Синтетические пептиды, взаимодействующие с различными типами холинорецепторов

Вид материала

Содержание

Подобный материал:

1 2 3

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

____________________________________________________________

на правах рукописи

Хрущев Алексей Юрьевич

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ.

Специальность: 02.00.10 – Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

МОСКВА – 2011

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН В.И. Цетлин

кандидат химических наук Жмак М.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Г.А. Коршунова

доктор химических наук, профессор Л.Д. Румш

Ведущая организация: Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 20 » апреля 2011 г. в часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « 17 » марта 2011 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

доктор физико-математических наук В.А. Олейников

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Нарушение работы некоторых подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) может вызывать или быть следствием ряда заболеваний, таких как мышечные дистрофии (миастении) и некоторые виды эпилепсии. Также была показана взаимосвязь между шизофренией, болезнями Альцгеймера, Паркинсона и нарушением в уровне определенных подтипов нейрональных нАХР, что диктует необходимость изучения структуры и механизмов функционирования этого класса лиганд-управляемых каналов. Для проведения подобных исследований необходимо иметь адекватные инструменты, которыми являются пептидные и белковые нейротоксины, выделенные из различных природных источников. Значительный вклад в понимание механизмов передачи нервного импульса был сделан в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН благодаря использованию нейротоксинов из ядов змей и членистоногих. В последнее время появилась задача различать особенности отдельных подтипов рецепторов, и для этого необходимо использовать более «тонкие» инструменты. Так, в случае нАХР такими инструментами являются α-конотоксины, обладающие уникальной способностью различать не только нейрональные и мышечные типы рецепторов, но также их подтипы и даже разные участки связывания на рецепторе. α-Конотоксины – небольшие пептиды, выделенные из ядов хищных морских моллюсков Conus, содержащие 12-22 аминокислотных остатка и две дисульфидные связи. Поскольку выделение значительных количеств индивидуальных пептидных компонентов из яда моллюсков Conus является достаточно сложной задачей, α-конотоксины и их аналоги получают методами пептидного синтеза.

Цели и задачи работы. Целью настоящего исследования являлась разработка эффективных подходов к синтезу α-конотоксинов, а также получение новых биологически активных синтетических аналогов α-конотоксинов для исследований нАХР. При этом решались следующие задачи: 1. Выбор оптимальных условий замыкания дисульфидных связей; 2. Получение ряда α-конотоксинов в препаративных количествах; 3. Изучение взаимосвязи между структурой и биологической активностью α-конотоксинов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны эффективные схемы синтеза препаративных количеств природных α-конотоксинов и их аналогов. Практическая ценность разработанных методик заключается в достижении максимальных выходов реакций синтеза α-конотоксинов. Методические подходы к синтезу пептидов, содержащих две дисульфидные связи, разработанные в рамках данной диссертационной работы, могут быть использованы в синтезе не только α-конотоксинов, но и для получения других биологически активных коротких пептидов, содержащих две дисульфидные связи – таких, как апамины или эндотелины. Получены два новых аналога α-конотоксина PnIA, которые показали более высокое сродство, чем природный пептид, к α7 нАХР и к модели лиганд-связывающего домена нАХР – ацетилхолин-связывающему белку (АХСБ) A. сalifornica. Показано, что увеличение длины первой цистеиновой петли α-конотоксина MI не приводит к переключению специфичности с нАХР мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального α7 нАХР человека. С использованием молекулярного моделирования и последующего синтеза были получены аналоги α-конотоксина PnIA, обладающие повышенной селективностью к АХСБ из A. californica. С помощью синтезированных изомеров α-конотоксина ImII и его аналога [W10Y]ImII было впервые показано наличие дополнительного участка связывания на Torpedo нАХР, отличного от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Апробация работы. Результаты настоящего исследования доложены на ряде российских и международных симпозиумов: на VI и VII Летней нейропептидной конференции Европейского нейропептидного клуба (Зальцбург 2009 и Печ 2010., соответственно), на ХХI зимней молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009), на конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.-Петербург, 2009), на совещании «Нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении» (Москва, 2010).

Объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, состоит из введения, 3 глав и выводов, содержит 19 рисунков, 8 таблиц, в списке литературы цитировано 181 название. В глава I приведен обзор литературных данных по исследованию никотинового ацетилхолинового рецептора с помощью α-конотоксинов и их аналогов, а также приведены данные по химическому синтезу α-конотоксинов. В главе II содержатся результаты исследований и их обсуждение, в главе III изложены экспериментальные методы.

Обсуждение результатов.

α-Конотоксины - небольшие пептиды, содержащие 12-22 аминокислотных остатка, выделенные из морских улиток семейства Conus. Жесткость структуры этих пептидов обеспечивается двумя дисульфидными связями, соединяющими 1-3 и 2-4 остатки цистеина:

где Х - любые аминокислотные остатки, в подстрочном индексе указано их возможное число, С^1,2,3,4– остатки цистеина, С-концевой остаток большинства α-конотоксинов амидирован. Задача разработки методов синтеза α-конотоксинов продиктована тем, что эти пептиды присутствуют в яде Conus в очень небольших количествах, тогда как для проведения структурно-функциональных исследований самих α-конотоксинов, а также для изучения

механизмов их взаимодействия с АХР¹, требуются препаративные количества этих пептидов. С помощью химического синтеза, на основании методов молекулярного моделирования и/или эмпирического анализа последовательностей, можно получать разнообразные аналоги α-конотоксинов, которые могут превосходить природные пептиды по эффективности и/или избирательности действия. Химический синтез также позволяет получать аналоги, содержащие модифицированные аминокислотные остатки.

Несмотря на то, что современные методы твердофазного синтеза позволяют получать пептиды, содержащие более 100 аминокислотных остатков и с этой точки зрения синтез линейной последовательности α-конотоксинов не представляет больших трудностей, однако наличие двух дисульфидных связей в α-конотоксинах значительно усложняет синтез и требует тщательного подбора как стратегии синтеза, так и методов, применяемых на каждой стадии синтеза.

Особенности синтеза α-конотоксинов.

В синтезе α-конотоксинов используют два подхода к замыканию дисульфидных связей. Наиболее часто в литературе встречаются примеры синтеза с поэтапным замыканием дисульфидных мостиков. Особенность этого метода заключается в использовании защитных групп, удаляемых в разных условиях (ортогональных) для двух пар цистеинов (первый-третий, второй-четвертый), образующих впоследствии две дисульфидные связи. При этом для защиты тиольных функций первой пары остатков цистеина используют кислотолабильные группы (Trt¹-группа в случае Fmoc-схемы защитных групп), которые удаляют при деблокировании пептида вместе с остальными защитными группами. После удаления защитных групп проводят замыкание первой дисульфидной связи. Вторую пару остатков цистеина защищают кислотостабильными группами (например, Acm¹ или tBu¹), которые удаляют селективными реагентами, при этом часто выбирают условия синтеза, при которых происходит одновременное образование второй дисульфидной связи. Основным недостатком этого метода является низкий выход целевого продукта, составляющий не более 10% в расчете на стартовую аминокислоту. Однако, эта стратегия имеет очевидное достоинство: в результате синтеза получается индивидуальное соединение с известным расположением дисульфидных связей.

Вторым подходом, используемым при синтезе α-конотоксинов, является одновременное замыкание двух дисульфидных связей. Отличительной чертой этого метода является использование кислотолабильных защитных групп для обеих пар остатков цистеина.

__________________________________________________________________

¹ Принятые сокращения: Trt - тритил-; Аcm – ацетамидометил-; tBu – третбутил-; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; АХР – ацетилхолиновый рецептор; АХСБ – ацетилхолин-связывающий белок; αBgt – α-бунгаротоксин.

В результате деблокирования образуется линейный пептид, содержащий 4 свободные сульфгидрильные группы. В результате одновременного замыкания сразу двух дисульфидных связей часто образуются 3 изомера.

При этом показано, что в случае «природных» α-конотоксинов в качестве основного продукта образуется изомер с природным расположением дисульфидов, тогда как аналоги токсинов, содержащие одну или более аминокислотных замен, часто образуют смесь изомеров, без преобладания какого-либо продукта. Это приводит к необходимости использования дополнительных методов анализа для определения порядка замыкания дисульфидных связей. Однако, главным достоинством этого метода является высокий выход целевого продукта, который составляет 30-50% в расчете на стартовую аминокислоту.

В результате выполнения данной работы были разработаны оптимальные условия получения препаративных количеств природных α-конотоксинов и их аналогов. Наибольшие выходы целевого продукта получены при синтезе с одновременным замыканием дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных tBu-групп на остатках цистеина в положениях Cys¹ и Cys³приводит к увеличению выхода α-конотоксина RgIA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы расположены в положениях Cys² и Cys⁴. В синтезе [Y10]ImII для удаления tBu-защитных групп и одновременного образования дисульфидной связи мы использовали трифторацетат таллия. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения часто образуются при замыкании дисульфидных связей раствором трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость высокоэффективного метода замыкания дисульфидных связей с применением трифторацетата таллия. Благодаря использованию роботизированного пептидного синтезатора в одновременном синтезе серии аналогов α-конотоксинов удалось значительно уменьшить время синтеза, а также сделать процесс более экономичным. Это открывает новые возможности в исследовании структурно-функциональных особенностей α-конотоксинов.

Выбор последовательностей α-конотоксинов для синтеза.

Природные α-конотоксины, такие как GI и MI, проявляют высокую избирательность к нАХР мышечного типа. Большая группа α-конотоксинов специфически блокирует нейрональные нАХР, однако, они очень редко избирательны по отношению к какому-либо определенному подтипу нейрональных АХР. Данная работа является частью структурно-функциональных исследований никотиновых рецепторов, проводимых в Отделе молекулярных основ нейросигнализации ИБХ РАН. Важным этапом является детальный анализ взаимодействия рецептора с пептидными и белковыми нейротоксинами. Объектами исследования являются нАХР мышечного типа из электрического органа ската Torpedo californica, нейрональный α7 нАХР, нарушение деятельности которого связано с такими нейродегенеративными заболеваниями как болезнь Альцгеймера, а также α9 нАХР, антагонисты которого рассматриваются как потенциальные анальгетики. Ранее, в результате совместного проекта нашей лаборатории с Нидерландским институтом рака, была установлена кристаллическая структура комплекса аналога α-конотоксина PnIA с ацетилхолин-связывающим белком (АХСБ) A. californica. В настоящее время в нашей лаборатории продолжаются работы по исследованию взаимодействия α-конотоксинов и их аналогов с ацетилхолин-связывающими белками, которые являются моделями лиганд-связывающих доменов холинорецептора. Таким образом, задачей диссертационной работы являлась оптимизация синтеза α-конотоксинов и их аналогов, мишенями которых служат перечисленные подтипы рецепторов и АХСБ

Таблица 1. Структуры синтезированных α-конотоксинов и их аналогов.

Название пептида	Аминокислотная последовательность^а
α-конотоксины, блокирующие α7 нАХР.
[L¹⁰]PnIA	GCCSLPPCALNNPDYC*
[H⁵]PnIA	GCCSHPPCAANNPDYC*
[H⁵,R¹⁴]PnIA	GCCSHPPCAANNPRYC*
[R⁵,L¹⁰]PnIA	GCCSRPPCALNNPDYC*
[D⁷,L¹⁰]PnIA	GCCSLPDCALNNPDYC*
[L¹⁰,K¹⁴]PnIA	GCCSLPPCALNNPKYC*
[D⁵,L¹⁰]PnIA	GCCSDPPCALNNPDYC*
[R⁷, L¹⁰]PnIA	GCCSLPRCALNNPDYC*
[R⁵,D⁷,L¹⁰]PnIA	GCCSRPDCALNNPDYC*
[R⁵,L¹⁰,R¹⁴]PnIA	GCCSRPPCALNNPRYC*
[D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA	GCCSDPRCALNNPDYC*
[D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA	GCCSDPRCAVNNPDYC*
[R⁵,D⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA	GCCSRPDCALNNPRYC*
[D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA	GCCSDPRCALNNPRYC*
[Y¹⁰]ImI	GCCSDPRCAYRC*
[L¹¹, D¹⁶]ArIB	DECCSNPACRLNNPHDCRRR
[S⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB	SDECCSNPACRLNNPHDCRRR
[(SGGG)⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB	SGGGDECCSNPACRLNNPHDCRRR
α-конотоксины, блокирующие α9 нАХР.
Vc1.1	GCCSDPRCNYDHPEIC*
[R⁵]Vc1.1	GCCSRPRCNYDHPEIC*
[D⁷]Vc1.1	GCCSDPDCNYDHPEIC*
[R¹¹]Vc1.1	GCCSDPRCNYRHPEIC*
[R⁵,D⁷]Vc1.1	GCCSRPDCNYDHPEIC*
RgIA	GCCSDPRCRYRCR
RgIA_изо	GCCSDPRCRYRCR
α-конотоксин, блокирующий α3β2 и α6 нАХР.
[Y⁰]MII	YGCCSNPVCHLEHSNLC*
α-конотоксины, блокирующие α7 и мышечный нАХР.
ImII	ACCSDRRCRWRC*
ImII_изо	ACCSDRRCRWRC*
[Y¹⁰]ImII	ACCSDRRCRYRC*
[R⁵,D⁷]ImII	ACCSRRDCRWRC*
α-конотоксины, блокирующие мышечный тип нАХР.
MI	GRCCHPACGKNYSC*
[L¹⁰]MI	GRCCHPACGLNYSC*
[GRCCS]MI(6-15)	GRCCSHPACGKNYSC*
[GCCS]MI(6-15)	G-CCSHPACGKNYSC*
[GCCS, L¹⁰]MI(6-15)	G-CCSHPACGLNYSC*

* - С-концевое амидирование.

^а– Во всех пептидах дисульфидные связи образованы между первым и третьим, а также вторым и четвертым остатками цистеина.

Пептиды, представленные в таблице 1, являются аналогами природных α-конотоксинов PnIA, Vc1.1, ImI, ImII, RgIA, ArIB и MI. Пептиды [L¹⁰]PnIA, [R⁵, L¹⁰]PnIA и [L¹⁰, K¹⁴]PnIA были синтезированы в качестве контрольных образцов, поскольку в ряде работ они показали повышенное сродство к α7 подтипу нАХР. Кроме того, для доказательства влияния положительного заряда в 5 положении аналогов пептида [L¹⁰]PnIA мы синтезировали пептид [D⁵, L¹⁰]PnIA, содержащий замену R5D. Для изучения влияния положительного заряда в 5 и 14 положении на сродство α-конотоксина PnIA к α7 подтипу нАХР были синтезированы аналоги [H⁵]PnIA и [H⁵,R¹⁴]PnIA. Для исследования влияния знака заряда в 7 позиции мы синтезировали пептиды [R⁷, L¹⁰]PnIA и [D⁷, L¹⁰]PnIA. Пептиды [R⁵,D⁷,L¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA, [R⁵,L¹⁰,R¹⁴]PnIA, [R⁵,D⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA, и [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA, содержащие, кроме базовой мутации A10L (или A10V), также аминокислотные остатки аргинина или аспарагиновой кислоты в положениях 5, 7 и 14, были синтезированы для изучения совместного влияния заряженных аминокислотных остатков на сродство к α7 подтипу нАХР и ацетилхолин-связывающим белкам.

Последовательности аналогов [D⁵,L¹⁰]PnIA, [R⁷,L¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA и [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA были выбраны с помощью метода молекулярного моделирования.

Остаток тирозина в пептидах [Y⁰]MII, [Y¹⁰]ImI и [Y¹⁰]ImII мы ввели для получения соответствующих производных меченным радиоактивным изотопом иода (¹²⁵I) и последующего анализа связывания их с никотиновым холинорецептором. Пептиды Vc1.1, ImII, RgIA и MI представляют собой природные α-конотоксины без каких-либо модификаций. Мы провели также синтез ribbon-изомеров (дисульфидные связи между Сys1−Сys4 и Сys2−Сys3 ) α-конотоксинов ImII и RgIA, поскольку аминокислотная последовательность этих токсинов была получена при анализе библиотеки кДНК, полученной из мРНК, содержащейся в ядовитых железах моллюсков Conus, что не позволяет установить порядок замыкания дисульфидных связей.

Аналоги [R⁵]Vc1.1 и [R¹¹]Vc1.1 были синтезированы для изучения влияния положительного заряда на активность α-конотоксина Vc1.1. Для исследования дополнительного отрицательного заряда мы синтезировали аналог [D⁷]Vc1.1, содержащий «мутацию» R7D. Пептид [R⁵,D⁷]Vc1.1 содержит двойную замену - отрицательный заряд в 5 позиции и положительный в 7 исходного α-конотоксина Vc1.1 поменяны местами. Тот же прием мы использовали для синтеза аналога [R⁵,D⁷]ImII, заменив в природном пептиде ImII D⁵ на R и R⁷ на D.

Для изучения влияния положительного заряда в положении 10 на активность α-конотоксина MI мы синтезировали аналог [L¹⁰]MI, содержащий «мутацию» K10L. Основное отличие α-конотоксинов, селективно действующих на мышечные или нейрональные подтипы нАХР, заключается в числе аминокислотных остатков между остатками Cys² и Сys³ (первая цистеиновая петля) Так, «мышечные» α-конотоксины, принадлежащие к 3/5-семейству (например GI, GII, MI, SI, SIA и др.) имеют по 3 остатка в первой цистеиновой петле, тогда как «нейрональные» α-конотоксины имеют по 4 остатка (например ImI, ImII, MII, PnIA, GID и др.). Для получения аналогов «мышечного» α-конотокина MI, обладающих повышенным сродством к нейрональному подтипу нАХР (α7), мы синтезировали пептиды, которые содержат добавочный остаток серина в первой цистеиновой петле (между остатком Cys⁴ и His⁵), что переводит их в число представителей 4/5-семейства α-конотоксинов. Таким образом, мы выбрали последовательности и синтезировали пептид [GRCCS]MI(6-15), а также пептиды [GCCS]MI(6-15) и [GCCS, L¹⁰]MI(6-15), в которых удалены остатки аргинина во 2 положении, а также лизин-10 заменен на лейцин, что часто встречается среди «нейрональных» токсинов, например в MII и PnIA.

Аналог [L¹¹, D¹⁶]ArIB был синтезирован в качестве контроля, поскольку по литературным данным известно, что он обладает наномолярным сродством к α7 подтипу нАХР. Пептид [S⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB содержит дополнительный N-концевой остаток серина, который был введен для дальнейшей модификации и присоединения пептида к твердому носителю, что позволит получить высокоактивный сорбент для аффинной хроматографии. Аналог [(SGGG)⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB содержит тетрапептидный фрагмент Ser-Gly-Gly-Gly в N-концевой части, остаток серина был введен для его последующей модификации с образованием активированного производного пептида, необходимого для иммобилизации α-конотоксина на твердом носителе. Остаток серина отделен от основной последовательности пептида тремя остатками глицина, которые увеличивают конформационную подвижность системы токсин-полимер.

Blog

Синтетические пептиды, взаимодействующие с различными типами холинорецепторов

Содержание