Учебное пособие министерство Российской Федерации по связи и информатизации Санкт-Петербургский государственный университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича
| Вид материала | Учебное пособие |
- Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 30.2kb.
- Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 39.82kb.
- М. А. Бонч-Бруевича Кафедра опдс бочелюк Т. В., Доронин Е. М. «Назначение и примеры, 612.04kb.
- Петербургский Государственный Университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича, 55.39kb.
- «мобильная связь», 49.1kb.
- Название доклада: универсальный, 63.37kb.
- Проблемы формирования учебно-методического комплекса, 151.02kb.
- Название учреждения, 806kb.
- Дорогие друзья и коллеги!, 15.57kb.
- Федеральное агентство связи государственное образовательное учреждение, 361.18kb.
3.3. Гравиметрические
Гравиметрическими называют ИП, измеряющие силу тяжести. При многих ферментативных реакциях масса исходного субстрата уменьшается за счет выделения газов или происходит выпадение осадка.
Гравиметрические ИП могут быть основаны на различных способах измерения: частоты маятника с массой m; массы продукта m, выделившегося в процессе электролиза на электроде (электрогравиметрия); частоты колебаний акустической мембраны с массой m (акустическая гравиметрия).
В БСС последний тип ИП с мембраной из пьезокристалла нашел наибольшее распространение [22, 42, 57].
Пьезоэлектрические кристаллы обладают прямым пьезоэффектом (образование зарядов на поверхности твердого тела под воздействием механических напряжений) и обратным (изменение размеров кристалла при подаче напряжения). Поэтому такие кристаллы могут быть использованы в качестве преобразователей в БСС благодаря их способности генерировать и передавать акустические волны, изменение резонансной частоты которых зависит от биомассы на поверхности кристала:
(53)
где fр – резонансная частота кристалла, m – масса кристаллического покрытия, А – площадь кристалла, k – коэффициент пропорциональности.
Известны два класса акустических преобразователей: передающие акустическую волну с одной стороны кристалла на другую (bulk-wave, объемноволновые устройства) и передающие акустическую волну по одной грани кристала (surface acoustic wave, поверхностные акустические волны – ПАВ).
В основе работы большинства приборов на ПАВ лежат три физических процесса: 1) преобразование входного электрического сигнала в акустическую волну; 2) распространение акустической волны вдоль поверхности кристалла; 3) обратное преобразование ПАВ в электрический сигнал.
Чаще всего для измерения частоты используют подсчет периода колебаний с помощью сверхбыстрых счетчиков. Информативным параметром является отличие распределения частоты от нормального распределения.
В Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте разработан способ детекции биологических макромолекул с помощью БСС. Способ включает иммобилизацию слоев макромолекул на поверхности кварцевого резонатора, помещенного в вакуум, и последовательную регистрацию резонансных частот после нанесения каждого биослоя [42].
На основе акустических ИП разрабатываются иммуносенсоры [57]. На поверхности кварцевого резонатора, покрытого золотой пленкой, иммобилизируют антитела (иммуноглобулины), а в качестве источников антигенов – микробные клетки. Антитела связывают белки клеток, при этом масса на поверхности увеличивается, а резонансная частота уменьшается на тысячные доли процента, что и фиксирует ИП.
3.4. Калориметрические
При некоторых ферментативных реакциях [3] выделяется 25...100 кДж/моль тепла (п. 2.5.1) Обычно это величина зависит от типа реакции и достаточно стабильна. Выделенное тепло расходуется на нагрев поверхности, на которой иммобилизован фермент, или на нагрев среды, контактирующей с продуктами реакции.
Нагрев поверхности или среды контролируется с помощью измерительного прибора, например полупроводникового терморезистора (термистора), сопротивление которого выражается формулой:
RT = RT1 exp B [(1/T) – (1/T1)
(54)
где RT и RT1 – сопротивления термистора при температурах (K) T и Т1 соответственно, B – константа (K) для данного типа термистора.
Термистором можно измерить температуру с точностью до 0,01–0,001°, что обеспечивает чувствительность обнаружения вещества на уровне 0,1 ммоль. Достоинствами калориметрического ИП являются обеспечение возможности контроля тепловыделения как в течение длительного времени, так и в проточных режимах. Обычно в зарубежных разработках БСС используют термисторы фирмы Victory Engeneering Corp.
Типичная проточная БСС с калориметрическим ИП состоит из термостата для ферментного анализа, проточной системы, омывающей фермент, измерительного блока с термистором для контроля температуры жидкости.
Главной проблемой становится теплоизоляция реакции от окружающей среды, что требует создания дорогостоящего оборудования для термостатирования и большого расхода компонентов ферментативной реакции для обеспечения необходимого тепловыделения.
Калориметрические ИП – одни из самых ранних видов ИП в экспериментальных БСС после амперометрических. С их помощью проведены многочисленные эксперименты по обнаружению различных видов веществ (табл. 9). Чувствительность систем повышают за счет создания цепочек реакций, когда продукт, например H2O2, при окислении глюкозы дополнительно разлагают каталазой, увеличивая тепловыделение или используя многократное омывание фермента субстратом. Тем не менее пока БСС с калориметрическими ИП не вышли на уровень серийных разработок.
Характеристики различных ИП для БСС приведены в прил. 4.
Таблица 9
Возможности БСС с калориметрическими ИП
| Определяемое вещество | Имообилизованный биокатализатор | Диапазон концентраций |
| Клинический анализ | ||
| Аскорбиновая кислота | Аскорбиноксидаза | 0,05...0,6 ммоль/л |
| Холестерин | Холестериноксидаза | 0,03...0,15 ммоль/л |
| Глюкоза | Глюкозoоксидаза + каталаза | 0,002...0,8 ммоль/л |
| Мочевина | Уреаза | 0,01...500 ммоль/л |
| Мочевая кислота | Уриказа | 0,05...4 ммоль/л |
| Определение растворимых ферментов | ||
| Мочевина | Уреаза (растворимая) | 0,1...100 ед/мл |
| H2O2 | Каталаза (растворимая) | 0,1...100 ед/мл |
| Иммунологический анализ | ||
| Инсулин (антиген) | Иммобилизованные тела, меченные ферментом | 0,1...50 мкг/л |
| Альбумин (антиген) | То же | 10–10 моль/л |
| Контроль ферментативных процессов | ||
| Лактоза | Лактаза+глюкозоксидаза + каталаза | 0,05...10 |
| Пенициллин | Пенициллиназа | 0,05...500 |
| Этанол | Алкогольоксидаза | 0,01...1 |
3.5. Радиоактивные
Очень популярный метод исследования живого в 1960–70-е гг., основанный на внесении в субстрат радиоактивного углерода С14. В результате при переработке углеводов выделяется радиоактивный углекислый газ. Процесс выделения радиоактивного газового потока С14O2 измеряется дозиметром. На этом принципе основано измерение концентраций бактерий с помощью прибора «Bactometer».
В настоящее время радиоактивные методы используются в основном для мечения нуклеотидов или пептидов в исследованиях по разработке БСС на основе ДНК. При этом используют свойство избирательного поглощения какого-либо вещества белковыми комплексами и вводят в вещество радиоактивные добавки. После выделения белковых комплексов или ДНК с помощью дозиметра оценивают степень накопления в них данного вещества.
Современной тенденцией в биотехнологии является вытеснение радиоактивных меток флуоресцентными.
3.6. Микроаналитические
К ним относятся, например, БСС для анализа белкового состава веществ, включающие устройства для микроэлектрофореза (п 2 4.2) и флуоресцентного анализа (пп. 2.5.1, 2.5.2, 3.1.9), выполненные на одном кристалле [64]
В кристалле литографическим способом с использованием технологий создания кремниевых чипов формируют микроканавки, расположенные в виде «серпантина» (соединенные в один капилляр длиной свыше 160 мм), и круглые лунки с двух сторон для опущенных в анализируемое вещество электродов, на которые подается постоянное высокое напряжение.
Этот серпантинно-уложенный капилляр пересекают микробороздки, по которым из лунок путем микроинъекции подается люминесцирующее вещество и активатор люминесценции (пп. 2.5.2, 3.1.9), которые при взаимодействии с белками избирательно поглощаются и светятся. Таким образом биологическое вещество одновременно анализируется на электрофоретическую подвижность белков и флуоресцентное поглощение, которое фиксируется микротелекамерой.
3.7. Микромеханические
Это новейший тип технологий формирования механических систем с помощью кремниевой литографии, управляемых полупроводниковыми элементами [66]. Например, фирма Texas instruments разработала чипы, на которых размещены 4 млн подвижных микрозеркал. На основе кремниевой литографии разрабатывают микродозаторы и фильтры.
Подобно тому, как акселерометр для измерения ускорений в автомобиле уже изготавливается в виде одного чипа, данный подход позволяет в перспективе выпускать целую микроаналитическую лабораторию с ферментными ИП в одном технологическом цикле.
4. Особенности конструирования и эксплуатации биосенсорных систем
4.1. Обобщенная структура биосенсорной системы
Рис. 12. Биосенсорная система
На работоспособность БСС влияет целый комплекс биологических, химических, технических факторов, которые удобно анализировать, если представить БСС в виде обобщенной структурной схемы, приведенной на рис 12.
Для проведения анализа с помощью БСС требуется многие их узлы (подсистемы) и элементы постоянно обновлять или заменять. Подсистемы с подобными функциями обозначим термином «линии». Для построения БСС необходимы линии подготовки: пробы (П), биообъекта (БО), принадлежностей методики (ПМ), вспомогательного оборудования (ВО), а также линия утилизации материалов и оборудования (УТ).
В общем случае БСС строят на основе методологии организации биологического эксперимента, предполагающей сравнение свойств биохимических преобразователей контрольного и опытного стимула – БХПк и БХПоп. (п. 2.1).
Для получения численного значения реакции БХП требуется ИП, включающий:
- первичный измерительный преобразователь (ПИП),
- блок выделения информативного параметра (БВИП),
- блок обработки данных (БОД),
- систему отображения информации (СОИ).
Блок стабилизации параметров среды – БСПС поддерживает условия, необходимые для культивации организмов и воспроизводимости реакции БХП на стимул.
4.2. Факторы, влияющие на результат работы системы
Рассмотрим лишь некоторые важные факторы, влияющие на результат эксперимента, связанные с различными элементами структурной схемы БСС.
Линия подготовки пробы включает блоки забора пробы, дозирования, консервации.
На результаты БСС могут повлиять антисвертывающие консерванты типа гепарина, добавляемые в кровь для увеличения сроков хранения. Требуется учитывать возможность попадания в пробу антибактериальных или антипротозоальных антибиотиков, которые могли вводиться больным. Все эти факторы могут оказывать влияние на жизнеспособность ферментов и бактерий. Если проба разбавляется каким-либо веществом, то разбавитель может оказывать действие на БХП или же в результате ошибки разбавления может быть неверно определена концентрация вещества.
Пробы для экологических анализов отбирают из воды, донных осадков или воздуха специализированными пробоотборниками и обычно хранят в емкостях из пластика или в стеклянных сосудах. Следует учитывать, что не пищевой полиэтилен и пробки из вулканизированной резины (с содержанием серы) выделяют вещества, токсичные для организмов.
Линия подготовки биообъекта (БО) может существенно влиять на результаты БСС, если не соблюдены правила культивации клеток или выделения и модификации клеточных структур (пп. 2.2.2, 2.4).
Линия подготовки принадлежностей методики (ПМ) необходима, так как БХП разрабатывается с применением стеклянных или пластиковых изделий, гелей, полимерных мембран и растворов. Их влияние на БО требуется учитывать при конструировании БХП. Для этой цели следует предварительно поставить опыты на выживаемость и сохранение этологических реакций (например подвижности) организмов при внесении в культуральную среду материалов БХП (п. 2.1).
Эта подсистема также выполняет операции подготовки и хранения таких принадлежностей проведения эксперимента, как кювет, химических стаканов, колб, чашек Петри (п. 2.2.2).
Линия стерилизации требуется для очистки, промывания, дезинфекции материалов и вспомогательного оборудования (ВО). При этом нежелательно применять сильные биоцидные моющие или дезинфицирующие вещества и обязательно следует тщательно ополаскивать чистой водой посуду и оборудование для забора проб.
Линия утилизации непосредственно не влияет на результат, полученный с помощью БСС. Разработчику необходимо выбрать, какое вспомогательное оборудование более рационально утилизировать, а какое использовать многократно. При анализе биопроб линия утилизации предотвращает опасность инфицирования окружающей среды отработанным лабораторным материалом.
БХПк и БХПоп должны использоваться при одинаковых внешних условиях. Необходимо учесть внешние факторы, которые могут оказывать влияние на тест-реакции БХП.
Блок ПИП может негативно воздействовать на БХП за счет вредного влияния как основных конструкционных материалов ПИП – меди, латуни, бронзы, свинца, железа и т. п., так и вспомогательны – клеев, лаков, красок, растворителей, гальванических покрытий. Изменение реакции живого может возникнуть даже при кратковременном контакте некоторой части БО с этими материалами. Излучения ПИП могут изменять поведение или ухудшать жизнеспособность биообъектов (п. 1.4, 1.5).
БВИП позволяет выделять сигнал БХП на фоне помех. Полезный сигнал ИП обычно представляет собой сверхмалые величины (разд. 3). Это требует применения современных схем усилителей, детекторов, фильтров и др. Их качество существенно влияет на результат измерения реакций живого.
БОД предназначен для получения результата статистической обработки массива измеренных значений реакций. В блоке реализуется математический алгоритм, позволяющий получить воспроизводимый результат на основе исходных данных БВИП.
Для обработки данных БСС как сложных систем (п. 1.6) используется математический аппарат теории вероятностей: случайных событий, случайных величин, случайных процессов. Для описания изменения случайных величин неслучайными функциями применяются регрессионные модели, а выявление взаимосвязей между случайными величинами оценивается с помощью коэффициентов корреляции.
СОИ предъявляет оператору (ОП) промежуточные и окончательные результаты обработки данных. При построении СОИ должны учитываться профессиональные стереотипы врача или исследователя, для того чтобы, не перегружая восприятие оператора промежуточными данными, давать ему возможность отслеживать процесс измерения, особенно если реакция происходит в течение десятков минут или часов.
БСПС требуется для работы БСС тогда, когда скорость роста организма, возникновение реакции биообъекта или ее измерение зависят от различных внешних условий.
4.3. Комплекс для иммуноферментного анализа
БСС основана на принципе применения тест-реакции комплекса антиген-антитело-фермент (п. 2.5.6) и измерения оптической плотности продуктов ферментативной реакции [21, 32].
В данной БСС линии подготовки БО, ПМ и БХП реализуются на базе специализированных микробиологических предприятий, где производится приготовление и очистка ферментов, антител, антигенов, осаждение их на оптически прозрачные носители, т. е. создание диагностикумов.
БХП обычно осаждаются на планшеты разового пользования, рассчитанные на 96 микрокювет объемом 0,275–3 мл (12 рядов по 8 микрокювет). Планшеты и кюветы изготавливаются из биологически пассивных материалов, обладающих хорошими абсорбционными свойствами для иммобилизации антигенов или антител. К подобным материалам относятся плексиглас, полиамид, полистирол. БХП могут вноситься в пробирки на носителях антигенов или антител в виде шариков, дисков, гранул, колец из полимерных материалов. Возможность изготовления калиброванных по размеру носителей позволяет строго определить и стандартизировать поверхность связывания антител, что улучшает воспроизводимость результатов ИФА. Однако при этом требуется больший расход биологических материалов и реагента в связи с большей площадью носителей. Известно также применение в качестве твердофазных носителей слайдов – полосок из полимерного материала с углублениями объемом всего 25 мкл.
Для повышения достоверности результата анализа БХПоп и БХПк организуются на одном и том же планшете и несколько раз дублируются.
Линия подготовки пробы (обычно крови пациента) включает блоки для взятия пробы крови, заполнения и маркировки проб, что исключает опасность перепутать ячейки планшета.
Вспомогательное оборудование при проведении ИФА в планшетах необходимо для выполнения ряда многократно повторяющихся операций дозирования, титрования, инкубации, перемешивания, промывки планшетов.
К таким видам оборудования относятся соответственно дозаторы, дилютеры, термостаты, шейкеры и устройства промывки.
Одноканальные или многоканальные дозаторы предназначены для заполнения микрокювет пробой.
Дилютеры предназначены для разбавления растворами реагентов или пробы.
Термостаты, входящие в БСПС, обеспечивают поддержание проб в планшетах обычно при температуре 37°С.
Шейкеры применяются для ускорения и повышения прочности связывания компонентов, участвующих в иммуноферментной реакции путем встряхивания. Встряхивание производится либо за счет воздействия вибрацией, либо за счет горизонтально-круговых перемещений носителя проб.
Устройства промывки дозируют в лунки планшета промывочный раствор и затем удаляют промежуточные продукты анализа из лунок.
В качестве ИП для ИФА используют многоканальные денситометры (п. 3.1.1) с вертикальным ходом светового пучка. В данных типах фотометров на величину поглощения мало влияет неточное дозирование жидкостей, приводящее к вариациям толщины слоя жидкости. Кроме того, вертикальные фотометры компенсируют помехи в результате небольшого расслоения поглощающих веществ.
ПИП денситометра обеспечивает бесконтактное измерение оптической плотности продукта реакции на двух или нескольких длинах волн.
БВИП выделяет изменение сигнала постоянного тока за счет уменьшения проходящего потока.
БОД обрабатывает данные от многоканального измерителя, вычисляет статистические оценки, записывает их в память, сравнивает различие оптических характеристик проб: опытных и контрольных.
СОИ отображает на экране для оператора результаты измерения по 96 пробам в виде данных, а также графиков зависимости оптической плотности от времени вместе с данными об анализируемых пробах.