Учебное пособие министерство Российской Федерации по связи и информатизации Санкт-Петербургский государственный университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича

Вид материала

Учебное пособие

Содержание 2.3. Организмы как биохимические преобразователи (БХП) Рост-размножение как БХП. Зоны подавления. Химические свойства питательной среды Sacharomyces cerevisae Характеристики бактериальных БХП [3] Этологические реакции организмов как БХП 2.3.2. БХП с модифицированными организмами

Подобный материал:

• Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 30.2kb.
• Федеральное агентство связи санкт-петербургский государственный университет телекоммуникаций, 39.82kb.
• М. А. Бонч-Бруевича Кафедра опдс бочелюк Т. В., Доронин Е. М. «Назначение и примеры, 612.04kb.
• Петербургский Государственный Университет телекоммуникаций им проф. М. А. Бонч-Бруевича, 55.39kb.
• «мобильная связь», 49.1kb.
• Название доклада: универсальный, 63.37kb.
• Проблемы формирования учебно-методического комплекса, 151.02kb.
• Название учреждения, 806kb.
• Дорогие друзья и коллеги!, 15.57kb.
• Федеральное агентство связи государственное образовательное учреждение, 361.18kb.

2.3. Организмы как биохимические преобразователи (БХП)

2.3.1. БПХ с подвижными организмами

Данный тип БХП [22, 53] позволяет:

• использовать множество этологических реакций организмов (п. 1.4) и реакции роста-размножения (п. 1.5), которые отражают интегральное влияние многих факторов внешней среды на живое;
  
• наиболее дешево и долговременно поддерживать жизнеспособность БХП;
  
• применять в качестве БХП организмы, полученные методами генной инженерии (п. 2.2.7), что позволяет получать их с новыми, детерминированными свойствами.
  

Недостатком данного типа БХП является трудность оценки влияния на них отдельных веществ в биологических или природных средах.

Для применения организмов в качестве БХП необходимо выбрать количественно измеряемую характеристику их реакции, изменяющуюся при воздействии анализируемых веществ.

Рост-размножение как БХП. Существует несколько разновидностей тест-реакций данного БХП.

а) Прирост популяции. Для оценки тест-реакций размножения наиболее удобно использовать характеристики процессов деления одноклеточных организмов. Потребление ими субстрата S приводит к росту популяции, который обычно описывается нелинейной кривой [5].

На ней выделяют следующие участки (рис.1):

• лаг-фазу – стадию, когда организмы еще не приспособились к среде;
  
• лог-фазу – экспоненциальный прирост концентрации С организмов
  

(13)

где m – удельная скорость роста;

• фазу насыщения, когда сказывается влияние лимитирующих факторов среды, например выделение продуктов метаболизма в среду;
  
• фазу деградации – преобладание гибели над рождаемостью.
  

Рис. 1. Кривая роста - размножение одноклеточных организмов ( С - концетрация, t - время ) [5]

При размножении микроорганизмов на жидких питательных средах увеличивается мутность сред (п. 2.2.2). Степень мутности оценивается либо визуально (уменьшение, сохранение прежней мутности, увеличение) в баллах, либо методами оптического контроля (п. 3.1).

Микробиологические методы анализа в данном случае часто оказываются более информативными, чем химические, так как позволяют определять не валовое содержание элементов, а их физиологически активные формы. Продолжительность анализа с использованием быстро растущих культур составляет не менее 3,5...4 ч [53].

БХП этого типа используют для выявления вредных веществ. По различию характеристик прироста в опыте и контроле (п. 2.1) определяют предельную концентрацию вещества, обнаруживаемую организмами ( рис. 2.). Для оценки токсичности в питательные среды с микроорганизмами вводят не только растворы исследуемых химических веществ, но и экстракты, извлекаемые с помощью растворителей из тканей, почв и т.п.



Рис. 2. Характеристики БХП с микроорганизмами [53]

Обнаружены виды инфузорий, позволяющие определять относительную пищевую ценность белков – ОПЦ (п. 1.1.2). Если белок, которым питается инфузория T. Pyriformis, содержит полный набор аминокислот, она растет быстро, если хотя бы одной аминокислоты не хватает, то ее рост замедляется. В некоторых случаях для этой цели применяют цистообразующие инфузории С.shteini [8].

б) Зоны подавления. Бактериальные клетки, растущие на агаризованных средах (п. 2.2.2), образуют хорошо различимые колонии (по виду похожие на пятна плесени). Если в питательный агар, на котором выросли колонии, добавляют антибиотик, токсикант или, наоборот, биологический стимулятор, то возникает зона подавления роста или стимуляции роста (уменьшение или расширение колонии). Диаметр этих зон является линейной функцией концентрации определяемых веществ в некотором ее интервале [53].

При постоянном составе среды, оптимальных для данного организма рН и температуре величина зон зависит от толщины питательного слоя: чем тоньше слой, тем больше зона.

Таким способом по изменению формы и размеров пятен плесени, образованных грибками рода Aspergillus, на агаре, в который добавлен токсикант, выявляют малые концентрации нитратов ртути (II), кадмия, таллия.

в) Химические свойства питательной среды. При размножении в водной среде дрожжи или микроскопические грибы в процессе дыхания выделяют газы, которые изменяют кислотность питательной среды.

Это свойство БХП используется в БСС для оценки токсичности воды и почвы. После помещения сухих дрожжей ( Sacharomyces cerevisae) в пробу воды защелачивание пробы указывает на отсутствие в ней токсикантов [39]. При взаимодействии питательной среды с токсикантом возникает ее закисление, что выявляется в результате измерения рН (п. 3.2.4).

В НПО «Питательные среды» для обнаружения антибиотиков в моче разработана тест-система, которая с помощью цветового рН-индикатора обнаруживает изменение кислотности мочи, возникающее при размножении в ней бактерий B.subtillus. В качестве питательной среды иcпользуется дыхательный субстрат (глюкоза). Данные бактерии могут быть сохранены также в виде спор (п. 2.3.2). В табл. 4 указаны характеристики БХП на основе субстратов и организмов, выделяющих газы, изменяющие pH водной среды.

Таблица 4

Характеристики бактериальных БХП [3]

Субстрат	БО	Газ	Раствор
Углеводы	Организмы-аэробы	CO2	H2CO3
Белки, соединения азота	Бактерии-денитрификаторы	NH3	NH4OH
Сульфаты	Анаэробные серобактерии	H2S	H2S

Этологические реакции организмов как БХП (п. 1.4). Можно выделить БХП данного типа с несколькими тест-реакциями.

а) Таксисы. Для возникновения таксисов необходимо в среде создать градиент (неоднородность распределения) химического вещества, чтобы организм мог выбрать направление уменьшения вредного воздействия.

Существуют различные методы создания градиента:

•    применение камеры, разделенной на две части мембраной (камера Бойдена для организации таксиса лейкоцитов);
  
•    нанесение капли отпугивающего вещества на студенистую среду (п. 2.2.2), на которой растет колония микроорганизмов; вещество будет медленно диффундировать, а бактерии уходить из этой зоны, образуя кольцо (метод используемый для контроля активности антибиотиков). Эта реакция была обнаружена в XIX в. Бейеринком, но стала исследоваться с 1970-х гг.;
  

• погружение капилляра с микроорганизмами в жидкость с тестируемым веществом и, наоборот, – капилляра с веществом в среду с микроорганизмами (используется для оценки качества пресной и морской воды) [55];
  
• контакт веществ с различными вязкостями [17, 29], которые можно либо наслаивать сверху, либо вносить шприцем под слой другого вещества (используется для оценки токсичности водных сред и активности антибиотиков, рис. 3, 4).
  

Характеристиками таксиса могут быть концентрация организмов через определенное время, которая измеряется оптическими приборами (пп. 3.1.4, 3.1.7), параметры распределения концентрации по длине кюветы.

Среди перспективных организмов для БХП на основе таксисов можно назвать водоросль – ряску. Она реагирует на химические вещества сразу за счет нескольких биологических механизмов: как изменения цвета фотосинтетических пигментов (пп. 1.2.1, 2.5.4), так и фототаксиса листьецов (маленьких листочков) – их схождения или расхождения на поверхности воды. Это позволяет не только обнаруживать вредные вещества, но и дифференцировать их по механизмам воздействия на живое.

б) Кинезы. Скорость движения инфузорий повышается при введении в среду их обитания микроколичеств этанола, сахарозы, фурфурола, альдегидов, уксусной кислоты, хлоридов кальция и аммония; при добавлении хлорида бария движение клеток, наоборот, замедляется. Подвижность сперматозоидов крупного рогатого скота замедляется в вытяжке полимеров, если в их составе находятся вредные вещества [15].



Рис. 3. Хемотаксис инфузорий туфелек [17]



Рис. 4. Хемотаксис бактерий,

где a - МПБ, содержащий культуру Bacillus subtilis;

b - исследуемая проба: с - кольцо бактерий;

h - высота подъема кольца бактерий в контроле и h1 в пробе с токсикантом

Для описания тест-реакций кинезов организмов в их движении выделяют прямолинейные перемещения и «дрожание», т. е. колебания в пределах некоторой ограниченной зоны. В зависимости от типа движений выбирается метод измерения (пп. 3.1.7, 3.1.8).

в) Движения органов. При оценке чистоты воды в качестве тест-реакции используют некоторые физиологические показатели дафний, например, частоту сердечных сокращений, движения их ножек. При добавлении токсиканта сначала наблюдается общее возбуждение, переходящее в депрессию, а затем в результате нарушения деятельности органов движения, дыхания, кровеносной и нервной систем наступают потеря подвижности и летальный исход. Частоту как переменный сигнал удобно контролировать, например, фотометрическим методом (п. 3.1).

г) Локомоции. В качестве тест-реакции могут использоваться локомоции (п. 1.4.1) микроскопических червей – нематод. В разбавленных растворах токсикантов они быстро изгибаются то в одну, то в другую сторону, совершая как бы S-образные движения. С повышением концентрации движения становятся вялыми, замедляются [53].

Локомоции насекомых (например, жуков, комаров), описываемые скоростью и траекторией ходьбы или полета, изменяются при воздействии малых концентраций ядохимикатов или наркотических веществ и, следовательно, могут быть использованы в качестве тест-реакции.

2.3.2. БХП с модифицированными организмами

Особенность БХП на основе иммобилизованных организмов (п. 2.2.6) состоит в том, что они, помещенные в гель или в пористый материал, часто находятся в состоянии субстратного голода.

В этом случае для уменьшения потребления энергии в клетках снижается уровень обмена веществ, а основным путем воздействия стимула является его диффузия из внешней среды через стенки клеток и их последующее ферментное преобразование. Поэтому реакция БХП на основе иммобилизованных организмов более медленная, чем у подвижных клеток в питательной среде [22].

Чувствительность иммобилизованных микроорганизмов понижена и проявляется или к жизненно необходимым веществам, поддерживаю­щим энергетику клетки, каталитическое разложение которых требует минимума энергии, или к токсичным веществам, вызывающим гибель организмов.

Основными тест-реакциями БХП являются метаболические, т. е. организм становится живым биокатализатором для преобразования субстрата в продукт ферментативных реакций. Поэтому иммобилизо­ванные организмы часто используются в виде ферментного преобразователя с увеличенным сроком действия за счет того, что организмы сохраняют жизнеспособность дольше, чем ферменты. В прил 3. приве­дены продукты ферментативных реакций, выделяемые клетками.

Способность лиофилизованных клеток достаточно быстро восстанавливать жизнеспоособность и проявлять реакции метаболизма используется в методике «Микротокс» (Microtox) для оценки загрязнений окружающей среды по люминесценции бактерий (п. 2.5.1).

На биотехнологических предприятиях культивируют штаммы светящихся бактерий, которые затем модифицируют в порошковую лиофилизованную форму. Полученный бактериальный порошок хранят в морозильнике. При анализе этот порошок добавляют в питательную среду. Для БХП необходимо обеспечить два температурных режима: один для восстановления жизнеспособности бактерий, другой для протекания люминесцентной тест-реакции [16,18].

Полученные методом криоконсервации БО применяют в БСС «Биотехническая система для измерения индекса токсичности вытяжек полимеров» по изменениям кинезов сперматозоидов крупного рогатого скота (п. 2.2.5). Отбор БО осуществляется из банков станций осеменения, где они хранятся в жидком азоте. После размораживания двигательная активность сперматозоидов восстанавливается. Их дозируют, выдерживают в среде с вытяжкой из полимеров, а затем измеряют показатели скорости БО (п. 3.1.8).

При использовании данного вида модификации БО следует учиты­вать, что хотя наибольшая их часть остается жизнеспособной, неболь­шая часть их может погибнуть. Это обусловливает необходимость различения движения живых БО от движения мертвых, переносимых в вытяжке конвекционными потоками.

Споры бацилл применяют в БСС – бактериальных тест-системах для выявления антибиотиков (п. 2.3.1).

Цисты используют в БСС для оценки качества кормового белка (п. 2.3.1). Важным преимуществом инцистирования инфузорий является то, что они покидают свои цисты на одной и той же стадии развития, что улучшает воспроизводимость результатов эксперимента [8].