Учебное пособие министерство Российской Федерации по связи и информатизации Санкт-Петербургский государственный университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича

Вид материала

Учебное пособие

Содержание 3. Измерительные преобразователи биосенсорных систем. 3.1.4. Турбидиметрические и нефелометрические Волоконно-оптические ИП. Волоконно-оптические ИК ИП. Поверхностный плазмонный резонанс Nл – число квантов люминесценции, N Приборы для оценки токсичности воды и почвы

Подобный материал:

• Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 30.2kb.
• Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 39.82kb.
• М. А. Бонч-Бруевича Кафедра опдс бочелюк Т. В., Доронин Е. М. «Назначение и примеры, 612.04kb.
• Петербургский Государственный Университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича, 55.39kb.
• «мобильная связь», 49.1kb.
• Название доклада: универсальный, 63.37kb.
• Проблемы формирования учебно-методического комплекса, 151.02kb.
• Название учреждения, 806kb.
• Дорогие друзья и коллеги!, 15.57kb.
• Федеральное агентство связи государственное образовательное учреждение, 361.18kb.

3. Измерительные преобразователи биосенсорных систем.

При формировании БСС используются самые различные типы физико-химических преобразователей – оптические, электрохимические, гравиметрические, микроаналитические, механические.

Применение измерительных преобразователей (ИП) зависит от того, какие свойства БХП изменяются при воздействии на них веществ или физических полей.

3.1. Оптические

3.1.1. Денситометрические

Денситометры измеряют оптическую плотность среды:

D = –lg(Ф_пр/Ф₀),

(26)

где Ф₀ и Ф_пр – падающие на среду и прошедшие через нее потоки.

Оптическая плотность определяется свойством вещества поглощать или рассеивать излучение. Например, в случае образования окрашенного соединения в результате ферментативной реакции.

Примером использования денситометрического ИП в сочетании с БХП антиген–антитело–фермент (п. 2.5.6) является фотометр для иммуноферментного анализа ELISA [21]. Это БСС, измеряющая малые значения ослабления проходящего потока. Обычно из спектра мощного источника излучения (галогенной лампы) с помощью светофильтра выделяется необходимый диапазон длин волн. Поток, прошедший через светофильтр, распределяется с помощью световодов по восьми каналам измерительных фотометров. На выходе световодов линзы формируют тонкий вертикальный луч, проходящий через лунки планшета на фотоприемники. Измеренная оптическая плотность ячеек планшета зависит от наличия антител в тестируемой пробе крови. Более подробное описание работы данной БСС приведено в разд. 4.

3.1.2. Колориметрические

Колориметры – приборы, измеряющие концентрацию C оптически однородного вещества по оптической плотности D окрашенного раствора.

Для этого в среду с БХП добавляют химическое вещество, которое, соединяясь с субстратом или продуктом БХП, образует равномерно окрашенный раствор. Его оптическая плотность, согласно закону Бэра:

D = C e b,

(27)

где e – коэффициент экстинкции (удельного пропускания) окрашенного раствора (постоянная величина), b – толщина слоя раствора.

ИП этого типа применяют в БСС для оценки переработки углерода, в котором в качестве БХП используются ферменты аэробных бактерий (п. 1.2.2), перерабатывающие соединения углерода с выделением продукта СО₂. Индикатор на основе раствора Ba(OH)₂ образует с продуктом БХП цветной раствор соли.

В БСС для оценки активности биологического окисления аналогичный ИП используется с другим БХП на основе фермента сукцинатдегидрогеназы, выделенного из митохондрий разрушенных и гомогенизированных клеток печени (п. 1.2.2). Фермент катализирует реакцию преобразования субстрата (янтарной кислоты) в продукт (фумаровую кислоту). Индикатор на основе хлорфенольного соединения образует с субстратом цветную растворимую соль, оптическая плотность которой уменьшается по мере разложения субстрата.

3.1.3. Спектрофотометрические

Спектрофометры состоят из: источника излучения с широким диапазоном длин волн; монохроматора с призмой, разлагающей излучение в спектр, из которого выделяется необходимый участок с помощью регулируемой щели; фотоприемника, измеряющего прошедший через щель поток в диапазоне длин волн lD.

Спектрофотометры позволяют обнаружить вещество по спектру поглощения, а также идентифицировать штаммы бактерий по различию их спектров поглощения в инфракрасной области длин волн, или нуклеиновые кислоты по спектру поглощения в ультрафиолетовом диапазоне.

Эти ИП применяют в БСС для оценки воздействия загрязнений воды на фотосинтез (п. 1.2.1). В этом случае используется БХП на основе фотосинтезирующего пигмента (хлорофилла-а), выделенного из тканей растений (п. 2.5.3). С помощью ИП измеряют спектр поглощения пигментом видимого света [43].

ИП могут также применяться в БСС для оценки метаболизма (п. 1.1.3) с БХП на основе ферментов (п. 2.5.1), когда различны спектры поглощения субстрата и продукта ферментативной реакции.

3.1.4. Турбидиметрические и нефелометрические

БО в питательной среде при падении на них светового потока создают эффект рассеяния. При прохождении через мутную среду с большой концентрацией БО световой поток ослабляется. Чем более мутная среда (т. е. чем больше концентрация в ней БО), тем меньше проходящий через нее поток излучения.

Рассеяние излучения БО зависит [23, 54] от следующих факторов:

• соотношения радиуса а и длины волны l падающего на них излучения, т. е. от коэффициента дифракции r₀ =2pa/l;
  
• площади оптического сечения S_БО, пропорциональной pa²
  
• сотношения показателей преломления частицы n_БО и среды n_с (m_БО= n_БО/n_с);
  
•   концентрации С_БО в единице объема.
  

Концентрацию БО, образующих мутный слой толщиной b и ослабляющий излучение, измеряют турбидиметрами (от лат. «турбид» – мутность). Полезный сигнал турбидиметра пропорционален exp(– CS_БО b).

Если БО не создают мутного слоя, то их концентрацию измеряют нефелометрами ( от лат. «нефело» – облако), улавливая рассеянный ими поток под углом к падающему излучению. При условии, что m_БО » 1, а плотность частиц в объеме невелика, полезный сигнал нефелометра пропорционален kC, где k – константа прибора.

При увеличении размеров БО меняется распределение интенсивности рассеянного света под разными углами. Вперед рассеивается больше, чем назад. Этот эффект позволяет изучать изменение морфологии БО (размеров, формы).

Турбидиметры используют в БСС, разработанных фирмами «Abbott» и «ROSHE» для контроля активности антибиотиков с БХП на основе роста-размножения бактерий. Нефелометры для аналогичных целей с измерением разности рассеянных потоков на малых и средних углах были разработаны фирмой «Science spectrum» [18].

3.1.5. Рефлектометрические

Метод рефлектометрии основан на измерении потока излучения, отраженного от поверхности БО. Если эта поверхность одновременно рассеивает и поглощает излучение, то отраженный поток будет отбрасываться в разные стороны. Чтобы собрать это излучение, измерения проводят в шаре с отражающими шероховатыми стенками. Тогда фотоприемник внутри шара будет улавливать рассеянный поток, интенсивность которого определяется как

J = Ф₀(r_бО /S)[1/(1 – r_ст)]

(28)

где Ф₀ – поток, падающий на БО, S – площадь шара, r_бО, r_ст – коэффициенты отражения БО и стенки соответственно.

В свою очередь коэффициент отражения рассеянного света определяется по эмпирической формуле Кубелки-Мунка-Гуревича:

(1 – r_бО)²/ 2r_бО = c /s,

(29)

где c – коэффициент поглощения слоя вещества, s – показатель рассеяния слоя. Более подробно ИП описан в работах проф. А.П. Иванова.

Данный ИП используется в БСС для оценки загрязнений окружающей среды с БХП на основе фотосинтезирующих пигментов, находящихся в тканях листьев. Для этой цели в фотометрический шар помещают стопку листьев и измеряют отраженный поток. Листья перекладывают в случайном порядке N раз, в результате получают множество величин Ф_отр1 … Ф_отрN, характеризующих распределение фотосинтезирующих пигментов. Подобный вид приборов начинает разрабатывать фирма «ЛОМО» (С-Петербург).

3.1.6. Рефрактометрические

Рефрактометры – приборы для измерения показателя преломления (ПП) среды. Методы измерения, применяемые в БСС, получили общее название ИП нарушения полного внутреннего отражения (НПВО). Этот эффект возникает как в оптических волокнах, так и в призмах при падении света под углом.

Волоконно-оптические ИП. Основаны на нарушении прохождения светового потока через оптическое волокно, изогнутое в форме петли. Эффект НПВО возникает, когда ПП среды n_с, окружающей стеклянное волокно, будет больше ПП этого волокна n_в.

Уменьшение потока DФ за счет НПВО, обусловленного выходом части излучения в оболочку:

DФ= k (n_с – n_в),

(30)

где k – коэффициент пропорциональности.

Данный ИП может применяться в БСС для оценки метаболизма с БХП на основе ферментов, если ПП субстрата меньше ПП стекла, а ПП продукта, образованного в результате ферментативной реакции, всего на 10^–7 больше ПП стекла.

НПВО происходит, когда среда непосредственно контактирует с материалом оптической нити. Поэтому эффект НПВО возникает также при осаждении на волоконную нить слоя биомолекул (рис. 6), что позволяет контролировать реакции образования биологических комплексов [69].

Волоконно-оптические ИК ИП. Полезным эффектом НПВО, связанным с применением волоконной оптики в БСС, является выход излучения из световода в среду, поглощающую инфракрасное излучение. Тогда оптическая плотность волоконного ИП:

D = a_вL + f (a_{ИК с}),

(31)



Рис. 6. Биосенсор на основе оптического волокна [3]



Рис. 7.  Возбуждение излучательных плазмонов методом НПВО в призме Кречмана:  - угол падения света; n1, n2, 3 - показатели преломления призмы, слоя металла и исследуемого образца соответственно [3]



Рис. 8. Схема образования комплексов биомолекул в измерителях поверхностного плазмонного резонанса [59]

где L – длина световода, a_в – коэффициент поглощения волокна, a_ИК с – коэффициент поглощения среды в ИК области излучения. Через волокно подается излучение различных длин волн ИК-спектра. Учитывая, что многие микроорганизмы обладают специфичными ИК-спектрами, волоконная ИК-спектроскопия может использоваться для выявления изменений свойств биологических объектов.

Поверхностный плазмонный резонанс [3, 25, 56, 59, 60]. Эффект НПВО в треугольной призме при падении инфракрасного излучения на ее основание проявляется, если оно покрыто тонкой пленкой металла или полупроводника, на которой возникают плазмоны – квантовые колебания поверхностных зарядов.

Их влияние приводит к тому, что интенсивность отраженного излучения спектра при определенном угле падения резко падает. Значение данного угла зависит от ПП приповерхностного слоя (рис. 7). Положение минимума отраженного потока смещается даже при изменении ПП слоя всего на 10^–10.

Эти сверхмалые изменения отражают, например, образование комплекса антиген-антитело (п. 2.5.5) или трансформацию комплексов биомолекул на поверхности тонкой пленки золота. Подобный метод (surface plasmon resonance) был разработан в 1970-е гг. Лидбергом для выявления способности биологических организмов к образованию комплексов.

На основе этого метода для иммуноанализа шведской фирмой Pharmacia Biosensor AB создана [25,59] БСС «BIACORE» (рис. 8), а фирмой Аffinity Sensor для аналогичных целей – БСС «IASys» [60] с БХП на основе реакции антиген–антитело.

Это фотометрические БСС либо с проточной подачей антител (BIACORE), либо с нанесенными антителами на стенку стандартной кюветы (IASys). В них предусмотрена система подготовки поверхностей пластинок для иммобилизации антител, антигенов, микроорганизмов и клеток. В БСС входят системы перемешивания сред и термостатирования кювет и проточных ячеек.

3.1.7. Флуктуационные

Пусть БО образуют равномерную концентрацию С в среде и движутся в ней, случайно меняя направление. Если с помощью сфокусированного источника излучения сформировать тонкий луч, улавливаемый фотоприемником, то каждое пересечение луча БО, будет создавать флуктуацию оптического потока, которую можно полагать случайным событием, а множество событий – случайным потоком с интенсивностью L. Среднее число m_T таких пересечений БО за время

m_T =L T = kC,

(32)

где k – коэффициент, зависящий от вида БО и параметров просвечиваемого слоя. Приемник преобразует изменения БО светового потока в амплитуду импульсов. На их величину влияет поглощение излучения слоем БО с концентрацией С. Поэтому за время T среднее значение случайного сигнала

U_m(T) = КС exp(–aC),

(33)

где коэффициент К зависит от параметров ИП и времени усреднения T, а a=S_БО b, поскольку характер экспоненциальной зависимости такой же, как и при измерении полезного сигнала турбидиметра (п. 3.1.4).

Многие плавающие инфузории обладают локомоциями (п. 1.4.1), характеризующимися прямолинейными перемещениями со случайным изменением направления (п. 2.3.1). Размеры инфузорий довольно велики (0,1 мм), поэтому «на просвет» можно обнаруживать флуктуации от единичных подвижных инфузорий.

Данный метод применен [17] в БСС типа «БИОТЕСТЕР» для оценки токсичности водных сред с БХП на основе хемотаксиса инфузорий P.caudatum (п. 2.3.1).

3.1.8. Флуктуационно-корреляционные

N движущихся БО, находящихся в лазерном луче, рассеивают свет, создавая случайные флуктуации не только интенсивности излучения, но и его частоты (за счет эффекта Доплера). Множество флуктуаций интенсивности, измеряемых с помощью фотоприемника, образует случайный процесс I(t) .

На него влияют два источника флуктуаций: 1) пересечение БО луча лазера; 2) перемещение БО внутри луча на расстояние, сравнимое с длиной волны лазера. Эти факторы обусловливают [44]появление двух частотных компонент спектральной плотности S(w) [44] случайного процесса:

S (w) = S₁ (w) + S₂ (w).

(34)

Подвижность быстрых БО с небольшими концентрациями в объеме, например сперматозоидов, анализируют по первой ее компонент

S₁ (w)= f (w, v₁, DN ),

(35)

где DN – изменение числа БО в объеме; v₁ – множество скоростей поступательного движения БО на расстояние, большее диаметра луча.

Подвижность малых БО с большой концентрацией и небольшими скоростями (например бактерий с количеством 10⁷ в объеме) исследуют с помощью второй компоненты спектральной плотности:

S₂ (w) = f (w, v₂, Q),

(36)

где v₂ – множество скоростей смещения частиц на расстояние, большее длины волны лазера; Q – коэффициент, характеризующий плотность размещения БО в объеме.

Подобный ИП применен [15] в разработанной во ВНИИМП (Москва) БСС для измерения коэффициента токсичности вытяжек полимеров с БХП на основе локомоций сперматозоидов крупного рогатого скота (п. 2.3.2).

Лазерный зонд с длиной волны 0,6328 мкм создает пучок излучения диаметром 25 мкм. В результате подсчета числа флуктуаций за 10...60 с измеряется показатель подвижники

М_п = ACv₁,

(37)

где С – концентрация подвижных клеток; А – коэффициент, зависящий от конструктивных особенностей прибора и вида биообъекта.

3.1.9. Биолюминометрические

Применение в БХП биолюминесценции и активированной хемилюминесценции рассмотрено в пп. 2.3.2, 2.5.1, 2.5.2. В данном подразделе речь идет лишь о физических основах и средствах измерения люминесценции.

Энергия возбужденного атома (молекулы) может принимать лишь определенный и характерный для данного атома дискретный ряд значений. При переходе с более высокого энергетического уровня Q_M на более низкий Q_N атом (молекула) излучает квант с длиной волны l_MN:

Q_M – Q_N = hc/l_MN,

(38)

где h – постоянная Планка = 6,626·10^–34 Дж·с; с – скорость света = 3 ·10⁸ м/c.

Если люминесценция возникает за счет поглощения атомами излучения, то количественно ее характеризуют

энергетическим выходом:

h_эн = Ф_л/Ф_в,

(39)

где Ф_в – возбуждающий поток, Ф_л – поток люминесценции,

или квантовым выходом:

h_кв = N_л /N_в,

(40)

где N_л – число квантов люминесценции, N_в – число квантов возбуждающего излучения.

Спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждения, поэтому он характеризует исследуемое вещество. Кратковременная люминесценция называется флуоресценцией, долговременная – фосфоресценцией.

Сверхслабая люминесценция БО может усиливаться в присутствии физических или химических веществ-активаторов. Химические активаторы вступают в реакции с органическим веществом, способствуя образованию новых возбужденных молекул, испускающих излучение. Физические активаторы увеличивают величину квантового выхода возбужденной молекулы с сотых долей процентов до единиц процентов и более.

Интенсивность активированной хемилюминесценции:

I_хл = v_хлh_мвh_{кв л},

(41)

где v_хл – скорость протекания химической реакции, h_мв – вероятность образования молекулы в возбужденном состоянии, h_кв л – квантовый выход люминесценции.

Процесс замедленной флуоресценции пигментов фотосинтеза (п. 2.5.3) под действием возбуждающего излучения описывается как сумма экспонент:

Ф(hn) = А exp(–at₁) + В exp(– bt₂),

(42)

где А, В, – амплитуды «быстрой» и «медленной» экспонент; t₁, t₂ – их постоянные времени (t₁ = 10...50 мс, t₂ = 1500...2500 мс), a и b – коэффициенты, зависящие от вида пигментов [43].

ИП для контроля хемолюминесценции не требует возбуждения БО потоком энергии. Для выделения длины волны люминесценции световой поток, излучаемый БО, пропускают через светофильтр и измеряют чувствительными фотоприемниками малых потоков (вакуумными фотоэлектронными умножителями, полупроводниковыми фотодиодами).

ИП для контроля фотолюминесценции включает источник возбуждающего излучения, БО, светофильтр для пропускания люминесценции и фотоприемник. Под действием возбуждающего излучения возникает свечение БО, которое выделяется светофильтром и измеряется фотоприемником.

ИП для контроля замедленной флуоресценции включает: источник освещения с короткими длинами волн; систему оптических затворов; блок для помещения БО; чувствительный фотоприемник, улавливающий излучение в красной области спектра. БО возбуждается источником освещения, поток которого отсекается затвором, после чего измеряется свечение БО.

Следует учитывать, что помимо БО люминесценцией обладают многие вещества: стекло, бумага, картон, текстолит, пластмассы, дерево и др., поэтому при измерениях следует учитывать эффект фоновой люминесценции от вспомогательных материалов.

На основе люминесцентного ИП разработаны различные БСС медицинского и экологического назначения.

а) Оптоды. Современные биотехнологии позволяют иммобилизовывать фермент с активатором люминесценции на одном торце волоконно-оптического световода и измерять свечение фотоприемником, присоединенным к другому торцу. Такие БСС с БХП на основе ферментов получили название оптодов. Первые ферментные оптоды были разработаны еще в 1975 г. для измерения O₂ как фактора, вызывающего биолюминесценцию люциферина (п. 2.5.1). В настоящее время созданы оптоды для обнаружения, помимо О₂, ботулиновых токсинов в пище, кофакторов ферментов (НАДФ, п. 1.2.2), аминокислот, глюкозы, ионов тяжелых металлов, антител, производных бензина [26, 61, 69].

б) Приборы для оценки токсичности воды и почвы. Фирмами Beckman и Microbics на базе люминесцентного ИП спроектирована БСС «Microtox», в которой для оценки загрязнения воды применен БХП со светящимися морскими бактериями. Их люминесценция подавляется токсичными веществами.

В Германии фирмами Carl Ceiss и «DrLANGE» разработана близкая по принципу действия БСС «LUMIStox» для контроля загрязнения почв с БХП на основе люминесцентных морских бактерий.

В России для экологических целей на базе люминесцентного ИП были выпущены БСС:

• «Аналитическая система для интегральной оценки состояния среды обитания человека» с ферментным БХП на основе реакции люциферин-люцифераза (п. 2.3.1);
  
• «Биолюм» с БХП на основе полученных методами генной инженерии (п. 2.2.6) пресноводными светящимися бактериями.
  

в) Экологические биофлуориметры. В экологической практике для измерения с помощью флуоресцентного ИП послесвечения хлорофилла-a используют компьютерно-управляемую БСС «Фотон-7-1» с БХП на основе фотосинтезирующих пигментов.

3.1.10. Жидкокристаллические

Жидкими кристаллами (ЖК) называются жидкости, обладающие, как и кристаллы, анизотропией свойств.

Пусть, например, в жидкости молекулы имеют удлиненную палочкообразную форму. Первоначально силы межмолекулярного взаимодействия выстраивают их параллельно друг другу. При всех перемещениях молекул ЖК у них сохраняется направление длинных осей. В результате у такой жидкости будут различные характеристики в разных направлениях (анизотропия). Если участки длинных молекул, кроме того, повернуты по спирали относительно друг друга, то такой кристалл называется холестерическим (ХЖК), так как сходная структура была обнаружена у холестерина.

Повернутые участки молекул ХЖК отражают видимый свет только с определенной длиной волны, что обусловливает целый ряд физических эффектов, связанных с изменением окраски ХЖК, которая меняется при:

• изменении угла наблюдения, когда, освещенный белым цветом, он при повороте начинает переливаться всеми цветами радуги;
  
• приложении электрического напряжения;
  
• изменении температуры, меняющей шаг спирали;
  
• воздействии паров различных химических веществ на структуру кристалла; с помощью ХЖК можно обнаруживать миллионную объемную долю пара химического вещества в воздухе.
  

Двухспиральные молекулы ДНК, выделенные в виде однородного вещества методом центрифугирования (п 2.4.2), обладают свойствами ХЖК (п. 2.5.4), что позволяет использовать ДНК как БХП и ИП одновременно [13].

Эти свойства в перспективе позволяют создать новые ДНК-зонды для обнаружения причин наследственных болезней (п. 2.5.4). Оптический сигнал, получаемый при взаимодействии ХЖК (ДНК) с излучением, можно передавать, например, по оптоволокну и создавать на этом принципе ДНК-оптоды [3].