Ослин навчальний посібник до лабораторних занять з фізіології рослин для студентів біологічного факультету Видавництво поліграфічний центр "Київський університет" 2004
| Вид материала | Документы |
- Мусієнко М. М., Панюта О. О. Біотехнологія рослин. Навчальний посібник, 5445.72kb.
- Ділова іноземна мова" для студентів геологічного факультету (магістрів V-VI курсів), 329.16kb.
- Савицький В. М., Хільчевський В. К., Чунарьов О. В., Яцюк, 2100.06kb.
- Вченої ради біологічного факультету протокол №11 від 25 квітня 2005, 115.21kb.
- Тематичний план занять «Патофізіологія ендокринної та нервової систем» Для студентів, 1055.52kb.
- Київський університет туризму, економіки І права «Основи готельного менеджменту», 5077.65kb.
- Полтавський національний педагогічний університет імені В. Г. Короленка Історичний, 675.02kb.
- Практикум з педагогіки вищої школи: Навчальний посібник за модульно-рейтинговою системою, 411.72kb.
- Навчальний посібник для студентів філологічних спеціальностей вищих педагогічних навчальних, 3345.03kb.
- Практичний курс англійської мови навчальний посібник з практики усного та письмового, 5352.9kb.
Робота № 21. Підготовка зразків водних рослин для аналізу
вмісту мінеральних елементів в тканинах рослин .
Теоретичне обґрунтування. Аналіз рослинних тканин на вміст в них різних елементів включає декілька стадій: збирання зразків, їх підготовку, фіксацію, приготування розчинів, лабораторний аналіз, а також проведення розрахунків і інтерпретації отриманих результатів.
Необхідні частини рослини слід зібрати і очистити від забруднень, вони не повинні мати механічних пошкоджень. Кількість рослин повинна бути достатньо великою, щоб забезпечити можливість правильного відбирання середніх проб і отримання справжніх закономірностей.
При вирощуванні рослин в водних культурах, в кліматичних камерах, акваріумах частини рослин можна зібрати і використати для аналізів без будь-якої попередньої обробки. В разі збирання рослин в природних умовах не завжди можна отримати зразки рослинної тканини вільні від часток пилу, ґрунту, мулу та водоростей. В таких випадках перед аналізом зразок треба відмити. Інколи відмивання рослин супроводжується видаленням елементів із тканин, наприклад забруднення ґрунтом сильно викривлює результати вмісту заліза і майже не впливає на результати визначення бору, міді, марганцю або цинку.
В деяких випадках рекомендують протирати листки вологою тканиною, що особливо ефективно для гладеньких листків. Для листків, що мають опушення під час відмивання використовують розчин 0,5-1% -го м’якого детергенту з наступним ополіскуванням дистильованою водою.
Якщо аналіз проводять не відразу, зразки рослинного матеріалу висушують після фіксації їх паром або високою температурою. В останньому випадку зібрані тканини розміщують в чашках або коробках із міцного паперу в термостаті при температурі 105о С на 15-20 хвилин, а потім підсушують за більш низької температури (60-80о С), так як висушування при 100о С може призвести до викривлення дійсної маси тканини за рахунок летких властивостей частини органічних сполук .
Після висушування тканини подрібнюють. Спосіб подрібнення сухої тканини також обирають залежно від завдання досліджень. Так, механічні подрібнювачі з металевими частинами можуть забруднювати зразки залізом та міддю, тому при визначенні цих елементів слід користуватися пластмасовими або стальними подрібнювачами.
Для отримання гомогенатів із великих наважок свіжих рослинних тканин можна використовувати лабораторний подрібнювач ЛИ –1. Невеликі наважки розтирають у фарфорових ступках, однак і в цьому випадку гомогенат може бути забруднений деякими елементами, що присутні в глазурі ступки та товкачика. Найкраще в цих випадках використовувати ступки із органічного скла або тефлону. При найточніших аналізах (особливо при визначенні заліза) рослини краще розтирати в агатових ступках.
Слід, також, враховувати і контролювати розмір гомогенізованих часток. Подрібнення повинно бути рівномірним, а зразки рослинних проб гарно перемішаними. Так, наприклад, з’ясовано, що великі частинки тканини містять значно більше цинку, ніж дрібні .
Зразки після висушування залишаються гігроскопічними, тому для їх зберігання потрібні герметично закриті контейнери. Під час довгого зберігання краще використовувати ексикатори, а також тримати рослинний матеріал в темряві при низькій температурі (близько 0о С ).
Визначенню вмісту будь-якого хімічного елементу в рослині передує стадія розкладення (дигестії) зразка. В практиці біохімічного аналізу використовують в основному два методи – сухе та мокре озолення. В обох випадках забезпечується мінералізація всіх елементів, тобто перехід їх в форму, розчинну в тому або іншому неорганічному розчиннику.
Метод сухого озолення застосовують для аналізу вмісту в рослинному матеріалі майже всіх макро- і мікроелементів. Зазвичай сухе озолення рослинних зразків проводять в електричній муфельній печі у фарфорових, кварцових або металевих тиглях (або чашках) при температурі 450 –500о С.
Відносно низька температура під час спалювання і правильний вибір матеріалу тиглю дають змогу уникнути втрат внаслідок утворення погано розчинних в соляній кислоті окислів елементу, що визначають.
Перед озоленням наважку рослинного зразка мілко подрібнюють в гомогенізаторі або ступці і однорідні проби (після висушування при 105о С) зважують разом з тиглями на аналітичних терезах. Оскільки вміст різних мікроелементів в рослинних тканинах неоднаковий, величина наважки залежить від того, який із мікроелементів буде визначатися. Для визначення окремих елементів, як правило, беруть наступні кількості сухого рослинного матеріалу, або відповідні їм кількості свіжого: для заліза – 50-100 мг; міді – 200-500 мг; цинку – 50-200 мг; молібдену – 1-3 г; бора – 25-700 мг.
Перед тим як помістити матеріал в муфельну піч, його обвуглюють під інфрачервоним опромінювачем. Якщо для аналізу використовують сирий матеріал, його обвуглюють за допомогою етилового спирту (ректифікату), який підпалюють, додаючи невеликими порціями (0,5- 1 мл) безпосередньо до тиглю доти, доки його вміст не перетвориться на однорідну чорну масу. Для повного озолення тигель витримують в муфелі протягом 4-6 годин.
Значну роль під час сухого озолення грає ступінь ущільнення матеріалу, тому важливо вибирати тигель відповідного розміру. Наважка повинна бути насипана на дно рихлим шаром, щоб забезпечити доступ кисню до тканин що озоляють. Тиглі ставлять в холодний муфель, потім закривають дверцята, вмикають муфель і поступово нагрівають. Після завершення обвуглювання, дверцята краще відкрити (хоча б ненадовго, щоб збільшити кількість повітря).
Спалювання можна прискорити, додаючи до тиглю з обвугленим матеріалом речовину, що окислює рештки органіки, наприклад концентровану азотну кислоту ( 1-2 мл кислоти наливають в тигель, підсушують на плитці під витяжкою), після чого тигель ще на годину поміщають в муфель. Для окислення органічних речовин використовують також 30% Н2О2 ( 1-2 мл перекису водню додають в тигель і випаровують до сухого стану на водяній бані).
Після спалювання зола повинна мати рівномірне сірувате (інколи бурувате) забарвлення, без чорних вкраплень, не слід, також, допускати спікання.
Після охолодження до золи повільно приливають 5-20 мл 6 н НСl і розчиняють неорганічні солі під час нагрівання на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин. Розчин в тиглі, накритим часовим склом, декілька разів обережно перемішують. Потім вміст тигля переносять в центрифужні пробірки і після центрифугування (1000-1500 g) чистий розчин деканують в скляну мірну колбу з притертою пробкою.
Солянокислу витяжку або безпосередньо використовують для визначення мінеральних елементів (бору, молібдену, міді, цинку, марганцю), або розводять в 5-10 разів водою (при визначенні фосфору, калію, кальцію, магнію та заліза).
Замість центрифугування розчин можна профільтрувати через фільтр Нуча (№ 4), або міцний паперовий беззольний фільтр. В цьому випадку фільтрат кількісно переносять в мірну колбу потрібного об’єму (25-50 мл) і вже розведений розчин, безпосередньо, використовують для аналізу.
Для розчинення золи замість розведеної HCl інколи використовують концентровану HCl (1-2 мл). Отриманий розчин після додавання до нього 5-10 мл води фільтрують в мірну колбу (25 –50 мл).
Кількісне перенесення витяжки досягається багаторазовим змиванням тигля і фільтра невеликими порціями води. Після доведення розчину в мірній колбі водою до риски його ретельно перемішують. Такий розчин готовий для визначення вмісту із вихідної проби багатьох мінеральних елементів різними хімічними і фізико-хімічними методами.
Мокре озолення передбачає окислення рослинного матеріалу сумішшю кислот. Мокре озолення – процес більш швидкий, ніж сухе озолення, однак пов’язаний з постійним спостереженням за ходом дигестії. Як сильні окислюівачі використовують концентровані кислоти: сірчану, соляну, азотну та ін.
Зазвичай мокре озолення проводять в колбах Кьєльдаля за допомогою концентрованої сірчаної кислоти із розрахунку 1-2 мл на 1 г наважки і азотної кислоти з щільністю 1,4 ( 1-2 мл на 1 мл сірчаної кислоти). Вміст нагрівають, обережно струшуючи, щоб не допустити утворення піни і залишають стояти на спеціальних плитках до припинення виділення парів азотної кислоти. Плитка не повинна бути дуже гарячою, оскільки азотна кислота швидко розкладається і летить, не встигнув окислити органічні сполуки. Після повного окислення органіки рідина стає безбарвною. Якщо окислення не повне – в рідині є тверді включення або вона має забарвлення – в охолоджену колбу знову додають азотної кислоти і нагрівають до повного видалення бурих парів.
Після повного озолення рослинного матеріалу колби охолоджують повітрям або водою, переносять кількісно їх вміст в мірну колбу на 50 або 100 мл, залежно від вмісту елемента що визначають в наважці і обраного методу аналізу, і використовують для визначення елементів.
Паралельно з дослідними колбами ставлять контроль на реактиви, щоб запобігти неврахованих кількостей аналізованих елементів із кислот, які можуть бути забрудненими. В контрольні (без наважки рослин) колби Кьєльдаля додають ті ж самі кількості реактивів, що і в дослідні із зразками рослин і піддають їх тим самим процедурам, що і дослідні колби.
Якщо в розчині залишилося багато силікатів, які утворюють білий осад на дні колби, його фільтрують через паперовий беззольний фільтр. Фільтр з осадом вміщують в платиновий тигель, висушують та обвуглюють в муфелі або на плитці. Обвуглену масу змочують декількома краплинами води, додають краплю сірчаної кислоти і кілька мл плавикової кислоти і нагрівають на плитці під витяжкою до майже повного випаровування рідини. Золу, що залишилася розчиняють в соляній кислоті і з’єднують з вихідним фільтратом.
Мета роботи – ознайомитися з методами підготовки та аналізу рослинних тканин на вміст мінеральних елементів, провести сухе та мокре озолення водних рослин.
Матеріали і обладнання: водні рослини; аналітичні терези, муфель, термостат, електроплитка, водяна баня, центрифуга, ексикатор, колби Кьєльдаля, ступки, фарфорові або кварцеві тиглі, мірні колби на 25, 50 або 100 мл з притертими пробками; етиловий спирт, концентровані азотна , сірчана та соляна кислоти, Н2О2.
Хід роботи. Сухе озолення рослинного матеріалу. Наважку сухого рослинного матеріалу зжигають в тиглях, бажано кварцових, або фарфорових неглазурованих. Спалювання проводять в муфелях при температурі 450-500о С. Спалюють доти, доки в золі не залишиться чорних включень. Після спалювання наважки вміст тиглів переносять до мірних колб.
Золу змочують, додають по стінках чашки 2 мл конц. НСl (якщо є значний об’єм кремнієвої золи – 3-4 мл) і 0,3-0,4 мл (6-8 крапель) 30% Н2О2. При слабкому нагріванні випарюють до сухого стану. До сухого залишку ще раз додають 1,5- 2,0 мл конц. НСl, 2-3 краплі Н2О2 і знову випарюють до сухого залишку.
Сухий залишок розчиняють додавши 1,5 мл НСl і 10 мл гарячої дистильованої води, яка підкислена НСl (1:100). Після остаточного фільтрування першої порції розчину золи, чашку, а потім і фільтр 2-3 рази знову промивають гарячою водою із промивалки. Кожну порцію промивають окремо. Розчин доводять до риски водою, яка підкислена НСl. Для контролю в чашці випарюють такі ж кількості кислот і Н2О2 , які брали для аналізу.
Мокре озолення рослинного матеріалу. Наважку сухого рослинного матеріалу занурюють в колби Кьєльдаля і додають конц. сірчаної кислоти із розрахунку 1-2 мл на 1 г наважки і азотної кислоти з щільністю 1,4 ( 1-2 мл на 1 мл сірчаної кислоти). Вміст нагрівають, обережно струшуючи, щоб не допустити утворення піни і залишають стояти на спеціальних плитках ( не дуже гарячих) до припинення виділення парів азотної кислоти. Після повного окислення органіки рідина стає безбарвною. Якщо рідина містить тверді включення або вона має забарвлення – в охолоджену колбу знову додають азотної кислоти і нагрівають до повного видалення бурих парів.
Після повного озолення рослинного матеріалу колби охолоджують повітрям або водою, переносять кількісно їх вміст в мірну колбу на 50 або 100 мл, залежно від вмісту елемента що визначають в наважці і обраного методу аналізу, і використовують для визначення елементів.
Паралельно з дослідними колбами ставлять контроль на реактиви, щоб запобігти неврахованих кількостей аналізуємих елементів із кислот, які можуть бути забрудненими. В контрольну колбу (без наважки рослин) додають такі ж кількості реактивів, що і в дослідні із зразками рослин і піддають їх тим самим процедурам, що і дослідні колби.
Отримані розчини аналізують на атомно-адсорбційному спектрофотометрі. Роблять висновки.
Список літератури.
Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура.–Л.,1975. 329 с.
Гідроекологічна токсикометрія та біоіндикація забруднень: Теорія, методи, практика використання./ За ред. Олексіва І.Т., Брагінського Л.П. –Львів: Світ, 1995. –440 с.
Дубына Д.В.,Гейны С., Гроудова З. Макрофиты – индикаторы изменений природной среды.К.: Наук.думка, 1993, 436 с.
Катанская В.М. Высшая водная растительность континентальных водоемов СССР.Методы изучения. –Л.: наука, 1981, 187 с.
Лукина Л.Ф., Смирнова Н.Н. Физиология высших водных растений.-К. Наук.думка, 1988, -186 с.
Методы фенологических наблюдений при ботанических исследованиях. –М.-Л. Наука,1966, 103 с.
Мусієнко М.М., Серебряков В.В., Брайон А.В. Екологія. Охорона природи. Словник-довідник. К.:Знання, 2002, 552 с.
Мусієнко М.М. Фізіологія рослин. – К.:Фітосоціоцентр, 2001. – 392 с.
Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений./ Под ред.В.А.Абакумова, Л.:Гидрометеоиздат, 1983, 240 с.
Смирнова Н.Н., Сиренко Л.А. Цитофизиологический метод экспресс-оценки токсичности природных вод // Гидробиол. журн. – Т.29, №4, 1993. С.95-101.
Фрей-Висслинг А. Сравнительная органелография цитоплазмы. –М., 1976. 144 с.
Шенников А.П. Введение в геоботанику. –Л.: Изд-во ЛГУ, 1964.
ЗМІСТ
| Вступ…………………………………………………………………………… | 3 |
| Польові методи дослідження водних рослин………………………….. | 4 |
| Робота № 1. Визначення видів та екологічних груп вищих водних рослин……………………………………………………………………………... | 4 |
| Робота № 2. Вивчення характеру розподілу рослинності у водоймах залежно від факторів довкілля…………………………………… | 6 |
| Робота № 3. Вивчення складу і будови рослинних угруповань водних фітоценозів……………………………………………………………… | 9 |
| Робота № 4. Проведення еколого-фітоценологічної класифікації водної рослинності за А.П.Шенніковим……………………………………… | 11 |
| Робота № 5. Збирання та якісний облік водної рослинності за допомогою інструментів та приладів…………………………………………. | 12 |
| Робота № 6. Проведення кількісного обліку водних рослин…………. | 15 |
| Робота № 7. Визначення продуктивності водних рослинних угруповань………………………………………………………………………… | 18 |
| Робота № 8. Якісний і кількісний облік кореневої системи водних рослин різних екологічних груп………………………………………………... | 19 |
| Робота № 9. Вимірювання відстаней та прокладання профілів та трансект на воді………………………………………………………………….. | 22 |
| Робота № 10. Проведення картування водної рослинності на водоймі. | 20 |
| Лабораторні методи дослідження водних рослин……………………... | 25 |
| Анатомічні методи дослідження водних рослин……………………….. | 25 |
| Робота № 11 . Особливості анатомічної будови водних рослин різних екологічних груп…………………………………………………………. | 25 |
| Цитофізіологічні методи дослідження водних рослин………………… | 33 |
| Робота № 12. Визначення структурної в’язкості протоплазми плазмолітичним методом……………………………………………………… | 33 |
| Робота № 13. Визначення в’язкості протоплазми водних рослин методом центрифугування…………………………………………………….. | 35 |
| Робота № 14. Визначення швидкості руху хлоропластів в клітинах вищих водних рослин за методом Н.М.Смірнової, Л.Я.Сіренко………… | 36 |
| Робота № 15. Оцінка змін у прижиттєвому забарвленні клітин вищих водних рослин у відповідь на дію модельних токсикантів………. | 38 |
| Робота № 16. Визначення періоду фотовицвітання хлоропластів в нормі та під дією токсикантів за допомогою люмінесцентного мікроскопу………………………………………………………………………… | 40 |
| Фізіолого-біохімічні методи дослідження водних рослин……………. | 43 |
| Робота № 17.Визначення продукції та деструкції органічної речовини водних рослин йодометричним методом Вінклера …………… | 43 |
| Робота № 18. Оцінка впливу зовнішніх умов на інтенсивність фотосинтезу гідрофітів………………………………………………………… | 45 |
| Робота № 19. Спектрофотометричне визначення та хроматографічне розділення пігментів вищих водних рослин…………... | 47 |
| Робота № 20. Культивування водних рослин з родини ряскових. | 51 |
| Робота № 21. Підготовка зразків водних рослин для аналізу вмісту мінеральних елементів в тканинах рослин…………………………………. | 53 |