Geum.ru

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Вид материалаАвтореферат диссертации

Содержание


Определение позитивно-негативного порога тест-системы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ к респираторным ВИРУСАМ в МОЛОЗИВЕ ИММУННЫХ КОРОВ.
Контроль воспроизводимости результатов
Подобный материал:
1   2   3   4

*: представлены данные обратные значениям титров РН и ИФА.

Таблица 11

Сравнительная оценка результатов в ИФА и РН.
Результат РН, количество проб: положительных отрицательных (n=195) (n=117)

Результаты в разрабо- положительных

танной тест-системе, отрицательных количество проб:
192
7

3
110



Результаты, приведенные в таблице 11, свидетельствуют о том, что:

диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН составила 192:195х 100 %=98,46%; диагностическая специфичноcть 110:117 x 100 % = 94,02%; совпадаемость результатов двух методов 302:312 x 100 % = 96,8% .

Анализ полученных данных свидетельствует о положительной корреляции результатов по определению сывороточных антител, полученных с помощью разработанного ИФА и РН (г=0,9, Р < 0,05), совпадаемость результатов двух методов составила 96,8%. Однако при исследовании сывороток крови, полученных от заведомо негативных (клинически здоровые контрольные животные и рожденные от них телята из благополучных хозяйств, n=58) или заведомо позитивных (подопытные вакцинированные животные, n=36) коров, наблюдалась 100%-я совпадаемость результатов ИФА и РН. В первом случае, все результаты исследований были отрицательными, во втором - положительными.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанная нами иммуноферментная тест-система сопоставима по специфичности и чувствительности с РН и вследствие дополнительных своих преимуществ (экспрессность и простота проведения анализа, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) может быть использована в качестве основного скринирующего теста при массовом обследовании животных.


Определение позитивно-негативного порога тест-системы.

Для этого были проведены исследования по определению закономерностей распределения значений ОП 450 и коэффициента связывания (Ксв.) вирус-отрицательных и положительных сывороток, т.е. порогового значения (cut off" или позитивно-негативный порог - ПНП), разграничивающего положительную и отрицательную реакции.

В первом эксперименте было использовано 89 сывороток крови коров, не содержащих, по данным РН, антител к антигенам вирусов респираторных вирусных инфекций и 52 сыворотки крови вакцинированных животных с различным уровнем специфических антител в РН. Отрицательные и положительные сыворотки исследовали в трех разведениях 1:50, 1:100, 1:200; каждая сыворотка крови, взятая в определенном разведении, проверялась в трех параллельных лунках.

Перед учетом реакции по формуле, приведенной ниже, высчитывали среднее значение ОП 450 для каждой испытуемой пробы. Относительное содержание вирус-специфических антител в положительных пробах определяли по: а) титру антител, т.е. по конечному разведению испытуемой пробы, превышающему ОП 450 отрицательного контроля в 2,1 раза и б) коэффициенту связывания (Ксв.) отражающему содержание антител в испытуемой пробе по отношению к содержанию антител в положительном контроле. Математически это выражается следующей формулой:


Ксв =(ОП450ИПср-ОП450К-ср) x 100

(ОП450К+ср-ОП450К-ср)


где: ОП450 ИПср, ОП450 К- и ОП450К+ - средние арифметические значения оптической плотности в лунках с испытуемой пробой, отрицательным и положительным контролями соответственно.

Проведенные исследования показали, что для получения достоверных результатов в разработанной тест-системе, испытуемые пробы сывороток крови КРС необходимо исследовать в разведении аналогичном контролям, т.е. 1:50.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что при значении ОП 450 положительного и отрицательного контролей 1,5-1,8 и 0,14-0,2 соответственно, величина ОП 450 всех заведомо отрицательных проб была в пределах 0,05-0,21, при этом значения Ксв. составляли от -4 до 8. В заведомо положительных сыворотках крови значение ОП 450 превышало 0,45, а значения Ксв. были от 21 до 196.

При изучении зависимости значения Ксв. от титра вирус-специфических антител в положительных пробах была установлена положительная коррелятивная связь между двумя показателями (г= 0,75, Р < 0,05).

Далее были проведены расширенные исследования по определению закономерности распределения значений Ксв отрицательных (n=114) и положительных (n=147) по данным РН сывороток. Постановку ИФА и учет полученных результатов проводили аналогично предыдущему эксперименту.

Анализ результатов проведенных экспериментов позволил заключить следующее. В большинстве случаев (98,1%) значение Ксв. отрицательных проб не превышало 20. Из них Ксв. < 0 был в 65,9% сывороток, в 32,5% случаев данный показатель был в пределах от 0 до 20. Только в 2 пробах (1,7%) значение Ксв. находилось в пределах 20-40. В большинстве вирус-специфических сыворотках крови (97,4%) величина Ксв. составляла более 20.

При этом в 69% проб Ксв. был более 60, в 16,3% случаев он колебался от 40 до 60 и в 12,2% - был в пределах 20 - 40. В 4 пробах (2,5%) значение Ксв. было ниже 20.

Таким образом, был сделан общий вывод о том, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв. менее 20, с большой вероятностью (0,98) не содержат вирус-специфических антител. В вирус-специфических сыворотках в большинстве случаев (98%) значение ОП 450 превышало аналогичный показатель отрицательного контроля в 2,1 раза, а Ксв. был более 20. Исходя из этого, величина ПНП или cut off для Ксв., являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб и при котором минимально количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, составляет 20. В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающем этот показатель - положительными.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана универсальная методика постановки ИФА.


ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ к респираторным ВИРУСАМ в МОЛОЗИВЕ ИММУННЫХ КОРОВ.


Поскольку пассивный лактогенный иммунитет является важнейшим механизмом в предотвращении инфекционных респираторных вирусных инфекций новорожденных телят, то очевидно, что его эффективная стимуляция составляет основу стратегического подхода к их иммунопрофилактике. Поэтому, при использовании вакцинных препаратов для профилактики инфекционных болезней респираторного тракта животных, первостепенное значение имеет определение уровня специфических антител в секрете молочной железы иммунизированных коров. Это имеет прогностическое значение в ответе на вопрос о возможности формирования лактогенного иммунитета у новорожденных телят.

Нами проведены исследования по оценке эффективности разработанной тест-системы на основе ИФА по определению уровня антител к респираторным вирусам в молозиве иммунных коров в сравнительном аспекте с РН.

В опыте использованы пробы молозива, полученные от 51 вакцинированных коров из 3-х хозяйств РФ. Перед постановкой РН и ИФА испытуемые пробы прогревали в водяной бане при 56°С в течение 30 мин, затем добавляли равный объем физиологического раствора и замораживали при -20°С. После оттаивания полученные пробы центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин, отбирали водную фракцию и использовали ее для исследования. Постановку РН и ИФА осуществляли, как описано в разделе "Материалы и методы", полученные результаты приведены в таблице 12.

Таблица 12.
Результат РН,

количество проб:

положитель- отрицательных ных (n=48) (n=3)

Результаты в разрабо- положительных

тайной тест-системе, отрицательных количество проб:
45
1

3
2

Анализ результатов исследований по выявлению вирус-специфических антител в испытуемых пробах свидетельствует о том, что в данном эксперименте совпадаемость результатов ИФА и РН составила 92,16%. Кроме того, установлена положительная корреляция между результатами, полученными с использованием данных методов (г = 0,82, Р < 0,05).

При этом распределение проб, давших положительный результат в ИФА (в пробах Ксв. составлял 20 - 40, в 20-ти - 40 -60 и в 15-ти был более 60).

По результатам опыта был сделан вывод о том, что уровень вирус-специфических антител в секретах молочной железы коров, также как и срок циркуляции материнских антител в организме телят могут служить дополнительными критериями оценки эффективности применяемых вакцинных препаратов.


КОНТРОЛЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним из важных критериев эффективности использования иммуноферментных тест-систем является воспроизводимость результатов определения, которая проверяется как в рамках одной микропанели (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. В целом воспроизводимость результатов лабораторных исследований оценивается как степень разброса результатов, получаемых данным методом.

Мерой контроля воспроизводимости является значение коэффициента вариации (К.В.), который отражает зависимость между разбросом и среднеарифметическим значением и, согласно утвержденному Методическому руководству (Р.А.Тигранян, Н.Ф.Калита, А.С.Роганов, 1994).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что не установлено различий в интерпретации результатов, полученных в рамках одной серии ИФА-набора и при использовании наборов разных серий.

Величина К.В. значений Ксв. при исследовании положительных проб (n=5) наборами разных серий не превышала 6,76%, а при исследовании отрицательных (n=11) - 4,76%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. При этом коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, а при исследовании отрицательных - 0,97.

Анализ полученных данных, позволил нам сделать общее заключение о том, что, разработанная тест-система можно применяться для массовых скрининговых исследований в благополучных хозяйствах и осуществлять, таким образом, мониторинг респираторных инфекции, а также оценивать эффективность вакцин в тех хозяйствах, которые проводят целенаправленную специфическую профилактику. Кроме того, данный набор может служить дополнительным средством исследований в системе комплексной диагностики.


2.2.4.Получение протеина А

Иммуноглобулины класса G выделяли из цельной сыворотки крови аффинной хроматографией на протеин А-Сефарозе 4В в один этап.

Для глубинного культивирования штамма золотистого стафилококка с целью отработки оптимальных условий для получения биологически активного протеина А использовали биореактор АК-210. Культуру стафилококка выращивали при температуре 37 оС, скорости перемешивания 100об/мин., рН поддерживали на уровне 7,2, автоматически добавляя 1 N NaOH.

Для культивирования микроорганизма в биореакторе использовали питательную среду на основе перевара Хоттингера и мясо-пептонный бульон (МПБ). Посевную дозу определяли по оптическому стандарту мутности Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Клетки золотистого стафилококка инактивировали прогреванием при 60оС 30 мин. Динамику роста s.aureus изучали с помощью спектрометрического анализа с интервалом 1 час. Аэрацию осуществляли начиная со 2 часа культивирования до окончания процесса с расходом воздуха 1,4 л/мин. Биологическую активность протеина А определяли в реакции прямого твердофазного ИФА.

Фаза логарифмического роста начиналась с 2 ч и заканчивалась к 5 ч культивирования. К 6 ч культура стафилококка вступала в стационарную фазу роста.

Протеин А получали из инактивированной и обработанной ультразвуком микробной массы золотистого стафилококка на колонках, заполненных аффинным сорбентом - Ig G крупного рогатого скота, иммобилизованным на сефарозе 4В. Так как штамм А 676 продуцирует значительную часть белка А питательную среду, то и осветленную центрифугированием, инактивированную прогреванием культуральную среду после выращивания стафилококка в биореакторе, обработанную ультразвуком использовали для проведения аффинной хроматографии.

Белоксодержащий материал пропускали через колонки, заполненные иммуносорбентом, размером 3,0х15,0 см со скоростью 5-10 мл/ч см3 при +4 оС в режиме замкнутого реактора. Сорбцию белка проверяли методом прямого ИФА. Колонку промывали двадцатикратным объемом фосфатно-буферного раствора 0,15 М, содержащим 0,15 М NaCl, рН 7,2. Затем элюировали ацетатным буферным раствором рН 3,0. Фракции немедленно нейтрализовали 0,5 н NaOH и исследовали в ИФА на биологическую активность протеина А. Затем белок А диализовали против дистиллированной воды (2 суток) и лиофилизировали на установке КС-30. Препарат выдерживали 2 суток при среднем остаточном давлении 50-70 мкм рт. ст. и температуре конденсатора от -55 до -65 оС и затем в течение 6-8 часов при температуре +24 оС.

Полученный препарат белка А проверяли на гомогенность по результатам электрофореза в 7% ПААГ в трис-глициновом буфере рН 8,9 по методике Davis J.B. на приборе фирмы "Reanal".

Антитела из гипериммунных антивидовых сывороток крови выделяли методом аффинной хроматографии. Специфические сорбенты получали ковалентной иммобилизацией иммуноглобулинов класса G или протеина А на активированных глутаровым альдегидом смешанном полиакриламид-агарозном геле АсА 34 (фирмы "ЛБК", Швеция) и акрилексе П-300 (фирмы "Реанал", ВНР) по методике, описанной Т.Ternynck и S.Avrameas , на BrGN -сефарозе 4 В (фирмы "Фармация", Швеция и BrCN -агарозе отечественного производства - в соответствии с рекомендациями фирмы "Фармация".

Хроматографически очищенный белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами использовали в "Инструкции по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных", утвержденной 22.01.2006 г. директором ВНИТИБП и в "Инструкции по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".


3. ВЫВОДЫ


1. Усовершенствована схема получения активной антирабической сыворотки. Применение эффективных современных отечественных полиэлектролитов в качестве адъювантов и иммуномодуляторов (полиоксидония и вегетана), при сравнении с применяемым ранее, способом получения антирабической сыворотки, выявило следующие преимущества: повышение активации иммунокомпетентных клеток, увеличения антителообразования у животных-продуцентов и повышение выхода и специфической активности антирабической сыворотки, сокращение сроков иммунизации с 90 до 62 дней, за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и применения одновременных инъекций антигена и полиэлектролитов, и уменьшения расхода антигенного материала.

2. Клонирование ДНК штамма ВГНКИ-6 серогруппы Pomona позволило создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащую 67 фрагментов бактериального генома лептоспир. Получен банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир, содержащий 42 препарата ДНК референтных штаммов, 6-производственных, а также семь образцов ДНК штаммов серогруппы Pomona, изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах страны. Разработан метод выделения высокоочишенных препаратов ДНК из биомасcы лептоспир.

3. В результате реакций ДНК-ДНК гибридизации полученной клонотеки с нуклеиновыми кислотами лептоспир была выделена рекомбинантная плазмида pLp 41 размером 3 880 пар нуклеотидов, содержащая фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, нуклеотидная последовательность которого пригодна для использования в качестве видоспецифического гибридизационного зонда. Установлено, что плазмидный зонд гибридизуются только с ДНК лептоспир вида L. interrogans, и не гибридизуются с препартами суммарных нуклеиновых кислот сапрофитных лептоспир, иерсиний, кишечной палочки, бруцелл, микоплазм и других бактерий.

4. В хромосомных ДНК сероваров tarassovi, sejroe, pomona, kabura, polonica, whitcombi, grippotyphosa, panama, castellonis, sarmin, szwajizak, bratislava, djatzi, louisiana, сynopteri присутствуют области, гомологичные фрагменту ДНК L. pomona в составе рекомбинартной плазмиды pLp 41. Показано, что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир, представляющих основные серогруппы Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa, которые вызывают заболевание у свиней и крупного рогатого скота на территории России и других стран СНГ.

5. Показана возможность использования фрагмента ДНК L. pomona. из рекомбинантиой плазмиды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации. Установлено, что в хромосоме производственных штаммов лептоспир присутствуют различные по молекулярной массе области, несущие участки ДНК, гомологичные фрагменту ДНК

L. роmопа, входящего в состав плазмиды pLp 41.

6. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивающие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов, ограниченный сайтами рестриктазы EcoR I, a также не содержит сайты следующих рестриктаз: Pst I, Sma I, Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген bla, детерминирующий синтез бетта-лактомазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. coli, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и неконъюгативна.

7. Разработана комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам респираторных вирусов в биологических жидкостях организма животных и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови КРС, взятых в одном разведении (1:50).

8. Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов ИФА (Ксв.) равный 20.

9. При исследовании сывороток крови КРС установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к реакции нейтрализации составила 98,46%, специфичность - 94,02%. Результаты ИФА и РН совпадали в 96,8% случаев, коэффициент корреляции результатов составил 0,9; Р < 0,05. Разработанная иммуноферментная комплексная тест-система сопоставима по специфичности и чувствительности с РН и вследствие дополнительных своих преимуществ (экспрессность и простота проведения анализа, наличие инструментального учета реакции и возможность автоматизации всех ее этапов, стабильность при хранении всех необходимых реагентов и воспроизводимость результатов) может быть использована в качестве основного скринирующего теста при массовом обследовании животных.

10. При исследовании молозива иммунных коров совпадение результатов двух методов (ИФА и РН) зарегистрировано в 92,16% случаев, при г = 0,82, Р < 0,05.

11. Показана возможность одноэтапной препаративной очистки антигенов РС-вируса и ПГ-3 из вирус-содержащих суспензий с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-РС IgG Сефарозе 4В и анти-ПГ-3 IgG Cефарозе 4В соответственно.

12. При изучении состава белков вируса ПГ-3 КРС, штамма "3КСМ", полученных при обработке вирус-содержащей суспензии тритоном Х-100 выявлено 8 структурных белков с ММ от 14 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга все восемь белков индуцировали выработку анти-ПГ-3 антител в организме восприимчивых к ПГ-3 животных.

13. При изучении состава белков РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полученных при обработке вирус-содержащей суспензии Тритоном Х-100, выявлено 9 структурных белков с ММ от 28 до 180 кД. По результатам иммуноблотинга 6 белков с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РС антител в организме восприимчивых к РС-инфекции животных.

14. Усовершенствованы способы получения и очистки специфических антител при промышленной технологии производства диагностикумов для практического применения.

15. Изучены оптимальные условия промышленного культивирования и инактивации штамма Staphilococcus aureus с целью получения биологически активного протеина А.

16. В результате проведенной работы, разработан одноэтапный метод получения высокоактивных специфических положительных и отрицательных референс-сывороток (заявки на изобретение №200813290 и №200813287).

17. Использование современных автоматизированных биореакторов и методов оптимизации технологического процесса позволило при суспензионном и псевдосуспензионном культивировании клеток ПТ-80 увеличить получение их концентрации до 3 млн. кл в мл.

18. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирусы ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, АВ и РС, обладающих достаточной инфекционной активностью.