Ослин навчальний посібник до лабораторних занять з фізіології рослин для студентів біологічного факультету Видавництво поліграфічний центр "Київський університет" 2004

Вид материала

Документы

Содержание Робота № 15. Оцінка змін у прижиттєвому забарвленні клітин Матеріали і обладнання. Хід роботи. Робота № 16. Визначення періоду фотовицвітання хлоропластів Мета роботи. Хід роботи. Фізіолого-біохімічні методи дослідження водних рослин. Матеріали і обладнання. Хід роботи. Робота № 18. Оцінка впливу зовнішніх умов на Матеріали і обладнання Хід роботи.

Подобный материал:

• Мусієнко М. М., Панюта О. О. Біотехнологія рослин. Навчальний посібник, 5445.72kb.
• Ділова іноземна мова" для студентів геологічного факультету (магістрів V-VI курсів), 329.16kb.
• Савицький В. М., Хільчевський В. К., Чунарьов О. В., Яцюк, 2100.06kb.
• Вченої ради біологічного факультету протокол №11 від 25 квітня 2005, 115.21kb.
• Тематичний план занять «Патофізіологія ендокринної та нервової систем» Для студентів, 1055.52kb.
• Київський університет туризму, економіки І права «Основи готельного менеджменту», 5077.65kb.
• Полтавський національний педагогічний університет імені В. Г. Короленка Історичний, 675.02kb.
• Практикум з педагогіки вищої школи: Навчальний посібник за модульно-рейтинговою системою, 411.72kb.
• Навчальний посібник для студентів філологічних спеціальностей вищих педагогічних навчальних, 3345.03kb.
• Практичний курс англійської мови навчальний посібник з практики усного та письмового, 5352.9kb.

Робота № 15. Оцінка змін у прижиттєвому забарвленні клітин

вищих водних рослин у відповідь на дію

модельних токсикантів.

Теоретичні передумови. Більшість клітин позбавлені зручних функцій, що легко реєструються під мікроскопом, за якими можна було б робити висновок про стан їхньої життєдіяльності і про пошкодження в його початковій оборотній фазі. Однією з таких функцій є здатність непошкоджених живих клітин відкладати у вигляді гранул багато речовин, як ті, що виробляються у самій клітині, так і ті, що проникають в неї ззовні. До таких речовин, зокрема, належать деякі прижиттєві барвники (нейтральний червоний, малахітовий зелений, метиленовий синій та ін.). Серед них особливою універсальністю і зручністю застосування характеризується нейтральний червоний, який належить до слабких основ. Барвники, що проникли у цитоплазму клітини, спочатку розташовані в ній дифузно, а потім клітина конденсує їх у області апарата Гольджі у вигляді гранул. Такі барвники називають гранулярними. Гранули нейтрального червоного і дифузний розподіл його добре видно під звичайним світловим мікроскопом. У міру накопичення барвника кількість і розміри гранул збільшуються, і вони, виходячи за межі зони апарата Гольджі, поширюються по всій цитоплазмі.

Відкладати гранули здатні лише здорові, повноцінні клітини. Наростання негативної дії будь-якої природи пригнічує цю функцію, аж до повного припинення її. Замість гранулярного відкладання у пошкодженій клітині барвник дифузно забарвлює цитоплазму і ядро. Повне пригнічення гранулоутворення та інтенсивне дифузне забарвлення протоплазми у разі дії деяких агентів виявляють ще на зворотній фазі пошкодження, і, після усунення діючого агента, у клітині відновлюється нормальне грануловідкладання, а дифузно-забарвлена протоплазма знебарвлюється. Здатність до гранулоутворення може паралізувати токсична дія самих барвників, якщо їх використовують у дуже високих концентраціях.

Основні барвники при рН близькому до нейтрального, як правило, містяться у клітинній вакуолі. Залежно від складу вакуолярного соку, вакуоля забарвлюється дифузно, або відбувається відокремлення барвника і утворення в ній інтенсивно забарвлених краплин коацервату або грон гранул різної форми і калібру; іноді утворюються кристали барвника. Очевидно, що в рослинних клітинах сегрегація речовин у вакуолі захищає протоплазму від токсичної дії їх, бо при зв`язуванні в гранули знижується концентрація речовин, що можуть завдати шкоди клітині.

Механізми взаємодії вітальних барвників і клітини сьогодні інтенсивно вивчають. Значним успіхом досліджень цього плану стала ідентифікація цитоплазматичних органоїдів, які відповідають за процеси накопичення вітального барвника в гранулах. Останнім часом доведено, що гранули, які спостерігають під мікроскопом, є не чим іншим, як лізосомами, що акумулювали барвник. Відомо, що значення лізосом у розвитку будь-якої клітинної патології велике і різноманітне, що, навіть, важко відшукати патологічний процес, в якому б лізосомальний апарат не брав би активної участі. Встановлений, також, універсальний характер участі лізосом під час деструкції будь-якої речовини, що проникає до клітини. Ця властивість лізосом підсилює неспецифічність методу вітального забарвлення, який, по-суті, є методом візуалізації лізосом.

Не зважаючи на те, що метод мікроскопії прижиттєво забарвлених клітин не має простого кількісного вираження результатів спостереження і це перешкоджає його використанню як самостійного маркера під час моніторингових досліджень, його доречно використовувати як додатковий з іншими цитоекологічними методами.


Матеріали і обладнання. Водні рослини (валіснерія, елодея та наяда); біхромат калію, вітальний барвник – 0,01% нейтральний червоний; світловий мікроскоп, склянки на 100 мл, предметні та накривні скельця, піпетки на 10 мл, мірні колби на 100 мл.

Хід роботи. Готують серію концентрацій модельного токсиканта -K₂Cr₂O₇. Дослідні рослини (валіснерія, елодея та наяда ) вміщують у скляні ємності об`ємом 100-200 мл і експонують їх в розчинах модельних токсикантів протягом 1 год. Після закінчення експозиції частину листків з дослідних рослин переносять у розчин барвника (0,1% розчин нейтрального червоного), в якому їх витримують ще 1 год. Із забарвлених рослин готують тимчасові препарати і під світловим мікроскопом проводять спостереження. У рослин елодеї та наяди використовують верхівкові пагони, у валіснерії – частину рослини біля основи, де розміщені молоді клітини. Другу частину рослини переносять у ємності з чистою водою і експонують їх ще 1 год для з`ясування концентрацій токсиканта при яких можливе відновлення здатності клітин до гранулоутворення. Після експозиції з них так само готують тимчасові препарати.

Оцінюють ступінь відокремлення барвника у клітинах досліджуваних рослин:

відсутність гранулоутворення (дифузне забарвлення ) – (-);

слабке (поодинокі гранули) – (+);

середнє (невеликі грона на фоні поодиноких гранул) – (++);

інтенсивне (великі грона гранул) – (+++);

та ступінь забарвлення:

відсутність забарвлення - 0;

слабке (світло-рожеве) – 1;

середнє (інтенсивно-рожеве) - 2;

інтенсивне (яскраво малинове) – 3.

Результати записують у таблицю:

Вид рослини / концентрація токсиканта, мг/л	Рослини після експозиції в розчинах токсикантів	Рослини з розчинів токсиканта після експозиції в чистій воді
Грануляр-не забарв-лення	Дифузне забарв-лення	Гранулярне забарв-лення	Дифузне забарв-лення

Роблять висновки щодо зворотного і незворотного пошкодження клітин різними концентраціями модельного токсиканта.


Робота № 16. Визначення періоду фотовицвітання хлоропластів

в нормі та під дією токсикантів за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Теоретичні передумови. Метод люмінесцентної мікроскопії відбиває ураженість клітин водних рослин при дії токсичних речовин, а також специфічність процесів розвитку та розпадання клітин рослин в природних умовах. Ранні зміни в перебудові пігментного апарата рослинної клітини можна встановити, спостерігаючи за змінами флуоресценції хлорофілу.

Флуоресценція – один із шляхів розсіювання енергії, яка поглинається пігментом хлорофілом під час опромінення. Поглинувши квант світла молекула пігменту хлорофілу переходить з основного синглетного енергетичного стану у збуджений синглетний стан, який характеризується більшою енергією. У збудженому стані молекула перебуває незначний проміжок часу, а при поверненні у основний стан може випромінювати енергію у вигляді кванта світла – флуоресценції, за умови що вона не бере участі у фотоперенесенні електронів. Оскільки, за час існування у збудженому стані молекула втрачає частину енергії на коливання, то величина випромінюваного кванта флуоресценції менша, ніж енергія поглинутого, в результаті довжина хвилі флуоресценції більша за довжину хвилі поглинутого світла (закон Стокса).

Основним пігментом, що флуоресціює є хлорофіл а. Інші пігменти починають флуоресціювати лише тоді, коли не можуть передати енергію збудження хлорофілу а. Функціонування пігментного комплексу, зокрема хлорофілів, що флуоресціюють ( та інших пігментів, які потенційно здатні до цього), залежне від токсикантів різної природи. Різке зниження фотохімічної активності хлорофілу є наслідком пригнічення фотосинтетичної діяльності рослини.

Спектр флуоресценції хлорофілу знаходиться в червоній та ближній інфрачервоній областях (від 660 до 820 нм) і складається з кількох дискретних максимумів. Хлоропласти з флуоресціюючим хлорофілом мають вигляд яскравих червоних тілець на зеленому фоні клітини. Яскраво-червоні хлоропласти фотовицвітають під дією синьо-фіолетового концентрованого збуджуючого світла, що чітко реєструється зникненням червоної та появою білої флуоресценції пластид. Швидкість затухання червоної флуоресценції залежить від вмісту та стану хлорофілів, а період фотовицвітання хлорофілу може бути гарним цитофізіологічним показником на токсичний вплив, оскільки за наявності токсикантів, відповідно, зменшується період фотостійкості хлоропластів, який можна легко виміряти за допомогою секундоміра. Зміни рівня флуоресценції клітин дають змогу встановити первинну реакцію фотосинтетичного апарата клітини вже через 5-10 хвилин після контакту рослини з токсикантом. Оскільки занурені вищі водні рослини характеризуються постійністю кількісного вмісту хлорофілів незалежно від умов середовища, метод визначення періоду фотостійкості хлоропластів можна рекомендувати як показник фізіологічного стану як самої рослини, так і якості водного середовища, яке оточує цю рослину. Особливо зручно використовувати цей метод для виявлення екстремальних або одноразових випадків забруднення водойм. Якщо токсичні речовини швидко деградують у воді, то за відновленням рівня флуоресценції хлорофілу можна робити висновок про адаптаційні можливості фотосинтетичного апарата клітин водних рослин.

Мета роботи. Визначити період фотовицвітання хлоропластів в клітинах водних рослин під дією модельного токсиканта - К₂Cr₂O₇.

Матеріали і обладнання: занурені водні рослини (валіснерія, елодея та наяда); біхромат калію; люмінесцентний мікроскоп, секундомір, склянки на 100 мл, предметні стекла та накривні скельця, піпетки на 10 мл, мірні колби на 100 мл.

Хід роботи. Дослідні рослини (валіснерія, елодея, наяда ) експонують в розчинах модельного токсиканта ( К₂Cr₂O₇ ) різної концентрації (0,01; 0,1; 1,0 мг/л, або ін.) на світлі протягом 1 год. Як контроль використовують відстояну водопровідну воду, або воду з акваріума, в якій вирощені дослідні рослини. Після закінчення експозиції з листків рослин готують тимчасові препарати і під люмінесцентним мікроскопом проводять спостереження. У рослин елодеї та наяди використовують верхівкові пагони, у валіснерії – частину рослини біля основи, де розташовані молоді клітини.

Період фотовицвітання хлоропластів під дією люмінесцентного світла, який супроводжується зникненням червоної та появою білої флуоресценції пластид вимірюють за допомогою секундоміра.

Результати досліджень заносять до таблиці:

Вид рослини	Концентрація К2Cr2O7, мг/л	Період фотовицвітання хлоропластів, с
Елодея Наяда Валіснерія

У висновку відмічають концентрації модельного токсиканта, що спричинили токсичний вплив і чутливість видів водних рослин за досліджуваним показником.

Фізіолого-біохімічні методи дослідження водних рослин.


Робота № 17. Визначення продукції та деструкції органічної

речовини у водних рослин йодометричним

методом Вінклера .

Теоретичне обґрунтування. Ідею щодо можливості вимірювання швидкості новоутворення органічної речовини за зміною концентрації кисню в склянках після їх експозиції вперше висунув Пюттер в 1908 році. Згодом цей підхід став загальноприйнятим і сьогодні його широко використовують під час визначення продукції макрофітів та фітопланктону. Визначення продукції макрофітів кисневим методом базується на вимірюванні кількості виділеного під час фотосинтезу кисню, яка пов’язана з новоутвореною органічною речовиною прямою залежністю, як це видно із балансового рівняння фотосинтезу:

СО₂ + 2Н₂О = (СН₂О)_n + О₂.

При використанні цього методу проби досліджуваної води з водними макрофітами в склянках експонують в умовах подібних до природних – “in situ”, або за штучного освітлення.

Концентрації кисню у воді найчастіше визначають методом Вінклера. Останнім часом широко розповсюдилися також електрохімічні методи визначення кисню у воді.

Йодометричний метод визначення кількості виділеного або поглинутого кисню (метод Вінклера) базується на послідовних хімічних реакціях.

Зв’язування кисню, що міститься в склянці, відбувається шляхом наступних реакцій:


2MnCl₂ + 4NaOH = 2Mn(OH)₂ + 4NaCl ,


2Mn(OH)₂ + ½ O₂ + H₂O = 2Mn(OH)_{3 .}


Подальше підкислення при наявності KJ призводить до виділення вільного J₂ у кількості, еквівалентній зв’язаному кисню:


2Mn(OH)₃ + KJ + 3H₂SO₄ = K₂SO₄ + 2MnSO₄ + 6H₂O + J₂.


Йод, що виділяється відтитровують розчином гіпосульфіту відомої нормальності при наявності крохмалю в якості індикатора:


J₂ + 2Na₂S₂O₃ = 2NaJ + Na₂S₄O₆.


Слід зазначити, що йодометричний метод визначення кисню дає гарні результати лише під час аналізу порівняно чистих вод, які не містять у великих кількостях нітратів, солей тривалентного заліза, сірководню, а також розчинених органічних сполук. Крім того, за методом Вінклера враховують лише кисень розчинений у воді. Кисень, який залишається у міжклітинних порожнинах і повітряних каналах водних рослин не враховують.

Матеріали і обладнання. Занурені водні рослини; колби з широким горлом на 100 мл з притертими пробками, піпетки, бюретка, колби Ейленмейєра.

Реактиви та їх приготування:

1. Розчин MnCl₂. 40 мг MnCl₂ (або еквівалентну кількість MnSO₄) розчиняють в дистильованій воді і доводять об`єм розчину до 100 мл. В разі появи каламуті розчин треба профільтрувати. Сіль марганцю не повинна містити заліза.
   
2. Розчин NaOH + KJ. 33 г NaOH (або еквівалентну кількість KOH ) розчиняють у дистильованій воді, додають 20 г KJ і доводять розчин до 100 мл. Якщо розчин мутний, його слід профільтрувати крізь скляний фільтр або скляну вату.
   
3. 0,1 н розчин Na₂S₂O₃ (гіпосульфіт натрію). Розчин готують на воді, звільненій від CO₂ кіп`ятінням, і зберігають у темній склянці. Для кращого зберігання в розчин додають кілька мл ксилолу або толуолу.
   
4. Чиста концентрована соляна або сірчана кислоти.
   
5. 10%-ий розчин KJ (свіжеприготовлений).
   
6. 1%-ий розчин крохмалю. 1 г крохмалю розчиняють в кількох мл холодної води і вливають отриманий розчин в 100 мл киплячої води. Кип`ятять кілька хвилин, доки розчин не стане прозорим.
   

Хід роботи. Колби з широким горлом на 100 мл з притертими пробками заповнюють відстояною водопровідною водою з постійним вмістом кисню і вносять туди дослідні рослини – невкорінені гідатофіти (елодею, наяду, рдест, кушир або ін.).

Рослини підбирають подібні за зовнішнім виглядом, приблизно однакового розміру, без видимих пошкоджень. Перед зануренням їх в колби рослини зважують на аналітичних терезах.

Колби закривають таким чином, щоб в них не залишилося пухирців повітря, для цього дають змогу воді деякий час переливатися через край, і експонують їх в оптимальних умовах температури (20-27 ^оС) і освітлення (1800-2000 Лк) для визначення продукції, або в темряві – для визначення деструкції органічної речовини).

Одночасно з дослідними колбами експонують контрольні колби з водою або з досліджуваними рідинами (залежно від схеми досліду), але без рослин. Повторність має бути трикратною. Щоб визначити продукцію експозиція дорівнює 30-60 хв, для визначення деструкції вона має бути довшою – не менше 120 хвилин.

Після закінчення експозиції рослини із колб обережно виймають і довгою піпеткою вводять на дно колби по 1 мл 40%-го MnCl₂ і 1 мл 30%-го NaOH (з додаванням 10 г KIO₃ на 100 мл розчину), не струшуючи. Піпетку кожний раз занурюють спочатку до половини колби, а потім, у міру того як розчин виливається, піднімають її до верху. Кількість води, яка витискається цими розчинами (2мл), слід врахувати під час розрахунків вмісту кисню.

Знову ретельно закривають колбу, стежачи, щоб не було пухирців повітря. Розчин енергійно збовтують перевертаючи колбу, потім протягом 5-10 хвилин дають відстоятися білому осаду (осад, що утворився, повинен опуститися на дно ), після чого додають 2 мл концентрованої HCl, закривають і знов сильно струшують до повного розчинення осаду. Розчин буріє від йоду що звільнюється. Кількість рідини, яка витікає при додаванні кислоти, під час розрахунків не враховують, оскільки кисню в ній уже немає, він весь зафіксований в осаді.

В колби Ерленмейєра відбирають 25-30 мл розчину і титрують 0,1н розчином гіпосульфіту натрію майже до знебарвлення. Потім додають кілька краплин 1%-го розчину крохмалю і титрують до зникнення синього забарвлення. З’ясовано, що 1 мл 0,1 н гіпосульфіту відповідає 0,8 мг або 0,558 мл кисню при температурі 0^оС і тиску 760 мм рт. ст. Результати титрування трьох проб усереднюють і записують до таблиці.

Концентрації кисню в склянках обчислюють за формулою:


мг О₂/ л = n К 0,08 1000/ V,


де К – поправка до титру, n – кількість гіпосульфіту, що витратили на титрування проби (мл), а V- об’єм проби, що титрують.

Так як титр розчину гіпосульфіту з часом змінюється, треба вводити поправку (К). Для цього в окрему колбу додають 2 мл 10 % KJ, 3 мл H₂SO₄ і 20 мл точно виготовленого розчину 0,02 н K₂CrO₄. Через 2-3 хвилини цю суміш відтитровують розчином гіпосульфіту при наявності крохмалю як індикатора. Поправку до титру гіпосульфіту розраховують за формулою:


К = 20 мл K₂CrO₄ / V мл Na₂S₂O_3,


де V – кількість (мл) гіпосульфіту, яку витратили на титрування.

Валову (Р_g) і чисту (Р_n) продукції а також деструкцію (D) розраховують за формулами:

P_g = (V_c – V_т)/ t ,

P_n = (V_c – V_п)/ t ,

D = (V_п - V_т )/ t ,

де V_п – початкова концентрація кисню в склянці; V_с - кінцева концентрація кисню в світловій склянці після експозиції; V_т -кінцева концентрація кисню в темновій склянці після експозиції; D - концентрація кисню в темновій склянці після експозиції; t – час експозиції, год.

Результати заносять до таблиці:

Проба	V, мл Na2S2O3	Конц. О2, мг/л	t, год.	Продукція, мг O2 /л год.	Деструкція, мг О2 /л год.

Роблять висновки.


Робота № 18. Оцінка впливу зовнішніх умов на

інтенсивність фотосинтезу гідрофітів.

Теоретичне обгрунтування. Відомо, що при попаданні у воду токсичних речовин і зміні інсоляційного режиму у макрофітів найчастіше спостерігається порушення процесу фотосинтезу. Зміна стану фотосинтетичного апарата чітко відбиває зміну загально-фізіологічного статусу рослин і може бути показником, що інтегрально відбиває стан водойм. Інгібування процесу фотосинтезу у водних рослин призводить до зниження первинної продукції і зменшення вмісту кисню, порушення процесів фотосинтетичної аерації води, що перешкоджає природному самоочищенню водойм.

Для визначення інтенсивності фотосинтезу водних рослин можна використати метод підрахунку пухирців кисню. На світлі в листках відбувається фотосинтез, продуктом якого є кисень, який накопичується в міжклітинниках. Після зрізання стебла надлишок газу починає виділятися з поверхні зрізу у вигляді безперервного потоку пухирців, швидкість утворення яких залежить від інтенсивності фотосинтезу. Цей метод не досить точний, але простий і зручний у використанні. Крім того, за допомогою цього методу чітко реєструється залежність процесу фотосинтезу від зовнішніх умов.

Матеріали і обладнання: занурені водні рослини - елодея, наяда, роголисник, водопериця або ін.; двооксид соди, 1%-ий розчин К₂Cr₂O_7, 4%-ий розчин CuSO₄ 5Н₂О, насичений аміаком; кювета, пінцет, лезо бритви, пробірка, вставлена в колбу зі стоком внизу, лампа, секундомір, електроплитка, термометр, колби (3 шт), лінійка, спектроскоп, пробірки (2 шт).

Хід роботи. Помістити по гілці дослідних рослин з непошкодженою верхівковою брунькою в кювету з водою і гострою бритвою зробити зріз , щоб запобігти можливому закупорюванню шляхів проходження газів.

Занурити гілочки в пробірки з водою так, щоб зрізи розмістилися зверху. Воду попередньо збагачують діоксидом вуглецю шляхом розчинення невеликої кількості (на кінчику ножа) соди (NaHCO₃).

Помістити пробірки з дослідними рослинами в певні умови, почекати, доки встановиться рівномірний потік пухирців і за допомогою секундоміру підрахувати кількість пухирців, що виділилися за певний проміжок часу.

Використовуючи як джерело світла лампу з потужністю 100-200 Вт, провести наступні досліди:

а) З’ясувати вплив освітленості. Налити воду, попередньо нагріту до 20^o С, в колбу або скляний циліндр зі стоком внизу і вставити в цю судину пробірку з гілочкою дослідної рослини. Підрахувати кількість пухирців кисню, що виділяються на різних відстанях від джерела світла (20 см, 40 см, 60 см).

б) З’ясувати вплив спектрального складу світла. Підрахувати кількість пухирців при освітленні білим світлом (пробірка занурена в судину з водою). Потім провести спостереження при червоному екрані, замінюючи воду в посудині розчином K₂Cr₂О₇, який пропускає червоні, оранжеві та жовті промені і не пропускає синьо-фіолетові. Після цього визначити інтенсивність фотосинтезу при синьому екрані, наливши в судину розчин сірчано-аміачно-мідної солі, яка пропускає блакитні, сині та фіолетові промені, але затримує довгохвильову частину спектра.

Всі три спостереження проводять з розчинами однакової температури і на однаковій відстані від джерела світла. Спектральний склад світла, що пропускають забарвлені розчини, перевіряють за допомогою спектроскопу. Замість рідких екранів можна використати скляні світлофільтри, що пропускають промені певної довжини хвилі.

в) З’ясувати вплив температури. Налити в судину спочатку теплу, а потім холодну воду і провести підрахунки пухирців при однакових відстанях від джерела світла.

Результати записати в таблицю:

Об’єкт Досліджень	Екран	Відстань від джерела світла, см	Темпера- тура, оС	Кількість пухирців кисню за 5 хвилин
	Білий Червоний Синій

Зробити висновки про вплив досліджених факторів на інтенсивність фотосинтезу.