезол, ООО Хеликон, Москва), а также наборы Yellow Solve (Clonogen, С-Петербург) или RNАeasy mini kit (Qiagen Sciences, USA), по инструкциям производителей. Для выделения мРНК использовали магнитные частицы со стрептавидином (ЗАО Силекс, Москва).

2.2.3. Постановка ПЦР и ОТ ПЦР

Для предварительных ПЦР на матрице геномной ДНК использовали праймеры и условия, представленные ниже. Состав и температуру отжига праймеров определяли с помощью программы BLAST 2.0 на основании последовательностей в базе данных, а также после клонирования и секвенирования полученных на матрице геномной ДНК ПЦР-продуктов. Для высокоспецифичной ПЦР в опытах с культурами трансформированных клеток и для повторных ПЦР на hMTV-позитивных образцах ДНК с последующим клонированием провирусных последовательностей использовали также праймеры к Sag-кодирующей области 3’LTR MMTV(hMTV): F/ 5′-GACAGTGGCTGGACTAATAGAACATT-3′ (897- 922, по Brandt-Carlson et al., 1999), R/ 5′AATGTTCTATTAGTCCA-3’; к гену gag: R/ 5′CTCCTTCTTCGGGAAACCAAG3′ (151 -131н.п. от старт. кодона gag); F/ 5′ATGGGGGTCTCGGGCTCAAAAGGG3′ (1-24 н.п. от старт. кодона gag); R/ 5′GGGACTGCCCCTTTACAAGTTTTTTGA3′ (1888-1762 н.п. от старт.кодона gag); F/ 5′-GATGGGAATCCACTTCCTCCC-3′ (1720 -1740 н.п. от старт.кодона gag); к гену env R/5-′GGACCCAGATTGGTGTTTCGGCAT-3′ (24-1 н.п. от старт.кодона env); F/ 5′-ATGCCGAAACACCAATCTGGG-3′ (1-21н.п.от старт.кодона env). Для поиска MMTV-гомологичных последовательностей использовали праймеры к U3-LTRMMTV:F1/5'-TCCTGACTTGGCTTGGTATC-3';R1/5'-GGCCGACCTGAGGGTGAC-3'; HRE-содержащей области LTR: F1/5'-TTAAGTAAGTTTTTGGTTACAAACT-3'; R1/5'-TGGAAAGTGAAGGATAATGACGA-3'.Для локализации сайтов интеграции провируса в культуре эпителиальных клеток эмбриональной почки человека в первом и втором раунде ОТ ПЦР использовали коммерческие рэндом - праймеры ( НПО Литех, Москва). Во втором раунде использовали также праймеры к участкам генома MMTV, подобранные с помощью программы BLAST 2.0:

LTRorf 5’ : 5’ – ATG CCG CGC CTG CAG CAG CAG AA – 3’ (1)

LTRorf 3’ : 5’ - TTA TTT ATT ATA CCT TAT GTC AAA – 3’ (2)

LTR5’ : 5’- GGT GGC AAC CAG GGA CTT AT -3’ (3)

envRT/1 F : 5’- CCA GAT CGC CTT TAA GAA G -3’ (4)

envRT/1R : 5’- TAC AGG TAG CAC TAT GG -3’ (5)

envMMTV/ 2F : 5’- TGC GCC TTC CCT GAC CAG GG -3’ (6)

env MMTV/ 2R: 5’- GTA ACA CAG GCA GAT GTA GG – 3’ (7)

Gag1/ R: 5’ - GAT GAT GAG CTA ATC CTT CC – 3’ (8)

Pol 1/R: 5’ – GGG TCT TTA CTA AAT AAT TC – 3’ (9)

Gag 1/F: 5’- GAC AGC TTG TCT ACC TCT GT -3’ (10)

Pol 2/R: 5’- TGT AGC AGT CCC TAA AGG AT-3’ (11)

gp/ F: 5’ - ATC CTC ACT GCC AGA TCG C -3’ (12)

gp /R: 5’- AAT CTG TGG CAT ACC TAA AGG -3’ (14)

LTR/ F: 5’- GGT GGC AAC CAG GGA CTT AT -3’ (15)

LTR/ R: 5’- CGA ACA GAC ACA AAC ACA CG – 3’ (16)

Область 3’LTR амплифицировали на матрице геномной ДНК, выделенной из ЛПК и опухолевой ткани с использованием пар праймеров (1) ,(2),(3),(15), (16). Затем некоторые специфичные ПЦР-продукты были клонированы в векторе pGEM-Т по инструкции производителя (Promega, USA) и секвенированы. Полученные последовательности сравнивали с гомологичными последовательностями из базы данных BLAST 2.0, Clustal W, DNAStar. Для сравнения С-концевых полиморфных последовательностей Sag-кодирующих областей 3’LTR MMTV использовали алгоритм ANGIS, 2005 (Felsenstein, 1989). Для поиска MMTV-гомологичных последовательностей с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК из опухолевой ткани и ЛПК использовали также праймеры, подобранные с помощью DNAStar и BLAST к геному экзогенного MMTV (штаммы С3Н и HeJ), дающие ПЦР-продукты с частичной гомологией эндогенным MMTV-родственным вирусам. Поскольку протяженная часть генома MMTV гомологична HERV-K, специфичность ПЦР-продуктов длиной 255 п.н. и 575 п.н. (ген env) и 680 п.н. (3’LTR) была подтверждена с помощью блотинга, клонирования и/или выборочного секвенирования соответствующих последовательностей. Последовательность транскриптов определяли с помощью программ BLAST и DNAStar. Для определения вторичной структуры РНК в области gag-pro мРНК MMTV (псевдоузелках) использовали программу SEGFOLD, предсказывающую термодинамическую стабильность фрагмента молекулы РНК путем сравнения данной последовательности со стандартным набором фрагментов молекулы, имеющих фиксированные параметры. (X.Chen et al., 1995). Для ОТ ПЦР на матрице тотальной РНК (по 20 нг в реакцию) использовали пары праймеров:F1: 5’- GCCTTTAAGAAG-3’ ; 695-714; (BLAST AF43689) R1: 5’- TACAGGTAGCAGCACTATGG-3’; 1269–1289 ;(AF43689) F2: 5’- TGCGCCTTCCCTGACCAGGG-3’, 762–781;(AF43689) R2: 5’- GTAACACAGGCAGATGTAGG-3’; 1048–1117 ; AF43689. F3 : 5' CGTCTCCGCTCGTCACTTAT 3'; R 3 : 5' TCAGCACTCTTTTATATTATGG 3'; F4: 5'- CGTCTCCGCTCGTCACTTAT- 3' (1370-1390);R4 : 5'- TCAGCACTCTTTTATATTATGG -3' (9877-9899). Для амплификации генов, кодирующих GAPDH праймеры: F/5'-ССGGAGTCAACGGATTTGG-3'; R/5' -GGCAACAATATCCACTTTACCAGA GT- 3’; β-актин F/ 5’ – TCC GAC СAG TGT TTG CCT TTT ATG -3’; R/ 5’- ACTGCTGTCACCTTC ACCCTTC – 3’ и/или обратную транскриптазу MMLV (НПО Силекс, Москва), Hfi-полимеразу (ЗАО Евроген, Москва), полимеразу Кленова и Taq-полимеразу (НПО Силекс, Москва). Для амплификации концов кДНК при идентификации последовательностей, фланкирующих ПЦР-фрагмент, использовали метод RACE (Rapid Аmplification of cDNA Еnds), по Chenchik A. et al., 1998; J Larrick, 2001). Для ОТ ПЦР на матрице тотальной РНК или (полиА+)РНК в одноэтапном режиме использовали обратную транскриптазу ST/ single tube (ЗАО Силекс, Москва), а в стандартном режиме - SuperScript II , 200 Ед/мкл (Life Technologies, США) с соответствующими буферами и добавлением 20 мM MnCl₂, 0.1 M DTT, смеси dNTP, по 10 мM каждого нуклеотида. При использовании во втором раунде полимеразы Кленова для ПЦР применяли буфер, содержащий 300 мM трицин-KOH (pH 9.1), 160 мM сульфата аммония, 30 мM MgCl₂ , 0.2 мг/ мл BSA.

2.2.4. Анализ гомологии ПЦР-продуктов и экспрессии генов gag и env.

ПЦР - продукты выборочно секвенировали с использованием автоматического оборудования ABI PRISM 3 100-Avant, USA ( МГНЦ РАМН и Институт вирусологии им. Ивановского РАН). Для дополнительного контроля и характеристики MMTV-гомологичных последовательностей в ряде случаев проводили гибридизацию по Саузерну с меченными ³²Р или дигоксигенином пробами: MMTV -специфичными ПЦР-продуктами, полученными на матрице ДНК из селезенки мышей вирус-продуцирующей линии С3Н (GR) и пробой - геном env MMTV, клонированном в плазмиде pBluescript SK^+/- , производной pUC19 (любезно предоставлена д-ром Т.В.Головкиной, США). Плазмиду выделяли щелочным методом из суточной культуры трансформированных клеток E.coli и после рестрикции PstI анализировали вставку в 1,5%-ном агарозном геле. Элюированный из геля фрагмент длиной около 1,5 т.п.н. метили дигоксигенином с помощью рэндом-праймеров по инструкции производителя (Boehringer Mannheim, Германия). Для доказательства гомологии ПЦР-продуктов и уточнения их последовательностей использовали также выборочное клонирование этих последовательностей в векторе pGEM-T по инструкции производителя (Promega, USA). Нозерн-гибридизацию проводили стандартным методом.

Для анализа экспрессии белка - продукта гена gag MMTV методом вестерн-гибридизации использовали коммерческие моноклональные мышиные антитела mAbP2 anti-gag MMTV (любезно предоставлены д-ром П.Хейно, P. Hainaut, Университет Льежа, Бельгия). Визуализацию белков проводили с помощью кроличьего IgG, меченного антителами против IgG, конъюгированными с пероксидазой хрена (GE Bio-Science, США), а также окрашиванием белка с помощью кумасси (метод Брэдфорд). Иммунологически родственный gp52 белок выделяли с помощью магнитных частиц c иммобилизованным IgG, конъюгированным с меченными моноклональными мышиными антителами mAbP2 anti-gp52 IgG (любезно предоставлены д-ром П.Хейно), согласно инструкции производителя (ЗАО Силекс, Москва).

2.2.5. Определение сайтов интеграции провируса

Для детекции сайтов интеграции провируса в трансформированных клетках эпителия эмбриональной почки человека (ПКЭПЧ) и в трансформированных клетках НЕК 293-Т использовали ПЦР-продукты, полученные с использованием праймеров к LTR MMTV и коммерческих рэндом-праймеров для амплификации кДНК. Подбор нуклеотидной последовательности экзогенного провируса от сайта рестрикции EcoRI к концу U5 3’LTR проводили пользуясь банком нуклеотидных последовательностей BLAST. Геномную ДНК, выделенную из клеток после 6-7 пассажей клеток, обрабатывали EcoRI и лигировали с олигонуклеотидными затравками АР1 и АР2 по инструкции производителя (GenomeWalker adaptor , Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). После двух раундов ПЦР на матрице лигированных фрагментов ДНК с использованием специфичного для линкера праймера АР1 и праймера к MMTV LTR (F: 5' CGTCTCCGCTCGTCACTTAT- 3'), а затем полугнездовой ПЦР с праймерами АР2 и LTR F, продукты секвенировали и определяли гомологию фланкирующих провирус последовательностей с помощью BLAST 2.0 (UCSC Genome Bioinformatics) и DNAStar. В двух случаях ( две культуры трансформированных клеток НЕК 293Т) использовали метод RACE. Последовательность, локализованную левее интегрированного провируса (дупликации 6-ти нуклеотидов), определяли с помощью ПЦР с использованием MMTV-специфичного обратного праймера: (начиная с 9400-й п.н.): 5' СCACCAAGGAGGTCTAGCTCTG 3' и праймера АР1.

2.2.6. Трансформация клеток эпителия почки человека

Полученные культуры трансформированных клеток использовались в качестве модели для исследования структуры и экспрессии провирусного генома, а также некоторых сайтов его интеграции в хромосомы человека. Две различные эмбриональные почки человека были любезно предоставлены в НИИ акушерства и гинекологии МЗ РФ, а клеточная линия эпителия эмбриональных почек человека НЕК 293 Т – в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ. Первичные культуры получены на среде RPMI-640 (SERVA) с добавлением 12% эмбриональной телячьей сыворотки (НПО ПанЭко, Москва). Клетки-продуценты MMTV выделяли путем суспендирования селезенки мыши линии С3Н, взятой до появления у нее РМЖ. Измельченную селезенку гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере и для лучшей адгезии вирусных частиц в гомогенат добавляли полибрен (Aldrich, Германия), 8 мкл/мл. Суспензию клеток селезенки, обработанных митомицином (10^-3М), наслаивали на монослой пролиферирующих эпителиальных клеток почки. После инкубации 2 час. при 37⁰С жидкую фазу удаляли и наслаивали свежую среду. Через 1-2 дня среду заменяли на свежую с внесением инсулина и дексаметазона (Sigma, USA), 10^-6M . К этому времени все клетки селезенки мыши вступали в апоптоз. Контролем служили флаконы без внесения клеток мышиной селезенки, но с добавлением в среду гормонов. Спустя 14 дней после внесения вирус-продуцирующих клеток с недельным интервалом выделяли из части пересеваемых клеток ДНК и РНК (500 нг) для ПЦР и ОТ ПЦР. Для ПЦР использовали праймеры к gp52-кодирующей области

гена env (ПЦР-продукты длиной 575п.н. и 255п.н.): F1/5’-ATCCTCACTGCCAGATCGC-3’;R1/5’-TCTGTGGCATACCTAAAGG-3’; F2/5’-TACATCTGCCTGTGTTAC-3’; R2/5’-ATCTGTGGCATACCT-3’ и LTR MMTV : F/5’-GGTGGCAACCAGGGACTTAT-3’; R/5’-CGAACAGACACAAACACACG-3’.

Для клонирования специфичных ПЦР-продуктов использовали также пары праймеров, указанные выше. ПЦР-продукты были секвенированы и клонированы в системе pGem-T (Promega, USA), по инструкции производителя. Некоторые из отобранных плазмидных клонов также секвенировали с помощью MegaBace-500 (Amersham). Часть активно делящихся клеток с признаками трансформации фиксировали в смеси метанол – уксусная кислота (3:1) и кариотипировали стандартным методом с помощью дифференциальной окраски по Гимза. Для доказательства хромосомной локализации провирусных последовательностей использовали гибридизацию in situ с меченными биотином по инструкции производителя (ЗАО Силекс, Москва) ПЦР-продуктами длиной 255 п.н. и 575 п.н , гомологичными гену env MMTV .