Синтетические пептиды, взаимодействующие с различными типами холинорецепторов

Вид материала

Автореферат

Содержание Таблица 3. Ингибирующая активность аналогов α-конотоксина PnIA. Исследование влияния дополнительных N-концевых аминокислотных остатков на активность [L ]ArIB, [S0 ]ArIB,)= 0,84 μМ, IC Определение сродства α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA к α7 нАХР и АХБС из L. stagnalis Таблица 4. Ингибирующая активность α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA. Таблица 5. Ингибирующая активность α-конотоксинов ImII, ImIIизо и [Y]ImII.

Подобный материал:

• Пояснительная записка Цель полевой практики : знакомство с дикорастущими растениями, 212.83kb.
• Задача №9 «Жевательная резинка», 39.88kb.
• I межрегиональная выставка-ярмарка, 43.59kb.
• Самоопределение женщин с различными типами гендерной идентичности Иванова, 150.77kb.
• Лось различными исследователями, для провинций Северной Африки особенно характерно, 444.56kb.
• Искусство и религия, 72.78kb.
• Домашнее задание Требования к домашнему заданию: Необходимо создать несколько текстовых, 158.94kb.
• Синтетические пищевые красители, 68.81kb.
• Программа дисциплины Базы данных Семестры, 12.06kb.
• Алмазного Инструмента «томал», 592.31kb.

Таблица 3. Ингибирующая активность аналогов α-конотоксина PnIA.

α-конотоксин	Ингибирующая активность (α7), %	Ингибирующая активность (A. californica), %	Ингибирующая активность (L. stagnalis), %
[L10]PnIA	65	100	100
[H5]PnIA	55	100	90
[H5,R14]PnIA	65	100	90
[R5,L10]PnIA	75	100	100
[D7,L10]PnIA	5	35	0
[L10,K14]PnIA	80	100	100
[D5,L10]PnIA	20	85	50
[R7, L10]PnIA	0	90	20
[R5,D7,L10]PnIA	0	50	30
[R5,L10,R14]PnIA	95	100	100
[D5,R7,L10]PnIA	10	100	50
[D5,R7,V10]PnIA	7	100	75
[R5,D7,L10,R14]PnIA	35	85	90
[D5,R7,L10,R14]PnIA	50	100	95

Интересно, что наиболее активным из всей серии аналогов оказался пептид [R⁵,L¹⁰,R¹⁴]PnIA: его сродство к α7 АХР оказалось больше, чем у описанных α-конотоксинов [L¹⁰]PnIA, [R⁵,L¹⁰]PnIA и [L¹⁰,K¹⁴]PnIA, а с ацетилхолин-связывающими белками из A. сalifornica и L. stagnalis этот пептид показал 100% ингибирование. По-видимому, важную роль играет остаток пролина в 7 положении, поскольку аналоги [R⁵,D⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA и [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA, в которых Pro⁷ заменен на аргинин или на аспарагиновую кислоту, резко снижали свою активность при взаимодействии с α7 АХР (снижениe сродства к ацетилхолин-связывающим белкам было выражено слабее).

При замене остатка пролина-7, а также аспарагиновой кислоты в 14 позиции, наблюдалось значительное снижение сродства полученных аналогов α-конотоксина PnIA к α7 подтипу нАХР. Пептиды [D⁷,L¹⁰]PnIA, [R⁵,D⁷,L¹⁰]PnIA, [R⁷,L¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA и [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA либо вообще не проявили активность, либо показали очень слабое взаимодействие с α7 АХР при концентрации 0,003 мМ; при этом первые два токсина проявили слабое сродство к обоим АХСБ, тогда как остальные обладали большим сродством к белку из A. сalifornica. Следует отдельно упомянуть α-конотоксин [R⁷, L¹⁰]PnIA, который в исследуемой концентрации обладал высоким сродством к АХСБ из A. сalifornica, тогда как с белком из L. Stagnalis взаимодействовал достаточно слабо (ингибирующая активность 20%) и практически не связывался с α7 подтипом нАХР.

Влияние заряда в N-концевой части пептида было наглядно проиллюстрировано путем сравнения активностей α-конотоксинов [D⁵,L¹⁰]PnIA и [R⁵,L¹⁰]PnIA. Последний обладал в несколько раз более высоким сродством к α7 подтипу нАХР и обоим ацетилхолин-связывающим белкам, по сравнению с аналогом, содержащим отрицательный заряд в пятом положении.

Было также установлено, что не только [A10L]-мутация приводит к появлению высокоактивных лигандов к α7 подтипу нАХР. Так, нами были синтезированы пептиды [H⁵]PnIA и [H⁵,R¹⁴]PnIA, содержащие соответствующие замены - [L5H] и [L5H, D14R], которые обладают такой же активностью, как и описанный ранее α-конотоксин [A10L]PnIA. Сродство этих аналогов к ацетилхолин-связывающим белкам было также достаточно высоким.


Исследование влияния дополнительных N-концевых аминокислотных остатков на активность [L¹¹, D¹⁶]ArIB.

Данная работа была проведена с использованием трех аналогов α-конотоксина ArIB - [L¹¹, D¹⁶ ]ArIB, [S⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB и [(SGGG)⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB. Первый аналог был описан в литературе как мощный антагонист α7 нАХР, который связывался с мембранами мышиного гиппокампа со сродством 1,1 нМ. Синтез этого аналога является хорошим примером того, как из «полиспецифичного» природного пептида ArIB путем замены нескольких аминокислотных остатков зарубежными авторами были получены эффективные и высокоспецифичные к α7 нАХР лиганды – [V11L,V16A] ArIB и [V11L,V16D] ArIB(Whiteaker P. et al., 2008).

Синтез новых аналогов был осуществлен с целью их последующей иммобилизации на твердом носителе и получения сорбента для аффинной хроматографии для выделения α7 подтипа нАХР из биологического материала. Для этого нами были получены аналоги, содержащие N-концевой остаток серина, отделенный от последовательности пептида в первом случае одним, а во втором – тремя остатками глицина. Эти остатки образуют «ножку», которая, как предполагается, не вносит конформационных ограничений в систему токсин-полимер. Для определения влияния дополнительных аминокислотных остатков на активность, исследовали способность полученных пептидов взаимодействовать с α7 подтипом нАХР трансфецированным в клетки GH4C1. Так IC₅₀([L¹¹, D¹⁶ ]ArIB,)= 0,84 μМ, IC₅₀([S⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB)= 0,81 μМ и IC₅₀([(SGGG)⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB)= 1,24 μМ. Показано, что добавление N-концевых остатков не привело к снижению активности α-конотоксина [S⁰, L¹¹,D¹⁶]ArIB, тогда как аналог [(SGGG)⁰, L¹¹, D¹⁶]ArIB, содержащий четыре дополнительных N-концевых аминокислотных остатка, проявил сродство к α7 нАХР всего в 1,5 раза более низкое чем исходный пептид [L¹¹, D¹⁶]ArIB. Высокое сродство к α7 подтипу нАХР позволит использовать эти аналоги для получения эффективного носителя для аффинной хроматографии.


Определение сродства α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA к α7 нАХР и АХБС из L. stagnalis.

Мы осуществили синтез природных α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA, ранее описанных в ряде работ. Интерес к ним вызван их способностью подавлять нейропатическую боль на моделях in vivo, что, как предполагается, связано с их способностью эффективно взаимодействовать с α9α10 подтипом холинорецептора. Ингибирующая активность α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA в концентрации ≈ 0,003 мМ представлена в табл. 4:


Таблица 4. Ингибирующая активность α-конотоксинов Vc1.1 и RgIA.

α-конотоксин	Ингибирующая активность (α7), %	Ингибирующая активность (L. stagnalis), %
RgIA	55	45
Vc1.1	50	Не исследовано

Определение биологической активности аналогов α-конотоксинов ImII.

Особенность α-конотоксина ImII заключается в том, что его аминокислотная последовательность, как и ряда других пептидов (BuIA, GIC, PIA, Vc1.1, PeIA и Lp1.1.), была выведена из анализа библиотеки кДНК, полученной из мРНК, содержащейся в ядовитых железах моллюсков. Однако, этот подход не позволяет установить порядок расположения дисульфидных связей и наличие посттрансляционных модификаций. Для анализа возможной активности разных дисульфидных изомеров α-конотоксина ImII, мы синтезировали изомер с характерным для «природных» α-конотоксинов расположением дисульфидных связей (Сys¹/Сys³ и Сys²/Сys⁴), а также изомер, содержащий другой порядок замыкания дисульфидов- Сys¹/Сys⁴ и Сys²/Сys³.

Пептид [Y¹⁰]ImII был синтезирован для последующего иодирования и анализа прямого связывания с никотиновым холинорецептором. Проведенные опыты показали, что исследуемые пептиды обладают высоким сродством к α7 нАХР и ацетилхолин-связывающим белкам из A. californica и L. stagnalis. Ингибирующая активность обоих изомеров α-конотоксина ImII и [Y¹⁰]ImII в концентрации ≈ 0,003 мМ представлена в Табл. 5


Таблица 5. Ингибирующая активность α-конотоксинов ImII, ImII_изо и [Y¹⁰]ImII.

α-конотоксин	Ингибирующая активность (α7), %	Ингибирующая активность (A. californica), %	Ингибирующая активность (L. stagnalis), %
ImII	95	80	90
ImIIизо	93	60	70
[Y10]ImII	85	80	55

С использованием полученных аналогов была проведена работа, в результате которой был найден дополнительный сайт связывания на Torpedo нАХР, отличный от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов (Kasheverov et al., J. Neurochem., 2009).

Известно, что α-конотоксины взаимодействуют с сайтами связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов нАХР и АХСБ. α-Конотоксины, связывающиеся с мышечным подтипом нАХР или α7 нАХР, конкурируют с α-бунгаротоксином. Синтезированные нами α-конотоксин ImII, его «ribbon» изомер, а также аналог содержащий замену W10Y, обладают схожим сродством к α7 нАХР человека и мышечному подтипу нАХР. Globular- и ribbon-изомеры α-конотоксина ImII, а также аналог [W10Y]ImII вытесняли радиоактивно-меченный α-бунгаротоксин из комплекса с α7 нАХР, экспресированным в клеточной линии GH₄C₁ (IC₅₀ 17, 23 μМ и 27 µМ соответственно), а также АХСБ L. stagnalis и A. californica (IC₅₀ 2.0-9.0 μМ).

Согласно данным, полученным с помощью поверхностного плазмонного резонанса (выполнено Rucktooa P., Амстердам), оба изомера связываются с иммобилизированными АХСБ, а также конкурируют с АХСБ за иммобилизованный α-бунгаротоксин (Кd и IC₅₀ 2.5-8.2 μМ). Токсин [I¹²⁵]ImII(W10Y) показал специфическое связывание с нАХР из Torpedo (Kd 1.5-6.1μМ) и вытеснялся α-конотоксином ImII и его «ribbon» изомером, а также ImII(W10Y) с IC₅₀ 2.7, 2.2 и 3.1 µМ, соответственно. При этом α-кобратоксин и α-конотоксин ImI вытесняли [I¹²⁵]ImII(W10Y) только при очень высоких концентрациях (IC₅₀ более 90 µМ). Таким образом, полученные результаты показывают, что α-конотоксин ImII и его аналоги имеют дополнительный сайт связывания на Torpedo нАХР, отличный от сайта связывания агонистов и/или конкурентных антагонистов.


Заключение.

Результатом данной работы является подбор оптимальных условий синтеза препаративных количеств природных α-конотоксинов и их аналогов. Показано, что наибольших выходов целевого продукта можно достичь при синтезе с одновременным замыканием дисульфидных связей действием кислорода воздуха в смеси вода-ацетонитрил (1:1 v/v) при рН=8,5. Однако, такой подход требует дальнейшего анализа порядка замыкания дисульфидных связей. В данной работе также был исследован метод поэтапного замыкания дисульфидных связей. Установлено, что расположение защитных tBu-групп на остатках цистеина в положениях Cys¹ и Cys³ приводит к увеличению выхода α-конотоксина RgIA в 3,7 раза по сравнению с синтезом, в котором tBu-группы расположены в положениях Cys² и Cys⁴. В данной работе впервые предложен метод разрушения комплексных соединений молекулы пептида с ионами таллия путем обработки раствором ЭДТА. Такие комплексные соединения могут образовываться (в зависимости от аминокислотной последовательности) при замыкании дисульфидных связей раствором трифторацетата таллия в трифторуксусной кислоте. Предложенный метод позволяет увеличить практическую значимость этого высокоэффективного реагента.

Синтезированные соединения были исследованы в опытах по связыванию с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами двух типов – природным мышечным нАХР из электрического органа ската T. californica и нейрональным α7 подтипом нАХР человека, трансфецированным в клетках GH₄C₁, а также ацетилхолин-связывающими белками из A. сalifornica и L. stagnalis. Новые аналоги [Н⁵]PnIA и [Н⁵, R¹⁴]PnIA показали более высокое сродство, чем природный пептид, к α7 нАХР и АХСБ из A. сalifornica. Пептиды, последовательности которых были выбраны на основании молекулярного моделирования, а именно [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA и особенно [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA, имели высокую селективность к Ас-АХСБ. Влияние замен в положениях 10 и 14 конотоксинов оказалось незначительным, хотя эффект этих модификаций был очевиден в случае Ls-АХСБ. Так, аналоги [L¹⁰]PnIA и [L¹⁰, R¹⁴]PnIA не различались по сродству к Ac-АХБС, так же, как и [D⁵,R⁷,V¹⁰]PnIA, [D⁵,R⁷,L¹⁰,R¹⁴]PnIA и [D⁵,R⁷,L¹⁰]PnIA. В целом, полученные результаты подтверждают предсказательную способность построенных моделей взаимодействия пептидных лигандов и АХСБ и их применимость в разработке веществ с заданными параметрами.


Выводы.


1. Разработаны оптимальные условия синтеза α-конотоксинов с использованием одновременного замыкания обеих дисульфидных связей при получении препаративных количеств в сочетании с поэтапным замыканием как для проверки корректности образования дисульфидов в природных α-конотоксинах, так и для получения их аналогов.

2. Исследовано влияние расположения пар ортогональных защитных групп остатков цистеина на выход конечного продукта; показана возможность использования трифторацетата таллия при замыкании дисульфидных связей для повышения выхода аналогов α-конотоксинов.

3. С использованием разработанных методик синтезированы 4 различных природных α-конотоксинов и 29 новых аналогов, в том числе с неприродным порядком замыкания дисульфидных связей.

4. Показано, что изменение размера первой цистеиновой петли в α-конотоксине MI не переключает его специфичность с никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) мышечного типа Torpedo californica в пользу нейронального α7 нАХР человека. На основе α-конотоксина PnIA получены аналоги, имеющие высокое сродство к α7 нАХР, а также аналог, селективный для ацетилхолин-связывающего белка A. californica.

5. С использованием α-конотоксина ImII и его ImII_изо аналога и радиоактивного производного [W10Y]ImII показано, что на α7 нАХР эти соединения взаимодействуют с классическим центром связывания агонистов и конкурентных антагонистов, но имеют иной центр связывания на АХР Torpedo californica.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Kasheverov I.E., Zhmak M.N., Fish A., Rucktooa P., Khruschov A.Yu., Osipov A.V., Ziganshin R.H., D.D`hoedt, Bertrand D., Sixma T.K., Smit A.B. and Tsetlin V.I. Interaction of α-conotoxin ImII and its analogs with nicotinic receptors and acetylcholine-binding proteins: additional binding sits on Torpedo receptor. J. Neurochem, 2009, 111 (4), 934-944.
   
2. Хрущёв А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Синтетические аналоги α-конотоксинов в исследовании лиганд-связывающих сайтов никотиновых рецепторов. Биологические мембраны, 2009, 26(4), 333-334.
   
3. Koval L., Lykhmus O., Zhmak M., Khruschov A., Tsetlin V., Magrini E., Viola A., Chernyavsky A., Qian J., Grando S., Komisarenko S., Skok M. Differential involvement of α4β2; α7 and α9α10 nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocyte activation in vitro. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2011, 43(4), 516-524.
   
4. Хрущёв А.Ю., Жмак М.Н., Цетлин В.И. Оптимизация ситеза α-конотоксинов. Тезисы докладов ХХI зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2009, Москва, 11.
   
5. Khruschov A.Yu., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Synthetic analogues of alfa-conotoxins in research of binding sites of nicotinic receptors. . Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 79.
   
6. Khruschov A.Yu., Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Radioactive derivatives of alpha-conotoxins for studies on nicotinic acetilcholone receptors. Abstracts of the 6 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2009, Salzburg, 80.
   
7. Khruschov A.Yu., Slovochotov I., Zhmak M.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Synthesis and characterization of novel alpha-conotoxin MII and PnIA analogs. Abstracts of the 7 Joint meeting of the European neuropeptide club and the summer neuropeptide conference, 2010, Pecs, 88.
   
8. Шелухина И.В., Струков А.С., Хрущёв А.Ю., Крюкова Е.В., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Никотиновые рецепторы мозга, вовлеченные в развитие нейродегенеративных и психических заболеваний. Тезисы докладов совещания «нейродегенеративные заболевания: современные представления о патогенезе, диагностике и лечении», 2010, Москва, 48.
   
9. Патентная заявка №2011104595. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством и селективностью к ацетилхолин-связывающему белку из Apysia californica. / Хрущев А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.
   
10. Патентная заявка №2011104596. Аналог альфа-конотоксина PnIA, обладающий высоким сродством к альфа7 типу никотинового ацетилхолинового рецептора. / Хрущев А.Ю., Жмак М.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., дата поступления заявки 10.02.2011.