«Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии» (экспериментальное исследование) 14. 00. 41. Трансплантология и искусственные органы 14. 00. 16. Патологическая физиология

Вид материала

Исследование

Содержание Научные руководители Официальные оппоненты Ведущая организация Актуальность темы Структура и объем диссертации Содержание работы Расход животных и биологического материала на отработку технологии получения, предифференцировки и идентификации клеточных культ Группа исследований Характеристика экспериментальных серий и расход животных при исследовании терапевтических эффектов клеточной трансплантации. Методы идентификации специфичности клеток в культуре и активности их в тканях после трансплантации. Техника моделирования повреждения органов и тканей. Методы статистической обработки. Практические рекомендации

Подобный материал:

• Возможности физико-химической регуляции пула стволовых клеток, 187.05kb.
• Патология почек в материале нулевых и одночасовых биоптатов аллотрансплантатов (гистологическое, 424.62kb.
• Применение композиционного материала «эластопоб»- ар при лечении грыж брюшной стенки, 330.27kb.
• Анализ факторов риска и пути оптимизации выживаемости реципиентов серца. 14. 00., 1258.69kb.
• Прогностическое значение маркеров воспаления у больных ибс, оперированных в условиях, 339.25kb.
• Механическая и медикаментозная поддержка кровообращения в хирургии аневризм левого, 451.94kb.
• Особенности липидного обмена у больных с вирусным гепатитом с в терминальной стадии, 278.64kb.
• Влияние гипо- и гиперпаратиреоза на особенности организации циркадианных ритмов состава, 234.16kb.
• Перкуссия при болезнях органов кроветворения и крови, 1864.75kb.
• Гнойно-септические осложнения в трансплантологии и кардиохирургии: эпидемиология, 966.17kb.

На правах рукописи

Крашенинников Михаил Евгеньевич


«Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии»

(экспериментальное исследование)


14.00.41.- Трансплантология и искусственные органы

14.00.16.- Патологическая физиология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


МОСКВА 2006 г.

Работа выполнена в ФГУ “Научно-исследовательском институте

Трансплантологии и искусственных органов Росздрава”


НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валерий Иванович Шумаков


Доктор медицинских наук, профессор Нина Андреевна Онищенко


ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Чл. корр. РАМН, Доктор химических наук, Сергей Евгеньевич

профессор Северин

Доктор медицинских наук, профессор Николай Николаевич Скалецкий


ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГУ “Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава”

Защита диссертации состоится «23» октября 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.055.01. при ФГУ “НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава” по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д.1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ “НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава”.

Автореферат разослан «___» _______ 2006 года.


Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.055.01.

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна Шевченко

Актуальность темы

В последние десятилетия в России, также как и во всем мире стали отчетливо проявляться тревожные тенденции старения населения, роста хронических заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста (отчет ВОЗ за 2002 год). Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжелым бременем на государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение. Указанные обстоятельства настоятельно требуют освоения и внедрения в клиническую практику новых более эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных.

Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии позволяет рассматривать клетку не только как главный объект лечебного воздействия, но и как средство лечения многих заболеваний. Так для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация аллогенных фетальных и неонатальных ксеногенных культур островковых клеток поджелудочной железы (В.И.Шумаков, Н.Н.Скалецкий, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение ксеногенных гепатоцитов и спленоцитов (Demetriou et.al. 1995, Н.А.Онищенко и др. 1995, В.И.Шумаков и др. 1998), терапия аллогенными фетальными клетками используется для лечения ожогов (Д.С.Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшена (В.С.Репин, Г.Т.Сухих 1998) и т.д.

Острый дефицит фетального аллогенного материала, обладающего высокой биологической активностью, и существование биоэтических проблем его использования (Ю.М.Лопухин, 2002), а также высокая антигенность ксеногенных клеток и опасность инфицирования при их использовании обусловили в последние пять лет пробуждение повышенного интереса исследователей всего мира к проблеме использования в медицине аутологичных мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (КМ) (Perin et.al. 2003; Assmus et. al.2002; Hess et.al. 2002; Iversen et.al. 2000; Strauer, Kornowski 2003).

Приступив в 2000 году к изучению возможности применения мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток КМ в восстановительной медицине, мы убедились в том, что биологические возможности клеточной терапии этими клетками вообще остаются мало изученными и поэтому нереализованными. В частности в литературе отсутствовали четкие представления о механизмах и путях реализации терапевтических эффектов клеточных технологий, не были отработаны режимы предифференцировки мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в различные типы клеток (в частности в кардиомиоцитоподобные (КМЦП) клетки) и не использовались широко тканеспецифические маркеры предифференцировки для контроля оптимизации сроков дифференцировки МСК перед трансплантацией, не была отработана техника идентификации предифференцированных прогениторных клеток КМ в соответствующих тканях после трансплантации, а также не проводилась количественная оценка воздействия аутологичных прогениторных клеток стромального и гемопоэтического ряда на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов. Отсутствие таких данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы.

Оптимизировать технологические режимы культивирования прогениторных клеток КМ и предифференцировки МСК в кардиомиоцито-, остеобласто- и фибробластоподобные клетки, а также изучить влияние этих клеток на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов.

Задачи работы.

1. Отработать методику раздельного выделения из костного мозга гемопоэтических и МСК и изучить влияние процесса культивирования на функциональную активность этих клеток.
   
2. Отработать режимы культивирования и предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, остеобластоподобные и фибробластоподобные клетки in vitro и подтвердить состоявшуюся кардиогенную и остеогенную предифференцировку клеток.
   
3. Отработать методику маркирования клеток для выявления их в соответствующих мягких тканях после трансплантации.
   
4. Количественно оценить регенерацию поврежденных органов (сердце) и тканей (кожа, сосуды) при трансплантации в поврежденные зоны прекультивированных аутологичных прогениторных клеток костного мозга стромального и гемопоэтического ряда и сравнить эффективность лечения с результатами трансплантации аллогенных фетальных клеток в модельных опытах на животных с криодеструкцией миокарда, с глубоким ожогом кожи и с дислипидогенным гепатозом и микроангиопатией.
   
5. Разработать технологию восстановления целостности длинных трубчатых костей с помощью иммобилизованных аутологичных клеток костного мозга в модельных опытах с резекцией кости.
   

Выполнение работы осуществлялось в рамках программы «Клеточные технологии медицине» по заданию Росздрава России (регистрационные №01.2.00 305441 и 01.2.00 305442).

Научная новизна.

Установлено, что в процессе культивирования гемопоэтических и МСК костного мозга активизируются функциональные потенции этих клеток, в результате чего процедуру культивирования аутологичных клеток костного мозга следует рассматривать как необходимый этап для осуществления успешной клеточной терапии. При культивировании гемопоэтической фракции клеток костного мозга это выражается изменением фенотипического состава клеток и продукции цитокинов, для фракции стромальных клеток - их дифференцировкой и продукцией цитокинов (IL-10, G-CSF и TGFβ).

В опытах in vitro отработана технология направленной дифференцировки МСК в остеобластоподобные, кардиомиоцитоподобные и колониеобразующие фибробластоподобные клетки путём создания адекватного состава культуральной среды. При дифференцировке МСК в КМЦП к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), обладающие способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-ой неделе культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток достигает своего максимума - 35-40% от общего количества клеток в культуре.

Проведена идентификация кардиомиоцитоподобных клеток по окраске на тропонин I, фибробластоподобных клеток - на коллаген I типа, виментин и CD133, а остеобластоподобных клеток - на коллаген I типа, на щелочную фосфатазу и остеопонтин. Глубокая дифференцировка клеток в культуре тормозит процесс пролиферации и понижает их жизнеспособность, делая их непригодными для трансплантации.

На моделях острого повреждения тканей у животных: кожи, сердца и трубчатых костей, а также при моделировании дислипидемии с хроническим повреждением стенки сосудов, установлены позитивные терапевтические эффекты применения прогениторных клеток костного мозга после культивирования. Показано, что трансплантация фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток ауто- и аллогенного КМ на ожоговую поверхность кожи ускоряет процесс заживления кожных ран более интенсивно, чем трансплантация фетальных фибробластов.

Было установлено, что КМЦП клетки аутологичного КМ, повышают систолическую функцию левого желудочка как при воздействии на него нагрузки объемом, так и при воздействии нагрузки сопротивлением.

Показано, что дополнительная иммобилизация МСК из аутологичного КМ на аллогенном деминерализованном костном имплантате ускоряет процесс остеогенеза и сокращает сроки репаративной регенерации трубчатых костей.

Показано, что для коррекции дислипидемии и ранних проявлений атерогенеза могут использоваться как клетки аллогенной фетальной печени, так и прогениторные клетки аутологичного КМ; однако эффект последних более пролонгирован по коррекции показателей микроангиопатий.

Практическая значимость работы.

Отработаны технологические режимы предифференцировки МСК КМ в колониеобразующие фибробластоподобные, кардиомиоцитоподобные и остеобластоподобные клетки. Предложено для трансплантации предифференцированных клеток использовать относительно короткие сроки предифференцировки (не более 2-х - 3-х недель для кардиомиоцито- и остеобластоподобных клеток), т.к. образование 75% монослоя совпадает с осуществлением начальных стадий дифференцировки в заданном направлении.

С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего LacZ-ген E.coli, внедренного в фетальные клетки (кардиомиоциты, фибробласты) и МСК костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие и функционирование этих клеток в течение, по крайней мере, 3-4 недель после трансплантации в зону повреждения.

Показана перспективность применения стволовых клеток аутологичного КМ для ускоренного и более эффективного восстановительного лечения поврежденных органов: при ожоговых ранах, при деструктивных процессах в миокарде, при дислипидемическом повреждении сосудов, печени и при нарушениях целостности трубчатых костей. Разработанный метод восстановления целостности трубчатых костей с помощью костных имплантатов, содержащих иммобилизованные аутологичные МСК КМ, внедрен в клиническую практику. На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым матриксом с адгезированными на нем аутологичными клетками КМ, получен патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены: на II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам, Москва, октябрь, 2002; на I Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в Здравоохранении», Москва, 22 мая, 2003; на XIII Международной конференции по проблеме “Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии”, 17-18 июня 2003, Пущино; на 2-й Международной конференции ”Патофизиология и современная медицина”, Москва, 22-24 апреля 2004; на III Российском конгрессе по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004; на III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам. Москва, 28-30 октября 2005 г; на 12-ом Всемирном конгрессе по заболеваниям сердца (World Congress on Heart Disease «New Trends in Research Diagnosis and Treatment», to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver, B.C., Canada, July 16-19, 2005).

Апробация работы состоялась на межлабораторной конференции ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава 3 ноября 2005г.

По теме диссертации опубликовано 21 работа, из них 16 в центральной печати, 4 в зарубежной печати и 1 патент РФ.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы исследования», описания результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Указатель используемой литературы содержит 250 источников, из которых 44 отечественных и 206 иностранных. Работа изложена на 148 страницах, содержит 14 таблиц и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Общая характеристика экспериментального материала. Работа выполнена на 438 животных (306 крыс породы Вистар массой 200-250 г, из которых 214 самцы и 92 – беременные самки; 120 трехцветных морских свинок, из которых 104 - самцы массой 300-400 г. и 16 – беременные самки массой 400-500 г., а также 12 беспородных кошек массой 2,0-2,5 кг, из которых 6 – получены от одного помета).

Эксперименты на этих животных проводились по 2-м основным направлениям: по пути отработки технологии культуральных исследований (таблица №1), а также по пути исследования терапевтических возможностей полученных клеточных культур при моделировании повреждения органов (таблица №2).

При повреждении миокарда эффекты клеточной терапии изучали на 4 группах животных: группа 1 (n=24) – ложно оперированные крысы; в группах 2, 3 и 4 у животных моделировали сердечную недостаточность методом криодеструкции (КД) и через 7 суток в принекротическую зону животным 2 группы (n=34) инъецировали р-р Хэнкса (контроль повреждения), животным 3 группы (n=36) взвесь аллогенных фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ) (среднее количество 1,15±0,59 млн. клеток в р-ре Хэнкса), животным 4-ой группы (n=30) аутологичные МСК КМ, предифференцированные в кардиомиоцитарном направлении (ПМСК) (1,49±0,93 млн. клеток в р-ре Хэнкса, р=0,129 по сравнению со средним количеством ФКМЦ). Животные в группе 3 после трансплантации получали циклоспорин А в дозе 5 мг/(кг/сут). Выживших животных каждой группы выводили из эксперимента через 4 недели после КД для изучения состояния сократительной функции миокарда и для проведения иммуногистохимического исследования.

Таблица 1.

Расход животных и биологического материала на отработку технологии получения, предифференцировки и идентификации клеточных культур.

Группа исследований		Объект исследований
		Животные *	Костный мозг человека
1	Получение: - фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ),	Крысы (беременные) (75)	200 мл
	- фетальных фибробластов (ФФ)	Крысы (беременные) (17)
	- фетальных клеток печени (КФП)	Морские свинки (беременные) (6)
2	Получение и культивирование стволовых и прогениторных клеток КМ (главным образом гемопоэтических).	Морские свинки (самцы)(6)
3	Получение, ведение первичных культур МСК и предифференцировка МСК: - фибробластоподобные (ФМСК)	Крысы (самцы) (21)
	- кардиомиоцитоподобные (КМЦП)	Крысы (самцы) (33)
	- остеобластоподобные клетки (ОБПК)	Кошки (самцы) (6)
Общий расход животных		164

*- в скобках указано количество животных

При повреждении кожи эффекты клеточной терапии изучали на 4-х группах крыс, в каждой из которых на коже создавали глубокие ожоговые раны методом термодеструкции (ТД). В 1-ой группе (n=10) после термического ожога выполняли трансплантацию аллогенных фетальных фибробластов (ФФ); во 2-ой группе (n=10) трансплантацию фибробластоподобных МСК (ФМСК) аллогенного КМ; в 3-ей группе (n=10) трансплантацию аллогенных ФМСК, предварительно иммобилизованных на биодеградируемой мембране “ЭластоПОБ”; в 4-ю группу было включено 10 крыс с глубоким термическим ожогом без применения клеточной терапии (контрольная группа). Суспензию ФФ и ФМСК в 1-й и 2-й группах наносили на поверхность ожоговой раны пипеткой в количестве по 2х10⁶ клеток на 2-е сутки после ТД кожи и иссечения образовавшегося некротического струпа. После трансплантации клеток, ожоговую поверхность закрывали марлевой салфеткой, смоченной физиологическим раствором с гентамицином. В 3й группе аллогенные ФМСК, предварительно иммобилизованные на биополимере, также наносили на 2-е сутки после ТД. Неподвижность мембраны создавали путем подшивания ее к краям раны, а для плотного прилегания накладывали марлевую повязку.

Таблица 2.

Характеристика экспериментальных серий и расход животных при исследовании терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

Название экспериментальных серий	Вид животных	Количество животных
Трансплантация ФКМЦ и аутологичных ПМСК КМ в принекротическую зону миокарда после моделирования повреждения сердца методом КД.	Крысы – самцы породы Вистар	124
Трансплантация ФФ и аллогенных ФМСК КМ на поверхность ожоговых ран, моделированных методом ТД.	Крысы – самцы породы Вистар	40
Трансплантация КФП и аутологичных ККМ для коррекции липидного обмена в организме после моделирования хронической дислипидемии и раннего атерогенеза.	Трехцветные морские свинки - самцы	104
Трансплантация имплантата с иммобилизованными предифференцированными МСК аутологичного КМ после резекции лучевой кости.	Однопомет-ные беспородные кошки	6
	Всего	274 голов

Контроль эффективности клеточной терапии осуществляли 1, 3, 7, 15, 30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

При дислипидемии и на ранних стадиях атерогенеза эффекты клеточной терапии изучали в 2-х группах опытов на 104 морских свинках, из которых 10 – беременные самки – доноры клеток фетальной печени (КФП).

В 1-й группе изучали терапевтический эффект свежевыделенных КФП у морских свинок на фоне атерогенной диеты (АТД) (n=20) и на фоне молочной диеты (контроль) (n=16). Во 2-й группе изучали эффект смешанной культуры стволовых и прогениторных клеток аутологичного КМ у морских свинок на фоне АТД (n=20) и на фоне молочной диеты (n=16). Для обеих групп опытов контролем служили морские свинки, которым на фоне АТД вводили физиологический раствор (n=22). Хроническая алиментарная дислипидемия и ранние стадии атерогенеза поддерживались в течение 6 месяцев.

Суспензию КФП и смешанную культуру стволовых клеток аутологичного КМ (преимущественно фракцию мононуклеарных стволовых клеток) вводили однократно в нижний полюс паренхимы селезенки в количестве 20 млн. клеток в 1 мл. физ. раствора через 2 месяца пребывания животных на АТД; причем действие введенных клеток исследовалось на фоне продолжающегося получения животными АТД (еще 4 месяца).

Контроль терапевтической эффективности клеточных трансплантаций при дислипидемии и на ранних стадиях атерогенеза оценивали в течение 4-х месяцев после введения клеток.

При дефиците костной ткани эффект клеточной терапии изучали на 6 беспородных кошках, которым создавали модель дефицита лучевой кости. Всего было выполнено 3 группы опытов. В 1-й группе – животным (n=2) имплантировали в зону дефекта лучевой кости деминерализованную кость с собственными иммобилизованными МСК (плотность посадки не менее 2-4 х 10⁴ клеток/см² и 30 х 10⁴ клеток/см³), а имплантат закрывали надкостницей; во 2-ой группе животным (n=2) также имплантировали деминерализованную кость с собственными МСК, но закрывали мышцей; в третьей группе животным (n=2) имплантировали деминерализованную кость без МСК и имплантат закрывали надкостницей. Общий срок наблюдения после операции составил 12 недель, в течение которых животные сохраняли опороспособность на переднюю оперированную конечность за счет сохранения целостности локтевой кости.

Получение культур фетальных клеток и отдельных фракций клеток из КМ.

Работа по выделению и культивированию клеток проводилась в соответствии с общими принципами культуральных исследований.

Культуры фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ) получали ферментативным методом, описанным Li, (1993) из сердец плодов беременных крыс линии Вистар. Для одной трансплантации использовали 2-дневную культуру ФКМЦ, полученную из 2-3 эмбриональных сердец.

Клетки фетальной печени (КФП) выделяли из печени плодов морских свинок на 17-22 дни гестации ферментативным методом с использованием 0,05% раствора коллагеназы, промыванием измельченных кусочков ткани и продавливанием через сито со средой DMEM с 3% фетальной телячьей сывороткой. Терапевтическую дозу КФП получали из печени 1 эмбриона.

Культуры фетальных фибробластов (ФФ) – получали из легкого плодов крыс на 17-21 сутки гестации по методике Д.С.Саркисова и соавт. (1991). Материал для одной трансплантации ФФ получали от 2-3 плодов.

Культуры клеток костного мозга (ККМ) получали из аспирата костного мозга животных и человека.

Аспират КМ обрабатывали лизирующим раствором (114 mM NH₄Cl; 7,5 mM KHCO₃; 100 мкМ EDTA) при комнатной t⁰=(22⁰C) в течение 3 мин с последующим отмыванием и центрифугированием. Осадок мононуклеарных клеток, ресуспендировали в ростовой среде IMDM (Gibco, USA) с добавками и высевали на культуральный пластик.

Культуры гемопоэтических клеток, не прикрепившиеся к пластику, получали через 7 суток культивирования.

Культуры мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток (МСК) получали из очищенного аспирата КМ путем адгезии клеток к культуральному пластику после смыва не прикрепившихся клеток (гемопоэтических) через 7 суток культивирования. При культивировании смену среды производили через каждые 3 суток.

Методы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) стволовых и прогениторных клеток костного мозга.

Кардиомиоцитоподобные клетки (КМЦП) из МСК получали по методике Caplan 1991, предусматривающей временное добавление в культуральную среду 5-азацитидина (Sigma, USA) в концентрации 3-6мкМ.

Фибробласто-подобные клетки (ФМСК) получали из очищенной суспензии МСК, с временной инкубацией клеток в среде с 5-азацитидином и заменой на среду с добавкой основного фактора роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл (Sigma, USA). Через 2-3 недели клеточный материал был готов для трансплантации. О состоявшейся дифференцировке МСК в фибробластоподобные клетки судили через 3-4 недели культивирования.

Остеобластоподобные клетки (ОБПК) получали из суспензии МСК КМ, которую ресуспендировали в среде IMDM со специальными добавками на различных подложках. Оптимальный срок культивирования составлял 2-3 недели. Удлинение срока культивирования предпринимали для выявления состоявшейся предифференцировки МСК в ОБПК.

При достижении 75% монослоя и при положительной окраске МСК на маркеры соответствующей дифференцировки (КМЦП, ФМСК, ОБПК), полученные культуры клеток считались готовыми для применения. Жизнеспособность клеток перед трансплантацией составляла 95±2%, по окрашиванию трипановым синим.

Для трансплантации ФМСК в части опытов использовали биоконструкцию, состоящую из биодеградируемой мембраны ЭластоПОБ с иммобилизованными на ней клетками. Мембраны ЭластоПОБ были изготовлены в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава (рук. Центра проф. Севастьянов В.И). Для трансплантации ОБПК использовали имплантаты из деминерализованных костей человека и губчатые матриксы с адгезированными на них клетками. Для клинического применения, такие имплантаты дополнительно фиксировали губчатым матриксом с адгезированными аутологичными клетками КМ (патент на изобретение №2240135 от 20 ноября 2004г).

Методы идентификации специфичности клеток в культуре и активности их в тканях после трансплантации.

Идентификация кардиоспецифичности клеток осуществлялась по выявлению в них - кардиоспецифичного тропонина I, иммуногистохимическим методом с использованием мышиных моноклональных антител к тропонину-I.

Идентификацию МСК и фибробластоподобных МСК осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя моноклональные антитела (МАТ) к маркерам – виментину, поверхностному антигену CD133, а также коллагену I типа (А. Лейси, 1992).

Идентификацию остеобластоподобной дифференцировки МСК осуществляли по выявлению в клетках коллагена I типа, по окрашиванию их на активность щелочной фосфатазы и остеопонтин (А. Лейси, 1992).

Для идентификации трансплантированных клеток в тканях после трансплантации использовали метод Wakitani (1995), прижизненного введения кодирующей метки в клеточную культуру. Введение метки в культивируемые клетки осуществляли с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген LacZ из E.coli, кодирующего бактериальную β-галактозидазу. Активность β-галактозидазы выявляли гистохимически по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата X-Gal.

Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию клеточных культур проводили на микроскопах "Axiovert-25" (Karl Zeiss, Германия), Laborux" ("Leika", Германия). Для фотографирования использовали цифровую фотокамеру "Axiocam color" (Karl Zeiss, Германия).

Определение фенотипического состава клеток гемопоэтической фракции КМ проводили на проточном цитофлуориметре FAScan фирмы Becton Dickinson (USA) с использованием комбинации МАТ к дифференцировочным и активационным маркерам (НПЦ-«МедБиоСпектр» и «Сорбент»), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ).

Цитокины в культуральной среде: IL-10, G-CSF, TGF-β определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург).

Техника моделирования повреждения органов и тканей.

Повреждение миокарда создавали у крыс методом КД под наркозом (кетамин 50 мг/кг и ксилазолин 10 мг/кг) в условиях искусственной вентиляции легких после торакотомии и перикардотомии. Для этого к переднебоковой стенке левого желудочка на 30 с. прикладывали металлический стержень (Д=6 мм), охлажденный в жидком азоте. Криовоздействие повторяли 14 раз.

Ожоговые повреждения кожи моделировали в хирургическую стадию эфирного наркоза (50 мг/кг подкожно) методом ТД. Для этого к коже спины прикладывали металлическую пластинку, нагретую до 97,7⁰С на 8 сек. Площадь пластины составляла 18-20% общей поверхности кожи крысы. При указанных режимах экспозиции достигалось повреждение всех слоев кожи.

Дефицит костной ткани моделировали у кошек путем резекции лучевой кости. Для этого под внутривенным наркозом резицировали фрагмент лучевой кости длиной 1,5 см в средней трети. В образовавшийся дефект помещали костный имплантат без клеток (контроль), либо с иммобилизованными на нем аутологичными МСК. Рану послойно и наглухо закрывали, дополнительной фиксации имплантата не проводили.

Дислипидемическую ангиопатию и жировую дистрофию печени моделировали в хронических опытах на морских свинках назначением АТД (0,1г холестерина на молоке/100г веса животного в сутки в течение 6 месяцев). В контрольных группах животные получали молочную диету – свежее цельное молоко – I контроль, или стандартную диету вивария – II контроль.

Методы изучения функции органов.

Насосную функцию сердца в опытах с КД миокарда изучали через 3 недели после трансплантации ФКМЦ и предифференцированных МСК (т.е. через 4 недели после КД миокарда) в стендовых условиях по модифицированной методике Neely (1967 г). Методика позволяет регистрировать показатели насосной функции левого желудочка сердца в условиях последовательной смены 8 режимов нагрузок.

Участие печени в липидном обмене в опытах с моделированием дислипидемии и ранних стадий атерогенеза изучали путем определения общего холестерина (ХС), холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотностей (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), и триглицеридов (ТГ).

Темп восстановления кожных покровов при моделировании термических ожогов оценивали планиметрическим методом по скорости сокращения раневой поверхности.

Регенерацию костной ткани оценивали рентгенологически по появлению оссифицированных тканей в области трансплантатов.

Гистологические методы исследования.

Для исследования регенерации поврежденной кожи или кости получали биоптаты из зон повреждения и готовили либо криостатные, либо парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Морфологические изменения в печени и аорте при моделировании дислипидемии и ранних стадий атерогенеза изучали на криосрезах, окрашенных на жир по Гольдману. Состояние микроциркуляторного русла оценивали на тотальных пленочных препаратах брыжейки тонкой кишки, импрегнированной азотнокислым серебром (по Куприянову В.В., 1975). Морфометрию микрососудов проводили на полуавтоматической системе анализа изображения “Leitz-ASM” (Германия).

Методы статистической обработки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов вариационной статистики в программе EXCEL пакеты MS Office и Biostat 4.03. Для сравнения количественных показаний использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05.

Результаты исследования.

I. Культивирование как способ выявления биологических и терапевтических эффектов клеток костного мозга.

Используя различные питательные среды для культивирования стромальных ККМ и маркеры идентификации состоявшейся предифференцировки, мы показали, что уже через одну неделю клетки начинают распластываться и формировать монослой. При окрашивании этих клеток на виментин и антиген CD133, мы подтвердили, что через одну неделю все прикрепившиеся клетки имеют мезенхимальное происхождение, т.к. в 100% клеток выявляется виментин. Окраска на CD133 на этом сроке культивирования составила 80%, а по мере увеличения сроков культивирования и формирования монослоя снижалась до 20% к 8 неделе культивирования. Мы полагаем, что снижение в культуре клеток с маркером CD133 указывает на снижение молодых клеток, способных дифференцироваться в другие клеточные фенотипы при создании соответствующих условий. В результате исследования было констатировано, что мы применили адекватную методику получения МСК в культуре и что для проведения направленной дифференцировки клеток в заданном направлении нужно использовать МСК только на ранних сроках выделения и культивирования, поскольку именно эти МСК содержат молодые и недифференцированные популяции клеток, обладающие высоким пластическим потенциалом. Далее мы показали, что культура молодых МСК может стать источником для получения клеток нескольких фенотипов, при использовании адекватно подобранных культуральных сред и условий для их направленной дифференцировки.

Необходимость разработки технологий предифференцировки МСК по различным направлениям диктовалась намерением трансплантации дифференцированных МСК со свойствами соответствующих прогениторных клеток в различные пораженные органы для восстановительной регенерации.

Нами были отработаны режимы предифференцировки МСК в кардиомиоцитоподобные, фибробластоподобные, остеобластоподобные и адипоцитоподобные клетки.

Адипоцитоподобные клетки, выявляемые по окраске суданом III, образовывались спонтанно при культивировании МСК более двух месяцев в среде с 10% фетальной сывороткой и добавлением в неё только инсулина и дексаметазона.

Кардиомиоцитоподобные клетки образовывались из МСК к концу 4-ой недели культивирования в среде, содержащей фетальную сыворотку и специфические добавки. Для предифференцировки МСК в кардиомиоцитоподобные клетки (КМЦП) необходимо было также на третьи сутки культивирования МСК провести инкубацию их (24-48 часов) в среде, содержащей 3 мкМ 5-азацитидин. Мы показали, что к концу 4-ой недели культивирования наблюдается появление структур, напоминающих миотрубочки поверх слоя фибробластоподобных клеток. Часть клеток (~1-2%) к концу 5-ой недели содержали от одного до нескольких ядер и спонтанно сокращались.

При пересеве клеток спонтанные сокращения пропадали и появлялись вновь после образования монослоя фибробластоподобных клеток. Эти данные заставили нас предположить, что получить чистую клонированную культуру нетрансформированных клеток, дифференцированных только в одном заданном направлении, не представляется возможным, подобно тому, как это происходит при дифференцировке в нейрональном направлении эмбриональных стволовых клеток (В.С.Репин и др. 2002). Очевидно, в культуре всегда должны присутствовать фидерные элементы, поддерживающие выживание и жизнеспособность дифференцирующихся и уже дифференцированных клеток в специфическом направлении. Для получения прямых доказательств миогенной дифференцировки МСК нами было проведено окрашивание клеток в культуре на кардиоспецифический белок – тропонин I крысы, морской свинки и человека. Было установлено, что уже к концу 3-ей недели культивирования в 25-30% клеток животных и человека выявляется кардиоспецифический белок тропонин I; при увеличении сроков культивирования до 5 недель количество клеток, продуцирующих тропонин I, возрастает до 35-40% от общего количества клеток, но при дальнейшем увеличении сроков культивирования МСК процент тропонин-позитивных клеток не изменялся. В отличие от тропонина I в кардиомиоцитах быка и кролика, где этот белок был четко структурирован и находился в пространстве между поперечной исчерченностью клеток – тропонин I в МСК из КМ выявлялся в цитоплазме в виде диффузного свечения флуоресцентной метки и не имел четкой структурной локализации. Использование кардиоспецифической метки на тропонин I позволило нам таким образом не только установить факт дифференцировки клеток в КМЦП, но и установить сроки его запуска (конец 2-ой, начало 3-ей недели).

Остеобластоподобные клетки начинали образовываться из МСК на 7-10 сутки их культивирования в среде Iskov’s (DMEM) с добавками - индукторами остеогенной дифференцировки (Midy V, Plouet J., 1994; Bae S.C, et. al. 2001). C помощью маркеров остеогенной дифференцировки в культуре пролиферирующих МСК уже на 7-е сутки выявляется коллаген I типа, а на 14-е сутки – высокая активность щелочной фосфатазы и наличие остеопонтина.

Выявление кальций фосфатных кристаллов на 24-е сутки остеогенной дифференцировки является отражением высокой функциональной активности клеток, вошедших в процесс остеогенеза.

Между тем, сроком запуска остеогенной дифференцировки клеток следует, по нашим данным считать начало или конец 2-ой недели культивирования, так как именно к 14 суткам в клетках отмечается высокая активность щелочной фосфатазы и появление остеопонтина.

Фибробластоподобные клетки из МСК образуются постоянно в культуре, как фидерные клетки, вне зависимости от состава среды и обработки 5-азацитидином. Однако, их процентное содержание в культуре зависит от присутствия в среде факторов роста, гормональных и специфических добавок.

На активность дифференцировки МСК в культуре в другие типы клеток оказывает также влияние исходное содержание молодых развивающихся МСК, несущих поверхностный антиген СD133, который характеризует пластические возможности клеток. Кроме того, важным условием дифференцировки и пролиферации клеточных культур является моделирование для них условий микроокружения, которое, по-видимому, играет важную роль в реализации эффекта “homing”. Так как МСК являются распластывающимися и прикрепляющимися клетками, то при культивировании КМЦП клеток обычно используют адгезирующий пластик или коллаген; для фибробластоподобных клеток - адгезирующий пластик и биодеградируемые пленки; при культивировании остеобластоподобных клеток – необходимо использовать трехмерный матрикс: коллагеновую губку и различные типы деминерализованных костей.

Для обоснования оптимальной стадии дифференцировки клеток перед их трансплантацией, нами на коллагенизированную поверхность были посеяны МСК в концентрации 8х10³ клеток/см² в дифференцировочной среде для образования КМЦП клеток. В течение 8 недель в динамике определялись количество жизнеспособных клеток (окраска трипановым синим) и дифференцированных (окраска на тропонин I) клеток без пересева. Было установлено, что начиная с 4-ой недели культивирования МСК начинается отчетливая гибель клеток в культуре и резкое нарастание количества дифференцированных клеток, что сопровождается снижением их пролиферативной активности. Проведенные наблюдения позволили прийти к заключению, что для предифференцировки МСК (КМЦП, ОБПК) целесообразно использовать короткие сроки культивирования – не более 3 недель, так как в течение этого срока завершается образование 75% монослоя (т.е. идет активный пролиферативный процесс) и уже начинается реализация процесса клеточной дифференцировки.

Если исходить из того, что регенерационные эффекты МСК и клеток гемопоэтической фракции КМ должны реализоваться в том числе за счет продукции ими в окружающую среду широкого спектра регуляторных цитокинов – интерлейкинов и ростовых факторов, то можно думать, что при глубокой степени повреждения органов нарушена не только воспринимающая, индукционная и пролиферативная активность регионарных прогениторных клеток, но и снижена функциональная активность всех прогениторных клеток костного мозга. Для проверки этого предположения нами исследовалась биологическая активность клеток КМ по продукции ими в культуральную среду некоторых цитокинов через 5 суток культивирования; кроме того был изучен фенотип неприкрепившехся клеток КМ до и после 8 суточного культивирования. Оказалось, что в процессе культивирования клетки начинают активно секретировать цитокины (TGFβ, G-CSF и IL-10). Кроме того, в процессе культивирования меняется фенотипический состав клеток: увеличивается доля клеток, несущих рецептор IL-2 (CD25), повышается содержание клеток с поверхностными антигенами CD3, CD4, CD8, CD38, CD54, CD95, CD11b.

II. Использование стволовых и прогениторных клеток костного мозга для восстановления структуры и функции поврежденных органов и тканей в эксперименте.

Исследования были проведены в острых модельных опытах с повреждением миокарда, кожи и лучевой кости, а так же в опытах с моделированием хронической алиментарной дислипидемии.

Характеристика процесса регенерации миокарда после криодеструкции и трансплантации клеток в принекротическую зону.

В 4-х группах опытов были получены ответы на два основных вопроса: уменьшаются ли размеры зоны повреждения левого желудочка после клеточной терапии и существуют ли различия в регенерации миокарда под влиянием аутологичных предифференцированных МСК КМ и аллогенных фетальных кардиомиоцитов.

Исследования показали, что после моделирования сердечной недостаточности методом КД на 30 сутки в зоне повреждения ЛЖ происходило формирование рубцовой ткани округлой формы диаметром 6-7 мм со стороны эпикарда и 3 мм со стороны эндокарда; толщина стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1мм. Нами не было выявлено различий в форме и размерах рубца у животных 2, 3 и 4 групп, но было выявлено достоверное снижение относительной массы миокарда свободной стенки ЛЖ и относительной массы миокарда ЛЖ во 2-й группе с КД по-сравнению с 1-й группой животных с интактными сердцами. Снижение мышечной массы ЛЖ после КД неизбежно должно было привести к снижению его сократительной активности.

Исследование насосной функции сердца в стендовых условиях подтвердило, что через 1 месяц после КД (вторая группа опытов) действительно происходит снижение сократительных свойств ЛЖ по сравнению с интактными сердцами (1 группа опытов), однако выявить эти различия удаётся только при последовательном воздействии нагрузок на миокард – сначала объемом перфузионного раствора на ЛЖ (т.н. преднагрузка), режимы 1-3 а затем повышением сопротивления на выходе из ЛЖ в аорту (режимы 4-8). Изменения в функциональных показателях миокарда выявлялись как при измерении их абсолютных значений, так и при оценке их относительных изменений, что позволяло нивелировать индивидуальные различия абсолютных значений исследуемых показателей в разных группах.

При исследовании насосной функции сердец 3 и 4 групп, которым в принекротическую зону трансплантировали клетки, было установлено, что эти сердца при воздействии нагрузочных режимов проявляли более выраженную способность обеспечивать норму функции миокарда на единицу веса ткани сердца по сравнению с поврежденными сердцами без клеточной терапии (2 группа), приближаясь к значениям исследуемых показателей у интактных сердец (1 группа). Анализ результатов изучения функции миокарда левого желудочка у животных разных групп при воздействии нагрузочных режимов позволил заключить: 1) Исследование насосной функции изолированных интактных и поврежденных сердец на стендовой установке в условиях применения дозированных пред - и постнагрузок на ЛЖ позволяет выявить признаки скрытой ЛЖ-недостаточности в криоповрежденных сердцах и ослабление повреждения миокарда при трансплантации в него ФКМЦ и ПМСК КМ; 2) Через 3 недели после трансплантации ФКМЦ и ПМСК КМ (группы 3 и 4) некоторые показатели насосной функции ЛЖ либо не отличались от аналогичных показателей у интактных сердец (1-я группа), либо были достоверно выше, чем в контроле – при КД (группа 2); 3) ФКМЦ и ПМСК КМ, трансплантированные в миокард, повышают систолическую функцию ЛЖ в режиме последовательного повышения преднагрузок. Трансплантация ПМСК КМ повышает устойчивость миокарда и к воздействию постнагрузок; 4) Повышение функциональной активности поврежденного сердца после трансплантации клеток, связано с длительным присутствием в миокарде (по крайней мере, в течение 3 недель) жизнеспособных аллогенных ФКМЦ и аутологичных ПМСК КМ (данные получены при трансплантации клеток, меченных геном LacZ из E.Coli, кодирующей β-галактозидазу).

Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

В 4-х группах опытов на крысах с моделированием глубоких ожоговых ран методом ТД и трансплантации аллогенных ФМСК, аутогенных ФМСК и аллогенных ФФ сравнивали динамику заживления ожоговых ран.

Проведенные эксперименты показали, что: 1) Алло- и аутогенные ФМСК, так же как и ФФ, ускоряют темп регенерации глубоких ожоговых ран по сравнению с контролем (спонтанная регенерация) за счет длительного сохранения жизнедеятельности этих клеток в ране после трансплантации (данные получены при трансплантации клеток, меченных геном LacZ из E.Coli, кодирующей β-галактозидазу); 2) Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных клеток по сравнению с контролем сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани в зоне ожоговой поверхности; 3) При выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать ФМСК, так как использование ФМСК по сравнению с ФФ характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговых ран; 4) Отсутствие достоверных различий в регенерационной активности алло- и ауто-ФМСК указывает на возможность использования аллогенных ФМСК для стимуляции ускоренного заживления ожоговых ран.

Характеристика процесса регенерации трубчатых костей после резекции и применения деминерализованных костных имплантатов с иммобилизированными предифференцированными МСК КМ.

В 3-х группах опытов у кошек с резекцией лучевой кости имплантировали деминерализованную кость с аутологичными МСК и имплантат закрывали надкостницей (I группа) и мышцей (II группа) или имплантировали деминерализованную кость без МСК и имплантат закрывали надкостницей.

В проведенных экспериментах было показано, что: 1) Предифференцированные МСК, иммобилизованные на поверхности деминерализованных имплантатов костной ткани, ускоряют процесс восстановительной регенерации после обширной резекции трубчатых костей по сравнению с использованием костных имплантатов без МСК; 2) При восстановительной регенерации костной ткани после обширных резекций трубчатых костей обнаружен процесс энхондрального остеогенеза; 3) Процесс энхондрального остеогенеза более выражен при использовании имплантатов без МСК, но при использовании имплантатов с иммобилизованными МСК он также имеет место.

На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым матриксом с адгезированными на нем аутологичными клетками костного мозга получен патент РФ №2240135 от 20.11. 2004 г.

Коррекция хронической дислипидемии и ранних стадий атерогенеза путем однократного применения аллогенных клеток фетальной печени и мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга.

В 4-х группах опытов на морских свинках: у интактных животных, морских свинок на атерогенной диете (АТД), у морских свинок на АТД и терапии клетками фетальной печени (КФП), а также у морских свинок на АТД и терапии клетками мононуклеарной фракции ККМ – исследовали состояние липидного обмена, проводили морфометрию микрососудов, а также морфологические исследования состояния печени. Было обнаружено, что: 1) Трансплантация прекультивированных аутологичных ККМ и свежевыделенных аллогенных КФП обеспечивает коррекцию ранних проявлений хронической ДЛП и атерогенеза. Даже в условиях продолжающейся АТД на фоне применения клеточной терапии: ослабляются морфологические признаки дислипидогенной микроангиопатии (снижается выраженность сужения сосудов приносящего звена, уменьшаются спазмы артериол и дилятация венул), уменьшаются признаки неспецифического воспаления и жировой дистрофии печени, которые возникают при моделировании хронической ДЛП и атерогенеза. 2) Корригирующий эффект при аутотрансплантации ККМ животным с ДЛП и ранними проявлениями атерогенеза более выражен и более пролонгирован, чем при аллотрансплантации КФП.

Выводы.

1. Отработана методика раздельного выделения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных (стромальных) стволовых и прогениторных клеток костного мозга, что подтверждено фенотипическими и иммуногистохимическими исследованиями.
   
2. Отработаны режимы предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, фибробластоподобные и остеобластоподобные клетки, что подтверждено иммуногистохимическими методами.
   
3. Маркирование клеток с помощью рекомбинантного вируса, несущего ген E.coli Lac-Z [Ad-SV40- βGal], позволяет выявлять жизнеспособные клетки после трансплантации их в мягкие ткани до 1,5 месяцев.
   
4. Трансплантация аутологических ПМСК костного мозга, предифференцированных в кардиомиоцитоподобные клетки, более эффективно стимулирует процессы восстановительной регенерации миокарда после криодеструкции, чем трансплантация фетальных аллогенных кардиомиоцитов.
   
5. Трансплантация ауто- и аллогенных фибробластоподобных МСК обеспечивает более быстрое и эффективное заживление глубоких ожоговых ран после термодеструкции, чем фетальные фибробласты. Предифференцированные МСК, также как и фетальные фибробласты способствуют заживлению ран путем ускорения разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани.
   
6. Применение аллогенных деминерализованных костных имплантатов с иммобилизованными на них аутологичными остеобластоподобными клетками, предифференцированными из МСК костного мозга, достоверно ускоряет процесс восстановительной регенерации костной ткани после резекции трубчатых костей.
   
7. Трансплантация аутологических прекультивированных клеток костного мозга обеспечивает коррекцию ранних проявлений атеросклероза и ослабление морфологических признаков микроангиопатий и жировой дистрофии печени при моделировании хронической алиментарной дислипидемии более эффективно и более длительно, чем при трансплантации клеток фетальной печени.
   

Практические рекомендации

1. Для проведения клеточной терапии аутологичными прогениторными клетками КМ целесообразно использовать предварительное культивирование.
   
2. Для трансплантации предифференцированных МСК (кардиомиоцито- и остеобластоподобных) следует использовать короткие сроки дифференцировки (не более 3 недель), когда образуется 75% монослой и начинает осуществляться дифференцировка клеток в заданном направлении.
   
3. Регенераторные свойства стволовых и прогениторных клеток аутологичного костного мозга могут успешно применяться при различных острых патологиях (резекция кости, ожоговые раны, острый инфаркт миокарда). При хронических патологиях применение клеточной терапии следует рекомендовать после предварительного выявления в используемых клетках регенераторных (функциональных) резервов. При отсутствии достаточного резерва - клеточная терапия может оказаться малоэффективной.
   
4. Для оптимизации условий трансплантации остеобластоподобных и фибробластоподобных клеток следует использовать не клеточные суспензии, а биоконструкции, состоящие из биодеградируемых материалов (типа ЭластоПОБ) или матриксов с иммобилизованными на них предифференцированными МСК.
   

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Потапов И.В, Онищенко Н.А, Крашенинников М.Е. «Клеточная кардиомиопластика». Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2. с. 54-62.
   
2. Берсенёв А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко А.Н.. «Клеточная терапия дислипидемии и атеросклероза.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2. с. 47-53.
   
3. М.Ф. Расулов, М.Е.Крашенинников, Н.А.Онищенко «Применение аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для биопластических операций при обширных ожогах.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2002. №3. с. 90-91.
   
4. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. «Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов.» Вестник трансплантации и иск. органов 2002. N4. с. 3-6.
   
5. В.И. Шумаков, М.Ф. Расулов, М.Е.Крашенинников и др. «Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2002. №4. с. 7-11.
   
6. В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников и др. «Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито-подобные клетки у различных видов млекопитающих.» Бюлл.эксперим.биол.мед. 2003. N4. с. 461-465.
   
7. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н.,Честухин В.В., Крашенинников М.Е. и др. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда.» Российский кардиологический журнал 2003. №5. с. 42-50.
   
8. В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко, М.Ф.Расулов, М.Е.Крашенинников и др. «Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга эффективнее эмбриональных фибробластов стимулируют регенерацию глубоких ожоговых ран.» Бюлл. эксперим. биол. мед. 2003, т. 136. № 8. с. 220-223.
   
9. В.И. Шумаков, Н.А.Онищенко М.Ф. Расулов, М.Е. Крашенинников и др. «Использование предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения глубоких ожоговых ран.». Вестник хирургии им И.И. Грекова. 2003. т.162. № 4. с. 38-41.
   
10. Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. «Фибробластоподобные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга подобно эмбриональным фибробластам стимулируют заживление поверхностных ожоговых ран.» Вестник трансплантологии и иск.органов. 2003. №4. с. 7-11.
    
11. В.Л. Зорин, М.Е. Крашенинников, В.И. Фролов, Н.А.Онищенко и др. «Использование иммобилизованных предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для регенерации трубчатых костей при обширных резекциях.» Вестник трансплантологии и искусственных органов 2004. №1. с. 37-40.
    
12. Н.А.Онищенко, И.В.Потапов, Л.В.Башкина, М.Е.Крашенинников и др. «Восстановление сократительной функции криоповрежденного миокарда крыс после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и предифференцированных стромальных стволовых клеток костного мозга.» Бюлл.эксперим.биол.мед. 2004. N10. Т.138. с. 403-407.
    
13. Долгих М.С., Григорьева А.Ю., Жигулин А.О.,Зайденов В.А., Расулов М.Ф., Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. «Применение рекомбинантной аденовирусной конструкции ADSV-40- Gal для мониторинга трансплантированных клеток.» Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. т.51. N3.
    
14. Е.Н.Остроумов, М.Е.Крашенинников, С.В.Гуреев и др. «Визуализация распределения в миокарде аутологичных стволовых клеток костного мозга при их интракоронарном или интрамиокардиальном введении больным ИБС.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2004. N1. c.26-29.
    
15. Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников. «Современные представления о биологии стволовых клеток костного мозга и крови в аспекте их клинического применения.» Вестник трансплантологии и иск.органов. 2004. N3. c.50-57.
    
16. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Быстров В.А., Бриль А.Г., Абалмасов К.Г. Патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».
    
17. М.Ф.Расулов, А.В.Васильченков, Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников и др. «Первый опыт применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения больной с глубокими ожоговыми ранами кожи.» Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. №. 1. c.42-46.
    
18. N.A. Onischenko, M.E. Krasheninnikov, M.F.Rasulov et. al.«Tissue Engineering approaches for treatment of organ disfunction, by bone marrow-derived mesenchimal stem cells.» Tissue Engineering. 2003. N 9(4). p. 788.
    
19. N.A. Onischenko, M.E. Krasheninnikov, M.F.Rasulov, I.V.Potapov et al. «Experimental models and technological approach for the estimation of therapeutic efficiency of organ dysfunction, by marrow-derived mesenchimal stem cells.» Int.J.Artif.Organs. 2003. N.26 (7). p. 563.
    
20. Egorova V.A.,Nemets E.A., Krasheninnikov M.E.,Onischenko N.A et. al. «Matrix on the basis of polyhydroxybutyrate copolymers for bioartificial tissues.» Macromolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems. 2003, p. 8-11.
    
21. V.I.Shumakov, E.N.Kazakov, S.V.Gureev, N.A.Onischenko, E.N.Ostroumov, A.A.Temnov, M.E.Krasheninnikov et al. «Aortoconorary bypass grafting and autologous bone marrow stem–cell transplantation in the treatment of the ishaemic heart failure.» 12^th World Congress on Heart Disease- New Trends in Research Diagnosis and Treatment, to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver,B.C.,Canada, 2005, p. 16-19.