Автореферат диссертации на соискание ученой степени
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
- Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
- Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
- L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.
На правах рукописи
МАТВЕЕВА
ИРИНА НИКОЛАЕВНА
ПРОМЫШЛЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ МОНО- И КОМПЛЕКСНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ
03.00.23-биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Щелково-2008 г.
Работа выполнена в ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" РАСХН
Научный консультант: доктор биологических наук
Клюкина Валентина Ивановна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Цыбанов Содном Жамьянович
доктор биологических наук, профессор
Смоленский Владимир Иванович
доктор ветеринарных наук, профессор
Мищенко Владимир Александрович
Ведущая организация: ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский
институт экспериментальной ветеринарии
им. Я.Р. Коваленко" Россельхозакадемии
Защита состоится "26" декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 при ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский р.-н., пос. Биокомбината, п/о Кашинцево, ВНИТИБП; е-mail: vnitibp@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан " " 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов
1. ОБЩАЯ ХАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы. Одним из основных направлений биотехнологического производства является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами.
Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества, стандартизация диагностикумов для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей.
Реализация идеи создания диагностических наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенных фракций вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в иммунитете. Приготовление высокоактивных специфических сывороток требует наличие максимально очищенных антигенов, хорошо воспроизводимых схем иммунизации, оптимального донора, а также изучение возможности применения современных эффективных иммуностимуляторов.
Каждый диагностический набор содержит строго индивидуальный состав специфических и химических компонентов, применение которых по отработанной для данной инфекции методике, позволяет достигать желаемой цели исследования.
Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняет постановку диагноза, поэтому этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ.
В этой связи актуальным является совершенствование методов диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технологии изготовления моно- и комплексных диагностикумов.
Оперативный анализ структуры заболеваний, определение этиологической роли каждого возбудителя в условиях ассоциативных форм инфекций предполагает использование ИФА как метода комплексной дифференциальной диагностики в составе поликомпонентных диагностических тест-систем.
1.2. Обоснование выбора объектов исследования. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека - бешенства. В настоящее время в Российской Федерации сложилась напряженная эпизоотическая ситуация с бешенством животных, имеющим большое социально-экономическое значение. Активные природные очаги бешенства зарегистрированы в различных регионах страны. Эпизоотии бешенства поддерживаются в основном за счет диких животных, однако в процесс активно вовлекаются бродячие собаки и кошки. (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001)
Основным средством борьбы с бешенством является эффективная специфическая иммунопрофилактика и своевременная диагностика.
Достоверность диагностики находится в зависимости от качества используемых реагентов: активности и специфичности антирабических иммуноглобулинов. Поэтому очень важно своевременно совершенствовать и проводить промышленный выпуск эффективных компонентов диагностикумов бешенства животных.
Лептоспироз относится к числу распространенных природноочаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней.
Молекулярно-биологичсекие методы играют важную роль при изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов. Наличие фундаментальных исследований нуклеиновых кислот лептоспир, а также работ по геносистематике этих организмов позволяет сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с лептоспирозом. Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в инфекционном материале. Интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир позволяют проводить анализ возможностей практического применения рестриктазного анализа и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации. В связи с этим были предложены или разрабатываются методы, позволяющие выявлять индивидуальные особенности сероваров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B.,1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L.,1992, Merien F. et al.1992).
Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые Токаревич К.Н. (1947г.), Ананьин В.В. (1949,1951 г.), Киктенко В.С.(1938,1970-1983гг.), Любашенко С.Я.(1945г.), Малахов Ю.А. (1971,1979,1992), Ежов Г.И. (1979,1983,1985гг.) и другие. До настоящего времени общепринятым методом диагностики лептоспироза остается реакция микроагглютинаци (РМА).
Массовые заболевания телят с симптомами поражения дыхательных путей представляют наиболее сложную серьезную проблему для животноводческих хозяйств во многих регионах России.
В связи с этим остаётся актуальной проблема серологического мониторинга и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации животных на ограниченных площадях, при постоянном перемещении из одной технологической группы в другую, формировании новых групп не всегда однородных по возрасту и иммунному статусу, часто проявляются у молодняка.
Так как в инфекционном процессе могут участвовать большое число микроорганизмов различной природы, как правило, значительная роль принадлежит нескольким возбудителям - инфекционному ринотрахеиту (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), парагриппу-3, респираторно-синцитиальной (РС) и аденовирусной (АВ) инфекциям. Эти заболевания представляют значительную проблему в ветеринарии ещё и потому, что протекают со сходными клиническими симптомами. По этой причине особенно велика роль лабораторной диагностики указанных выше вирусных болезней крупного рогатого скота.
Значительный вклад в изучение вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота внесли Бучнев К.Н. (1965), Назаров В.П. (1967), Макаревич В.Г. (1967), Куличкин В. (1951), Сюрин В.Н. (1978), Халенев Г.А. (1975), Гуненков В.В (1975), Мищенко В.А. (2001), Красочко П.А. (1997), Глотов Г.П.(1998), Кузнецова С.В. (1991), Жидков С.А. (1994), Юров К.П. (2003) и другие ученые.
Респираторные болезни являются основной причиной вынужденного убоя и гибели телят в послеотъемный период. По широте распространения, смерти, вынужденному убою, недополучению привесов они превалируют над всеми другими патологиями.
Популярность ИФА для изучения бактериальных и вирусных инфекций широка. ИФА пришел на смену трудоёмким, малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента.
Важным этапом контроля и искоренения заболеваний является лабораторная диагностика инфекций, которая в большинстве случаев основывается на выявлении специфических антител в сыворотках крови инфицированных и переболевших животных. В настоящее время разработаны средства и методы диагностики, позволяющие в короткие сроки выявлять большинство инфекционных заболеваний. Однако диагностика при смешанных инфекциях представляет сложную, но актуальную проблему и требует разработки и внедрения в ветеринарную практику современных диагностических наборов на основе высоко чувствительных множественно -антигенных тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА).
Несмотря на то, что диагностика многих моно - инфекций решена на уровне практического применения наборов ИФА, ветеринарная практика России не располагает диагностическими наборами для проведения комплексного дифференциального серологического мониторинга респираторных инфекций крупного рогатого скота. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может служить создание тест-систем ИФА, в которых число антигенов и их природа зависит от цели исследования.
Перечисленные выше нерешенные вопросы, указывают на актуальность намеченных исследований.
1.3. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. Усовершенствовать получение антирабических гипериммунных, а также противовирусных, специфических анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД- БС, анти-РС, анти-АВ и отрицательных-референс сывороток крови животных.
2. Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций в биологических жидкостях организма животных.
3. Оптимизировать условия проведения комплексной тест-системы ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, взятых в одном разведении.
4. Определить диагностическую ценность разработанной комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и аденовирусной инфекций в сравнении с методами аналогичной направленности.
5. Разработать технологию производства и применения комплексного ИФА-набора с определением стабильности его компонентов при хранении.
6. Провести испытание комплексной тест-системы ИФА по выявлению специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС, АВ в практических условиях с использованием сывороток крови крупного рогатого скота, полученных от иммунных и неиммунных животных различных половозрастных групп.
7. Клонировать ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих случайные фрагменты генома L. pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.
8. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, пригодный для использования в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Исследовать возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.
1.3. Научная новизна.
Усовершенствована схема получения гипериммунной антирабической сыворотки.
На основе иммунохимически охарактеризованных специфических реагентов разработан метод комплексного непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекций в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и оптимизированы условия его проведения при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью разноплановых методов оценки специфического гуморального иммунного ответа (положительные решения на изобретение № 2008126759 и №2008126758).
В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения высокоактивных специфических положительных и отрицательных референс-сывороток.
Разработана технология изготовления иммунореагентов комплексной иммуноферментной тест-системы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БC, РС и АВ инфекций крупного рогатого скота.
Проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona и на основе этого создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир. Получен ДНК-зонд, позволяющий дифференцировать производственные штаммы лептоспир.
Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением: по заявкам на изобретение № 2008126759 и №2008126758.
1.4. Практическая значимость работы. Результаты НИР внедрены в ветеринарную практику.
Схема получения антирабической сыворотки иммунизацией баранов фиксированным вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Получение антирабической сыворотки собаки фиксированным вирусом бешенства штамм "CVS" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".
Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", которые утверждены научно-методической комиссией ВНИТИБП 17 сентября 1993 года и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных.
Хроматографически очищенный белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами использовали в "Инструкции по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных", утвержденной 22.01.2006 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкции по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".
Результаты проведенных исследований позволили разработать "Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на методической комиссии ВНИТИБП и на секции "Ветеринарная биотехнология" ОВМ РАСХН, протокол №1; Временную инструкцию по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к антигенам вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе и проект нормативной документации. Тест-система ИФА предназначается для индикации и количественного определения антивирусных антител в сыворотках крови, молоке и молозиве крупного рогатого скота.
Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора для определения уровня антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистой, респираторно-синцитиальной и аденовирусной инфекций позволит решить проблему массового серологического обследования поголовья КРС, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данных заболеваний.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП, в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях:
-на 7 европейской и 9 всесоюзной конференции по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;
- на научно-практической конференции "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных", 1993 г.;
- на международной научно-практической конференции молодых ученых "Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов", Щелково,1991 г., 2002 г., 2005 г.;
- на международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я.Р. 16-17 мая 2006 г., "Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных", г. Москва, 2006 г.;
- на международной научно-производственной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А., г. Воронеж, 2006 г.;
- на научно-практической конференции "Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии" Феодосия, Крым, 2007 г.;
- на Всероссийской научной конференции, "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология", Киров, 2008 г.;
- на заседаниях секции "Ветеринарная биотехнология" РАСХН, Щелково-2007 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано - 46 печатных работ, получены положительные решения по заявкам на изобретение 2008126758 и 2008126759.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 отечественных и 322 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь А.Я. Самуйленко, В.И. Клюкина, Д.П. Кузнецов, С.В. Кузнецова, С.К. Артюшин, В.И. Белоусов, И.И. Кочиш, Т.Ю. Кочиш, С.Ю.Филиппов, Н.Н. Быкова, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь и сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.
1.5. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
- теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования схемы получения высокоактивной антирабической сыворотки;
- клонирование ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе и применение клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации;
- результаты экспериментов по разработке комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БC, РС и АВ инфекций;
- результаты испытаний комплексной тест-системы ИФА в экспериментальных и практических условиях.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в ГНУ ВНИТИБП, в лаборатории молекулярной биологии (1991-2007 гг.) в соответствии с планами НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП, отраслевых научных программ, в рамках Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации; по теме 010401 "Получить компоненты набора для дифференциальной диагностики респираторных болезней животных (ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС или аденовирусной инфекции)", по заданию 06, теме "Разработка методов генетической инженерии для идентификации и дифференциации лептоспир", № гос. регистрации 01.86.0 031246 и договору №3-К (Заказчик НПК Роагробиопром).
2.1. Материалы и методы.
Вирусологические исследования проводили согласно стандарту МЭБ (OIE Manual, Manual of Standarts// Chapter 2.3.5.,2000; Chapter 2.10.6., 2004).
Культивирование культур клеток и вирусов проводили в биореакторах в суспензии и на микроносителях.
Штаммы. В работе был использован фиксированный вирус бешенства, штаммов Щелково-51, "Овечий" и "CVS".
В качестве исходного материала применяли РС-вирус, штамм "Randall", вирус ИРТ штамма "ТК А (ВИЭВ) В2", вирус диареи-болезни слизистых оболочек КРС штамма "Oregon C24V", вирус парагриппа-3, штамма "ЗКСМ", штамм аденовирусов Вovine-10 серотип 1.
В работе использовали вакцинные, а также музейные культуры референтных штаммов патогенных лептоспир 23 серогрупп и 3 штаммов двух серогрупп L. biflexa, любезно предоставленные кафедрой микробиологии Университета Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы и лабораторией лептоспироза научно-исследовательского института им. Н.Ф. Гамалеи.
В исследованиях по получению протеина А применяли полевой изолят золотистого стафилококка, любезно предоставленный сотрудниками бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора в Щелковском районе и метициллинрезистентный штамм А-676 s. aureus, полученный из НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Инфекционность вируса. Инфекционную активность препаратов вируса бешенства определяли титрованием на 4-5 недельных мышах массой 10-12 г.
Определение титра инфекционности РС-вируса проводили в 24-луночных панелях по ТЦД 50/мл на культуре клеток ПТ-80. Результаты оценивали по цитопатическому действию через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу И.П. Ашмарина.
Определение титра инфекционности вируса ВД-БС, ИРТ проводили в 96-луночных панелях по ТЦД50 /мл на культуре клеток ПТ-80. Инфекционную активность вируса ПГ-3 определяли титрованием в пробирочных культурах клеток ПТ-80.
Гемагглютинирующий титр вируса ПГ-3 КРС определяли в РТГА с эритроцитами мыши по методике Н.Н. Крюкова и соавт. (1982).
Инфекционную активность аденовирусов определяли путём титрования в чувствительных культурах клеток, выражая титр вируса в Lg TЦД 50/ см3, по общепринятой методике Reed и Mench (1938).
Культуры клеток и среды. Для репродукции и титрования вирусов использовали перевиваемые линии клеток МДВК, ПТ-80, Таurus-1 (Т-1), Тауэр; первично-трипсинизированные культуры клеток почки (ПЭК), лёгкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК), сердца (СЭК) эмбриона коровы. В качестве ростовой и поддерживающей среды применяли среды 199, ГлаХ, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва.
Культивирование лептоспир для получения бактериальной массы проводили на твин(полисорбат)-альбуминовой среде F. Russel, C. Russel (1986).
Антитела, антигены. Специфические антитела к вирусам ИРТ и ВД-БС выявляли в ИФА, реакции нейтрализации (РН) в культурах клеток МДВК и ПТ-80 на 96-луночных культуральных планшетах со 100 ТЦД50/50 мкл соответствующего вируса.
Антитела к вирусу респираторно-синцитиальной инфекции исследовали в РН в культуре клеток почки эмбриона коровы, а антитела против ПГ-3 - в РТГА с эритроцитами морской свинки по общепринятым методикам.
Вирусовыделение проводили в культурах клеток МДВК и ПТ-80, идентификацию изолятов - в реакции нейтрализации со специфической иммунной сывороткой.
Препараты антигенов и антител концентрировали в 20-100 раз методом ультрафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО2-200 (СКБ АП АН, Ленинград) с мембранами "Владипор" УАМ-150.
Концентрирование препаратов вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и РС проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием. В работе по очистке вирусов от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы.
Очищенные и концентрированные вирусы ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и РС из вируссодержащей суспензии, обрабатывали ультразвуком при 22кГц импульсивно 6 раз в течение 10 секунд на установке УЗДН-2Т и объединяли с антигенами, выделенными из содержащих вирус клеток. Антигены, выделенные из содержащих вирус клеток и вирус-содержащей суспензии, использовали для иммобилизации на твердой фазе полистироловых панелей. Титр в ИФА антигенов был равен 1:640-1280. Иммунные к вирусам сыворотки получали на кроликах. Для каждого вируса тщательно отрабатывали оптимальные условия постановки ИФА.
Для получения гипериммунных антирабических сывороток с высокой антивирусной активностью баранов иммунизировали инактивированной бетта-пропиолактоном 1:4000, очищенной центрифугированием 10% мозговой суспензией фиксированного вируса бешенства штамма "Овечий", собак - мозговой суспензией штамма "CVS". Иммунизацию животных проводили по одной схеме, цикличным введением вируса бешенства с полиэлектролитами с 7-8 дневным интервалом подкожно в 4 точки спины (150 мкг вирусного белка и 200 мкг полиэлектролита на голову), с последующим введением вируса внутримышечно. В качестве контроля использовали введение продуцентам только вируса бешенства. Сыворотки от баранов и собак брали на 7, 21, 28, 35, 42, 49, 56 и 63 дни от начала иммунизации и изучали динамику накопления в сыворотках крови вируснейтрализующих антител на мышах в реакции нейтрализации (РН), комплементсвязывающих в реакции связывания комплемента (РСК), преципитирующих антител в реакции диффузной преципитации (РДП) согласно рекомендациям ВОЗ по бешенству.
Содержание антител (МЕ/мл) в исследуемых сыворотках определяли методом иммуноферментного анализа с использованием стандартного препарата антирабического глобулина человека с содержанием вируснейтрализующих антител 9 МЕ/мл (НПО "Вектор").
Антирабические сыворотки и препараты IgG исследовали в иммуноферментном анализе с использованием в качестве антигенов гликопротеина и нуклеокапсида вируса бешенства штамм "Овечий", очищенного тритоном Х-100 по методике, разработанной в отделе иммунологии. Фракцию IgG антител из антирабических сывороток барана получали высаливанием и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 в 10 мМ фосфатном буфере рН-7,4.
Классовый спектр IgG антирабических сывороток барана и IgG препаратах определяли иммунодиффузией с использованием кроличьих антител к IgG, субклассам IgG1 и IgG2 барана ("Sigma"). Количество Т- и В- лимфоцитов в периферической крови продуцентов определяли с помощью общепринятого метода спонтанного розеткообразования.
Выделение и очистка иммуноглобулинов класса G. IgG КРС выделяли из цельной сыворотки крови аффинной хроматографией на протеин А Сефарозе-4В.
Очистку анти-IgG КРС проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными на BrСN-агарозу очищенными иммуноглобулинами. Общий белок определяли по методу Лоури и на спектрофотометре СФ-26.
Для получения коньюгатов анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена использовали перйодатный метод Nakane P. и A. Kawaoi (1974).
В работе применяли стандартные методы прямого и непрямого твердофазного ИФА на 96 луночных микропланшетах по Engvall и др.
При отработке параметров выявления антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, РС и ВД-БС в сборных пробах молока молоко предварительно центрифугировали и концентрировали молочные иммуноглобулины ПЭГ ММ 6000 в 15% насыщении.
Молекулярное клонирование ДНК L. pomona осуществляли в плазмидном векторе рUС 19 (С. Yanish-Perron et al.,1985).
Банк фрагментов ДНК L. pomona создавали, используя стандартные методики молекулярного клонирования (Маниатис Т. и др.,1984).
В качестве клетки-хозяина для рекомбинантных плазмид применяли бактериальный штамм JM 109 Е. coli. При выращивании бактериальных культур использовали среду LB.
Идентификацию рекомбинантных клонов осуществляли на чашках с агаризованной LB, содержащей по 1 мМ селективного гистохимического красителя Х-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бетта-галактозид) и индуктора lac-промотора IPTG (7-изопропил-1-тио-бетта-Д-галактозид), а также 75 мкг ампициллина.
Для выделения плазмидной ДНК использовали метод кипячения (Holmes,Quigjey,1981) и метод щелочного лизиса (Birnboim H. С. и Doly J.A., 1979),
Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот проводили в 0,8 % агарозном геле (Л. А. 0стерман,1981).
Рестрикционный анализ бактериальной и плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями Маниатис и др., 1984, с использованием эндонуклеаз рестрикции, полученных из НПО "Фермент"(Литва). .
Включение радиоактивной метки в ДНК-зонды осуществляли методами ник-трансляции (Rigby P.V.J. et al.,1977) и рассеянной затравки (Feinberg и Vogelstein,1984).
Нерадиоактивное мечение (биотинилирование) ДНК-зондов по методу В.А. Адаричева и соавт. (1987).
Перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond-N ("Amersham") осуществляли по методике, предложенной Е. Southern, 1975, с использованием для переноса 10 X SSC буфера.
В одних случаях предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 47°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,1 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. В других случаях предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 65°С в растворе, содержащем 30 % формамид, 2 X SSC, 5 X раствор Денхардта, 0,2 % SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.
Культуру стафилококка выращивали в биореакторе АК-210, который оснащен системами автоматического контроля и регулирования параметров культивирования (температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода-рО2, окислительно-восстановительный потенциал-еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии). Морфологию s. aureus изучали путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Для определения фаз роста и максимальной удельной скорости использовали графический метод.
При анализе и статистической обработке результатов вычисление средней арифметической, средней геометрической, стандартного отклонения, коэффициента корреляции результатов проводили с использованием программы Excel для Windows. При этом были приняты следующие обозначения: М - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической, n - число наблюдений или животных в опыте, г - коэффициент корреляции результатов (коэффициент корреляции Пирсона), Р - критерий достоверности.
Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при Р < 0,05.