Федеральное агентство по образованию бийский технологический институт (филиал)

Вид материала

2.5 Использование микроскопических грибов
3 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ IN VIVO 3.1 Регуляция метаболизма в микробной клетке
3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 19

2.5 Использование микроскопических грибов

Микроскопические грибы рода Rhizopus sp. используют для твердофазной ферментизации соевых бобов. Через три дня мицелий гриба разрастается и связывает бобы в корж, содержащий до 40 % белка. В Индонезии такой корж жарят и используют в супах как заменитель мяса. Такой продукт называют «темпех». Подобным образом в странах Африки и Востока ферментизируют различные зернобобовые культуры.

Преимуществом твердофазной ферментизации является снижение энергетических затрат, недостатком – низкая продуктивность.

Различные мицелиальные грибы выращивают на крахмальных (зерновых) материалах, кожуре цитрусовых, соломе, отрубях, шелухе. Используют их либо для обогащения белками кормов, либо из полученной биомассы выделяют ферменты.

Для получения пищевого продукта микопротеина культивируют гриб Fusarium graminearum. Его выращивают на дешевом глюкозном сиропе, полученном путем гидролиза пшеничного или кукурузного крахмала. Микопротеин хорошо переваривается. Ему придают консистенцию и аромат мяса, ветчины, кур, рыбы. Продукт долго сохраняет аромат и не дает усушки в процессе кулинарной подготовки. Промышленно выпускается в Великобритании.

3 МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ

IN VIVO

3.1 Регуляция метаболизма в микробной клетке

Каждое из множества разнообразных веществ создается в клетке в строго необходимых для роста пропорциях в результате ферментативных реакций. Координация химических превращений, обеспечивающая экономичность метаболизма, осуществляется у микроорганизмов тремя отдельными механизмами:

– регуляцией активности ферментов, в том числе ретроингибированием;

– регуляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия биосинтеза ферментов);

– катаболитной репрессией.

Ретроингибирование – это ингибирование по принципу обратной связи. При наличии в среде специфического субстрата начинает работать определенный фермент. Когда в результате многоступенчатых превращений накапливается конечный метаболит, то он тормозит работу фермента. С помощью этого механизма конечные продукты саморегулируют свой биосинтез:

.

Если продуцент выращивать на среде, содержащей аналог метаболита или антиметаболит, который не включаются в обмен веществ, то рост организмов будет подавляться. В этих условиях выживают лишь некоторые клетки. Выжившие мутанты будут обладать дефектами в механизме регулирования активности фермента по принципу обратной связи, поэтому они не чувствительны к концентрации конечного продукта и способны к сверхсинтезу.

Все биологические реакции осуществляются с помощью ферментов. Ферменты, содержащиеся в микроорганизмах, можно разделить на три группы:

конститутивные ферменты – ферменты, синтез которых не за-

висит от состава питательной среды (например, ферменты гликолиза);

адаптивные или индуцибельные ферменты – ферменты, которые

синтезируются в ответ на появление в питательной среде индукторов – субстратов или их структурных аналогов;

репрессибельные ферменты. Конечные продукты метаболизма

могут вызывать замедление или остановку всех ферментов соответствующего пути. Это явление называется репрессией.

.

Если концентрация конечного продукта снижается до определенного очень низкого уровня, то происходит дерепрессия ферментов, то есть скорость их биосинтеза увеличивается до необходимой величины.

Если в питательной среде присутствуют несколько различных источников углерода, то клетки микроорганизма вырабатывают ферменты для усвоения только одного, более предпочтительного. После его полного исчерпания происходит экспрессия ферментов метаболизма другого источника углерода. Это явление получило название катаболитной репрессии.

Таким образом, один источник углерода подавляет биосинтез ферментов, обеспечивающих метаболизм другого источника углерода.

3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов

В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется в экономичном режиме. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.

Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:

1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;

2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, алкилирующие агенты и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. Мутагены вызывают замены оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов (клон – генетически однородное потомство одной клетки). Отбирают наиболее продуктивные.

В результате мутаций микроорганизма исчезает эффект катаболитной репрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститутивными, то есть их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата.

Е

сли необходимо добиться накопления не конечного, а промежуточного продукта биосинтетического пути, то это может быть достигнуто с помощью мутанта, у которого блокирован этап синтеза:

Т

акой мутант ауксотрофен, то есть растёт только при добавлении в среду вещества, служащего продуктом блокированной реакции:

О