Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание 2.2. Результаты исследований Характеристика штаммов лептоспир, используемых в опыте 1. Вгнки-1 4,9; 4,8; 4,7 5,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4 6 Вгнки-6 4,8 4,8;4,7;2,9 4,8;3,5;2,6 Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС. Очистка и концентрирование РС-вируса. Антиген РС-вируса для определения уровня антител в иммуноферментном анализе. Очистка и концентрирование вируса парагриппа-3. Очистка и концентрирование вируса диареи-болезни слизистых. Очистка и концентрирование вируса аденовирусной инфекции. Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для тест-системы Определение допустимых величин оптической плотности (ОП) контрольных сывороток. Оптимизация условий проведения ИФА Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы

Подобный материал:

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
• Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
• Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
• L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ


2.2.1.Усовершенствование получения антирабической гипериммунной сыворотки.

Наиболее широко распространенным тестом для диагностики бешенства является тест флюоресцирующих антител, который рекомендован Всемирной организацией здравоохранения. Тест флюоресцирующих антител обеспечивает надежный результат в течение нескольких часов в 98-100% случаев. Чувствительность теста зависит от активности флюоресцирующих коньюгатов, которые готовят на основе поликлональных антител, выделенных из антирабических сывороток. В связи с этим, получение высокоактивных антирабических сывороток является сложной задачей, включающей многократное введение большого объема инактивированного вирусного материала, включая грундиммунизацию. Одним из эффективных способов повышения активности гипериммунных сывороток, является применение адьювантов.

Поиск адьюванта для иммунизации животных-продуцентов антирабической сыворотки, заставил нас обратить внимание на отечественные синтетические полиэлектролиты (полиоксидоний, вегетан) успешно применяемые в настоящее время в медицине и в ветеринарии в качестве адьювантов и иммуномодуляторов. Полиэлектролиты обладают иммуностимулирующим действием и избирательно влияют на отдельные звенья иммуногенеза, вызывают значительное повышение интенсивности антителообразования, не нарушая резервных возможностей кроветворной системы. Описанные свойства и послужили основанием для применения полиэлектролитов в качестве адьюванта при иммунизации животных против бешенства.

В результате проведенных экспериментов была разработана схема иммунизации животных, состоящая из нескольких циклов: на первом этапе баранов и собак инокулировали вирусом бешенства в смеси с полиэлектролитом подкожно вдоль позвоночника точечно, а затем внутримышечно без адьюванта.

Комплексное исследование антивирусной активности антирабических сывороток показало, что содержание специфических антител в них зависело от способа введения вирусных препаратов и сроков взятия сыворотки. Исследование серологической активности гипериммунных сывороток не установило преимуществ одного из применяемых полиэлектролитов. Применение полиэлектролитов позволило получить антирабические сыворотки с титром специфических к вирусу бешенства антител к 6-му циклу введения вируса в 2-4 раза выше в сравнении с контролем. Количество антител к остаточным белкам мозговой ткани в сыворотках крови иммунизированных животных с применением полиэлектролитов, в сравнении с контролем, было незначительно и после 1 цикла введения существенно не менялось, и к 6-му циклу не обнаруживалось.

Максимальные титры вируснейтрализующих антител в сыворотках баранов, иммунизированных вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами, в титрах 1:16-1:64, выявлялись в реакции нейтрализации на 30 день от начала иммунизации, комплементсвязывающих- в титре 1: 80- 1:320 - на 42 день, преципитирующих - в титрах 1:256-1:512 на 63 день от начала иммунизации. Антирабическая сыворотка собак, иммунизированных очищенной мозговой суспензией вируса бешенства штамм "CVS" совместно с полиэлектролитами, с максимальные титром вируснейтрализующих антител 1:64 и активностью 8 МЕ/мл, была получена на 35 день.

Изучение методом ИФА изменения спектра антирабических антител на разных стадиях иммунизации показало, что после 2-х циклов введения вируса в сыворотках крови барана и собаки титры антител к гликопротеину составили 1:800-1: 1600, к белкам нуклеокапсида -1:200-1:400. После 4-го цикла титры антител к нуклеокапсиду возросли и достигли максимума 1:12800 к 9-му циклу иммунизации. Установлено также, что в ходе 2-х циклов иммунизации антитела в сыворотках крови барана относились как к IgG₁, так и IgG₂, причем удельная активность последнего увеличивалась, и к 9 циклу антителам IgG₂ соответствовал наибольший индекс нейтрализации и преципитации. Антитела к мозговым белкам были сосредоточены во фракции, содержащей IgG₁, и в ходе очистки иммуноглобулинов легко удалялись, что является положительным моментом при получении диагностических препаратов на основе IgG.

На повышение активности Т- и В- системы иммунитета в процессе иммунизации указывает увеличение процентного содержания в крови розеткообразующих Т- и В- лимфоцитов. Применение полиэлектролитов способствовало увеличению как относительного числа Т-лимфоцитов в сыворотке крови иммунизированных собак, образующих интенсивные розетки (16,2+ 1,8 -16,4+ 1,1% против 11,8 +0,9- 13,07+ 0,1% в контроле), так и регистрировали достоверное повышение розеткообразующей способности В-лимфоцитов (24,4+0,4% против 18,5+ 0,1% в контроле).

Таким образом, при получении антирабической сыворотки высокую эффективность показало применение полиэлектролитов, таких как полиоксидоний и вегетан, в качестве иммуностимуляторов. Применение данных полиэлектролитов, при сравнении с применяемым ранее, способом получения антирабической сыворотки, выявило следующие преимущества: повышение активации иммунокомпетентных клеток, увеличения антителообразования у животных-продуцентов и повышение выхода и специфической активности антирабической сыворотки, сокращение сроков иммунизации с 90 до 62 дней, за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и применения одновременных инъекций антигена и полиэлектролитов, и уменьшения расхода антигенного материала.

Схема получения антирабической сыворотки иммунизацией баранов фиксированным вирусом бешенства штамм "Овечий" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", выпускаемых ВНИТИБП по Госконтракту с Департаментом ветеринарии МСХ РФ. Получение антирабической сыворотки собаки фиксированным вирусом бешенства штамм "CVS" с полиэлектролитами включена в "Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных".


2.2.2. Результаты исследований по молекулярному клонированию ДНК L. interrogans серовара pomona

2.2.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир.

Препараты нуклеиновых кислот референтных штаммов сероваров pomona, tarassovi, polonica, djatzi, szwajizak. ballum, whitcombi, shermani, pyrogenes, сanlcola, louisiana, panama, grippotyphosa, kabura, bratislava, copenhageni, patoc, andamana, semaranga, sejroe, celledoni, castellonis, hebdomadis, poi, ranarum, djasiman, lichuan, sarmin, autumnalis, а также производственных штаммов лептоспир и полевых изолятов серогруппы Роmoпа были получены для анализа специфичности рекомбинантных плазмид.

Используя фенол - додецилсульфатный метод, было выделено и очищено 65 препаратов ДНК штаммов лептоспир.

На каждое выделение брали 5-7 мл культуры лептоспир. При этом среднее количество ДНК, полученное из биомассы лептоспир, составляло 1,5 мг.

Оптические характеристики ДНК, рассчитанные как соотношение поглощений при заданных длинах волн ультрафиолетового спектра, в среднем составляли А 260/230-1,8 (контаминация полисахаридами) и для А 260 / 280 - 1.9 (контаминация белками).

Усредненная величина гиперхромного эффекта для препаратов ДНК достигла 28 % .

Полученные данные по спектральным характеристикам свидетельствуют о том, что изученные образцы содержали нативную ДНК, не контаминированную примесями белков и полисахаридов. Препараты ДНК отвечают требованиям и могут быть использованы для проведения генносистематических исследований.


2.2.2.2. Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара pomona.

Источником хромосомной ДНК служил штамм ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, который выделен от свиньи в 1966 г. в Московской области. Выбор штамма этой серогруппы обусловлен тем, что на территории нашей страны Pomona является одной из наиболее распространенных серогрупп, поражающих как сельскохозяйственных животных (особенно свиней), так и человека.

Хромосомную ДНК штамма ВГНКИ-6 расщепляли на отдельные фрагменты эндонуклеазой рестрикции EcoR I в условиях неполного гидролиза. Были подобраны такие условия рестрикции, при которых максимальное количество продуктов реакции составляли фрагменты ДНК размера 1-4 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Эта фракция ДНК выделялась препаративным электрофорезом из агарозного геля.

Выделенные фрагменты ДНК лигировали с плазмидой pUC 19, предварительно расщепленной рестриктазой EcoR I.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма JM 109 и высевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин, индикатор бетта-галактозидазной активности X-gal и индикатор бетта-галактозидазы IPTG.

Рекомбинантные клоны были отобраны по отсутствию бетта-галактозидазной активности, поскольку у них нарушена способность к синтезу фермента вследствие сдвига рамки его считывания при встраивании в векторную плазмиду фрагмента чужеродной ДНК, т.е. клоны рекомбинантного фенотипа на селективной среде формировали бесцветные колонии в отличие от обычных колоний синего цвета.

В результате молекулярного клонирования было отобрано 44 колонии рекомбинантного фенотипа.


2.2.2.3. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид.

Из биомассы случайно отобранных 44 клонов были выделены препараты плазмидной ДНК. Размеры клонированной ДНК L. роmonа в составе рекомбинантных плазмид определяли с помощью рестрикции EcoR I и электрофореза в агарозном геле. Рекомбинантные плазмиды содержали по 1-3 фрагмента чужеродной ДНК, размеры которых варьировали от 0,4 до 3,6 тысяч пар нуклеотидов. Сумма клонированнных фрагментов ДНК лептоспир достигла 88,9 т. п. н., что составляет 4 % бактериального генома.

Поскольку для клонирования из агарозного геля после рестрикции ДНК штамма ВГНКИ-6 препаративно выделяли фрагменты, находящиеся в пределах полосы 1-4 т.п. н., то очевидно, что выделенные из рекомбинантных плазмид вставки соответствуют по размерам диапазону клонированных фрагментов.

При рестрикционном анализе рекомбинантных клонов было также установлено, что из некоторых плазмид выделялось 2 или 3 фрагмента чужеродной ДНК. Это объясняется тем, что клонированный фрагмент чужеродной ДНК содержит внутри себя сайты рестриктазы EcoR I и в результате полного гидролиза препаратов ДНК, в местах узнавания данной рестриктазы происходит полное расщепление ДНК по этому сайту. Возможно, однако, что наличие этих сайтов обусловлено одновременным лигированием в одном векторе двух и более мелких фрагментов ДНК лептоспир.


2.2.2.4. Анализ рекомбинантных плазмид в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

Принадлежность клонированных фрагментов к ДНК лептоспир была подтверждена в реакции дот - гибридизации с радиоактивно мечеными ДНК-зондами, в качестве которых использовали тотальные ДНК штаммов: ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, RP-29 серогруппы Tarassovi, Pinos серогруппы Canicola.

Результаты дот-гибридизационного анализа свидетельствовали, что клонированные в плазмидном векторе pUC 19 фрагменты ДНК действительно лептосиирозной природы- все 42 рекомбинантные плазмиды обнаруживали интенсивные положительные сигналы на радиоавтографе после гибридизации с меченой радиоактивным фосфором ДНК штамма ВГНКИ-6. Десять рекомбинантных плазмид имели комплементарные последовательности в геноме штамма Pinos серогруппы Canicola и лишь одна единственная рекомбинантная плазмида (pLp 41) гибридизовалась с тотальной ДНК штамма RP-29 серогруппы Tarassovi. Эти данные не противоречат результатам экспериментов P. Yasuda et al. (1987), P. Ramadass et al. (1992), определившим, что по степени гомологии ДНК представители серогрушшы Tarassovi генетически отдалены от представителей серогрупп Pomona и Canicola.

Из созданной клонотеки рекомбинантных плазмид для дальнейших исследований отобрали pLp 23,pLp 37 и pLp 41.

По результатам дот - гибридизации установлено, что рекомбинантная плазмида pLp 23 гибридизовалась с ДНК штаммов ВГНКИ-6 и Pinos, pLp 37 показала положительный сигнал на радиоавтографе только с хромосомной ДНК ВГНКИ-6, a pLp 41 - с ВГНКИ-6 и RP -29.

Однако выбор наиболее перспективной рекомбинантной плазмиды из числа предварительно отобранных структур может быть сделан на основе дальнейших исследований с использованием в гибридизационных экспериментах более широкого круга представителей бактериального мира.


2.2.2.5. Плазмиды pLp 23, pLp 37 и pLp41 как гибридизационные зонды для идентификации референтных штаммов лептоспир.

Согласно цели исследования осуществили препаративное выделение фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41. Рекомбинантные плазмиды pLp 23, pLp 37, pLp 41 по результатам рестриктазного анализа содержали 3,2,1 фрагментов ДНК L. pomona соответственно. Выделенные из рекомбинантных плазмид шесть фрагментов-вставок ДНК L. pomona метили радиоактивным фосфором и использовали в качестве зондов в реакции слот-блот гибридизации. В эксперименте использовали препараты ДНК, выделенные из музейных культур референтных штаммов лептоспир. Всего с использованием данной методики было исследовано 42 препарата суммарных нуклеиновых кислот лептоспир.

Сравнение результатов слот - блот гибридизации тотальных ДНК различных штаммов лептоспир с ДНК-зондами из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41 показало, что штаммы патогенных лептоспир отличаются друг от друга по интенсивности сигналов радиоавтографии. Возможно, что различия в степени гибридизации с молекулярными зондами в штаммах патогенных лептоспир могут быть связаны с разной степенью гомологии этих зондов комплементарным им нуклеотидным последовательностям в ДНК штаммов L. interrogans. Однако различия могут быть обусловлены и разным числом копий последовательности исследованных ДНК-зондов внутри генома лептоспир того или иного штамма.

Одновременно, было показано, что ни один из исследуемых ДНК-зондов не гибридизовался с ДНК сапрофитных штаммов лептоспир. Полученные данные позволяют утверждать, что ДНК-ДНК гибридизация с ДНК-зондом, приготовленным из рекомбинантной плазмиды pLp 23, pLp 37 или pLp 41, позволит дифференцировать вид L. interrogans от вида L. biflexa.

При определении специфичности полученных рекомбинантных плазмид в реакции слот-блот гибридизации с референтными штаммами патогенных лептоспир было обнаружено, что одни фрагменты-вставки гибридизовались с более узкой, а другие - с более широкой группой бактериальных штаммов. Так, например, фрагмент - вставка ДНК L. pomona размером 1,56 т. п. н. из рекомбинантной плазмиды pLp 37 активно гибридизовалась со штаммами лептоспир следующих сероваров: pomona, panama, canicola, polonica, grippotyphosa, kabura, szwajizak, pyrogenes, louisiana, autumnalis, djasiman, copenhageni, whitcombi, poi; исключение составили bal1um, ranarum, sejroe, 1ichuan, sarmin, castellonis, tarassovi, shermani, сelledoni.

Однако фрагменты-вставки рекомбинантиой плазмиды pLp 23 обнаруживали при радиоавтографии интенсивные положительные сигналы с препаратами ДНК немногих сероваров (для фрагмента размером 0,67 т. п. н. это серовары: polonica, kabura, sarmin, cynopteri, pyrogenes; для фрагмента 0,40 т.п.н. -polonica, cynopteri, kabura; а для фрагмента размером 0,75 т.п.н.- это серовары: grippotyphosa, cynopteri, panama, celledoni, lichuan, sarmin, hebdomadis).

Для фрагментов-вставок из рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 37 слот - блот гибридизацией отмечено одно обшее свойство -отсутствие положительных гибридизационных сигналов с образцами ДНК лептоспир патогенного серовара tarassovi. Таким образом, можно полагать, что хромосомные ДНК штамма Perepelicyn (из музейных коллекций кафедры микробиологии университета Дружбы Народов им. Лумумбы и лаборатории лептоспироэа НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) не несли комплементарных pLp 23 и pLp 37 последовательностей нуклеотидов.

Одновременно результаты исследований показали, что в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, pomona, sejroe, kabura, grippotyphosa, panama, sarmin, szwajizak, bratislava, castellonis, louisiana, whitcombi, djatzi, cynopteri присутствуют области, гомологичные ДНК-зонду pLp 41.

Описанные выше результаты слот - блот гибридизаций не противоречат сообщениям из литературы (Terpstra V. J., Schoone G. j. et ai.,1986,1987; Zaal J. et al.,1988). Проведенные опыты по идентификации патогенных лептоспир при использовании в качестве зондов геномной или клонированной ДНК лептоспир показали перекрестную гибридизацию между сероварами даже в строгих (жестких) условиях дот-блот анализа.


2.2.2.6. Плазмиды pLp 23,37,41 как ДНК-зонды для идентификации полевых изолятов и производственных штаммов лептоспир.

Выполнены эксперименты по гибридизации шести фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 с препаратами ДНК штаммов лептоспир серогруппы Pomona, которые были изолированы от сельскохозяйственных животных и человека на территории России. Одновременно изучалась гибридизационная активность клонированных фрагментов по отношению к ДНК производственных штаммов лептоспир (Таблица 1).

Как следует из полученных данных, наименьшая гибридизационная активность с препаратами ДНК, характерна для фрагментов ДНК L. pomona размером 0,75 т.п.н., 0,67 т.п.н. и 0,40 т.п.н. из рекомбинантной плазмиды pLp 23. Эти фрагменты ДНК рекомбинантной плазмиды pLp 23 в низкой степени гибридизовались с образцами ДНК изолятов лептоспир сероваров monjakov, pomona и производственных штаммов ВГНКИ-2, ВГНКИ-5, ВГНКИ-4. Однако высокое сродство к штаммам - изолятам лептоспир, серологически идентифицированным к серовару mozdok, обнаруживали все три фрагменты-вставки L. pomona рекомбинантной плазмиды pLp23.

Таблица 1

Характеристика штаммов лептоспир, используемых в опыте

________________________________________________________________

штамм серовар Характеристика:

вид животного, год и место выделения

^{_____________________________________________________________________________________________________}

1.Сарпинский pomona бычок,1951, Cталинградская обл.

2.Гиацинт pomona бычок,1946, Московская обл.

3.Иванченко mozdok человек,1961,СОАССР

4. Т-8021 mozdok бычок,1961, СОАССР

5. Моняков monjakov человек,1937,Приморский край

6. Танк monjakov лошадь,1954,Татарская АССР

7. Свинья 185 monjakov свинья, 1959, Калининградская обл.

8. ВГНКИ-1 grippotyphosa овца,1969 ---

9. ВГНКИ-2 icterohaemorrhagiae свинья,1972,Московская обл.

10. ВГНКИ-3 canicola свинья, 1973, Московская обл.

11. ВГНКИ-4 tarassovi свинья, 1973,Московская обл.

12. ВГНКИ-5 balcanica бычок,1974, Оренбургская обл.

13. ВГНКИ-6 pomona (monjakov) свинья,1966,Московская обл.

__________________________________________________________________

Исследования показали, что с ДНК - зондами pLp 37 и pLp 41 положительный эффект в реакции гибридизации проявляли в равной мере все исследуемые штаммы - изоляты сероваров pomona, monjakov и mozdok. Однако только ДНК-зонд, приготовленный на основе рекомбинантной плазмиды pLp 41, обнаруживал высокую гибридизационную способность со всеми используемыми в этом эксперименте производственными штаммами лептоспир. Рекомбинантные плазмиды pLp 23 и pLp 37 в высокой степени гибридизовались с образцами ДНК производственных штаммов ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГНКИ-3, ВГНКИ-5,ВГНКИ-б, за исключением ВГНКИ-4.


2.2.2.7. Проверка специфичности рекомбинантньх плазмид на коллекции ДНК штаммов различных видов микроорганизмов.

Препараты ДНК различных культур микроорганизмов Е. coli, Leptospira interrogans, Yerslnia pseudotuberculosis, Bordetella bronchioseptiсa, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium rinale, Pasterella multocida, Brucella abortus, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma luteus гибридизовали по стандартной методике с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 41.

Результаты эксперимента показали, что нуклеотидные последовательности ДНК L. роmопа рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 41, не обнаруживают перекрестную гибридизацию с образцами ДНК чужеродных источников. В местах нанесения препаратов ДНК cероваров патогенных лептоспир отмечали положительные сигналы гибридизации.


2.2.2.8. Реакция блот-гибридизации для дифференциации производственных штаммов лептоспир.

Ряд молекулярно-генетических методов позволяют осуществить дифференциацию возбудителя заболевания при анализе структуры ДНК.

Препараты суммарной ДНК лептоспир в количестве 0,8 мкг расщепляли рестриктаэой Hind III, рестриктные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 0,8 % агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя блоттинг по Саузерну.

В качестве маркера молекулярной массы использовали фрагменты ДНК фага лямбда, полученные при расщеплении Pst I. Фильтры с иммобилизованными фрагментами ДНК лептоспир гибридизовали с фрагментами рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41.

Результаты блот-гибридизации Hind III фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК - зондами pLp 23, pLp 37, pLp 41 представлены в таблице 2.


Таблица 2.

Результаты блот-анализа.

__________________________________________________________________

№ штаммы Размеры гибридизующихся Hind III -

Фрагментов ДНК лептоспир с ДНК-зондом (т.п.н.)

_______________________________________________


pLp 23 pLp 37 pLp 41

__________________________________________________________________

1. ВГНКИ-1 4,9; 4,8; 4,7 5,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

2 ВГНКИ-2 3,6 4,7;4,0;2,9 4,5; 3,5

3 ВГНКИ-3 4,8; 3,6 4,6; 4,0; 2,9 5,0; 4,5

4 ВГНКИ-4 4,8; 3,6 4,8; 4,5; 4,0 5,1-2,9;2,4;2,0;1,7

5 ВГНКИ-5 4,8; 3,6 4,7;4,0;2,0 4,8;4,5;3,5

6 ВГНКИ-6 4,8 4,8;4,7;2,9 4,8;3,5;2,6

7 MoskvaV 4,9;4,6;3,6 5,0;4,0 5,1;4,7;4,5;2,8;1,4

8 Каширский 4,8;3,6 4,8;4,6;4,0;2,9 5,0;4,5

9 Perepelicyn 4,8;3,6 4,8;4,0 5,1-4,5-2,9;2,4;2,0;1,7

10 493 Poland 4,8;4,7;4,6 4,8 5,1;4,7;4,5;3,5;2,9

11 Pomona 4,8;3,6 4,8;4,6;4,0;2,9 5,0;4,5;3,5

__________________________________________________________________

С ДНК-зондом pLp 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-3,ВГНКИ-4 и ВГНКИ-5, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно низкий гибридизационный сигнал.

При гибридизации с ДНК-зондом pLp 37 не отмечено существенных различий у штаммов ВГНКИ-3, ВГНКИ-2, а для штамма ВГНКИ-1 интенсивная гибридизационная полоса была локализована в верхней части трека, при этом не наблюдалось никаких дискретных полос.

Отсюда можно полагать, что существуют отдельные места в геноме BГHKИ-1, где комплементарные ДНК-зонду pLp 37 нуклеотидные последовательности концентрируются в значительной степени.

Из представленных данных следует, что pLp 23 и pLp 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир методом блот-гибридизации по Саузерну.

Различие гибридизационных профилей ДНК лептоспир, рестрикцированных эндонуклеазой Hind III, оказались наиболее демонстративными, когда в качестве ДНК - зонда, использовали фрагмент -вставку размером 1,20 т. п. н., которая выщепляется из рекомбинантной плавмиды pLp 41. Производственные штаммы лептоcпир отличались друг от друга числом к размером гибридизующихся фрагментов, а также интенсивностью сигнала радиоавтографии. Характерно наличие пяти дискретных полос для штамма ВГНКИ-1 и интенсивного гибридизационного пятна по всему треку для штамма ВГНКИ-4, что, вероятно, указывает на хороший разброс по геному данной клонированной последовательности. Результаты блот-гибридизации позволяют предполагать, что фрагмент - вставка рекомбинантной плазмиды pLp 41 представлен в геноме ВГНКИ-4 как большое количество копий, повторяющихся друг за другом.

Таким образом, каждый производственный штамм характеризовался наличием как общих, так и индивидуальных различающихся по молекулярной массе и специфичности отдельных фрагментов' ДНК.

Блот-гибридизация Hind III фрагментов ДНК штаммов лептоспир с ДНК-зондом pLp 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного штамма Moskva V, а в случае гибридизации с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 37 профили этих штаммов были отчетливо различимы. Также нами установлено, что нельзя точно отличить блот - гибридизацией c ДНК-зондом pLp 41 производственный штамм ВГНКИ-3 и референтный штамм Каширский. Однако, блот- гибридизация с ДНК-зондом pLp 41 различала производственные штаммы ВГНКИ-4, ВГНКИ-5 и ВГНКИ-6 серогрупп Tarasoovi, Sejroe и Pomona cоответственно от их референтных штаммов Perepelicyn, 493 Poland и Pomona.


2.2.3. Разработка комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к антигенам респираторных вирусных инфекций КРС


За основу разрабатываемой иммуноферментной тест-системы взят стандартный вариант непрямого твердофазного ИФА.

Основные этапы работ в этом направлении были следующими:

- получение и иммунохимическая характеристика основных иммунологических реагентов, входящих в тест-систему;

- разработка иммуноферментной тест-системы и определение её основных диагностических параметров;

- оценка эффективности разработанной тест-системы в сравнении с методами аналогичной направленности.

Основными иммунологическими реагентами, используемыми для разработки непрямого варианта твердофазного ИФА, служили очищенные антигены, вирус-специфические анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД-БС, анти-РС, анти-АВ и отрицательные сыворотки; конъюгат анти-IgG-КРС с пероксидазой. Получение и иммунохимическая характеристика данных реагентов являлись ключевым звеном технологической цепи по производству иммуноферментной тест-системы.


Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях.

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80 проводили в биореакторе емкостью 25 л (разработка ВНИТИБП, Иркутск НИИХИММАШ) в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления (разработка и изготовление ВНИТИБП и НПО «Промавтометика»).

Для культивирования клеток животных и вирусов использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 был 2-4, а накопление клеток в 1 см³ – 0,9-1,3 х10⁶.

На автоматизированных блочно-модульных установках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителях «Cytodex», что позволило сравнить продуктивность клеточных культур в зависимости от различных систем культивирования. (Табл.3)

Таблица 3

Средняя продуктивность различных систем

культивирования клеток животных

№п/п	Система культивирования	Количество клеток в 1 мл питательной среды
1	Биореактор с перемешиванием и протоком среды	5х106
2	Эрлифтный биореактор	5х106
3	Биореактор с биофильтром и протоком среды	7х106
4	Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Cytodex»	107 (перфузия)
5	Биореактор с пористыми ячейками	108(перфузия)
6	Биореактор с полыми волокнами	108(перфузия)
7	Мембранные биореакторы (керамический модуль)	109 (перфузия)

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов наиболее перспективным является метод культивирования в микрокапсулах и на микроносителях.

В результате пяти культивирований клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч, средний индекс пролиферации был равен 2.

В процессе культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосредственно в биореакторе.

При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в биореакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Распределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 ч после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом число прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, составлял 4,2.


Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС.

На первом этапе отрабатывали условия получения очищенного препарата вируса ИРТ. Методологической основой для проведения этих исследований служили данные отечественных и зарубежных исследователей в этой области (Кузнецова С.В., 1991, Кузнецов Д.П., 2001).

Исходным материалом для получения антигена служила суспензия вируса ИРТ в перевиваемой культуре клеток ПТ-80. При этом необходимым условием для получения высокоактивного очищенного антигена было наличие высокого его титра в исходном культуральном вирус-содержащем материале. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ИРТ-10⁸ ТЦД₅₀/см³.

Поэтому для выделения, концентрирования и очистки использовали вирус с инфекционной активностью не ниже 10 ^8,0ТЦД₅₀/см³.

Для концентрирования ИРТ вирус-содержащий материал подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию с последующим осветлением его путем центрифугирования (4000 об/мин в течение 40 мин). Полученный супернатант собирали и подвергали дальнейшей обработке по следующей прописи: на 1 л вируссодержащего материала добавляли 75 г полиэтиленгликоля (ПЭГ, М.М. 6000), 20 г NaCl, 0,2 г NaN₃, тщательно перемешивали и выдерживали в течение 3-х суток при +4°С. Осадок отделяли центрифугированием (4000 об/мин в течение 40 мин), затем его ресуспендировали в 15 см³ ФСБ (0,01 М Na₂HPO₄, 0,15 М NaCl, рН 7,2) и диализовали против этого же буфера в течение 12 ч.

Концентрированный вирусный препарат очищали методом ультрацентрифугирования (125000 g в течение 1,5 часов) в линейном (30-45%) градиенте плотности сахарозы.

На каждом этапе специфическую активность вируса контролировали: комплементсвязывающую активность - по методу Rossi G., преципитирующую -по методу Ouchterlony L., гемагглютинирующую - по методу Крюкова Н.Н.

Результаты исследований показали, что после осаждения вирус концентрировался в 100-200 раз в 20-30 мл ФСБ с сохранением своих антигенных свойств. При очистке в линейном градиенте плотности сахарозы вирус располагался в компактной опалесцирующей зоне, из которой его отбирали, и использовали в дальнейшей работе. Конечная концентрация белка в вирусном антигене составляла 0,5- 0,8 мг/мл в зависимости от концентрации исходного препарата. Биологическая активность препарата вируса ИРТ по мере очистки и концентрирования достоверно увеличивалась. В РДП с 1:16 в исходной суспензии до 1:64 при 50 -кратном концентировании, в РГА -с 1:16 до 1:56, в РСК - с 1:4 до 1:64 соответственно.

Результаты проведенных исследований показали, что данный метод получения высококонцентрированного и очищенного препарата вируса ИРТ позволяет получать его в препаративных количествах и впоследствии эффективно использовать в качестве антигена в разрабатываемой иммуноферментной тест-системе.


Очистка и концентрирование РС-вируса.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус РС -10⁶ ТЦД₅₀/см³.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов РС-вируса было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий (Кочиш Т.Ю., 2004).

При концентрировании РС-вируса, штамм "Randall", были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ) с различным молекулярными массами: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5,0; 7,0 и 10,0%.

При концентрировании РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, полиэтиленгликолем очистка вируса варьирует от 11,5 до 90,5%. Потеря вируса равна 6,5 - 19,4%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон в концентрации 7%. Очистка вируса равна 90,5%, а потеря 6,5%.

Для концентрирования РС-вируса также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония - (NH₄)₂SO₄. До 90,4% вируса осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 100 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 66,4%.

Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты РС-вируса в 10 - 100 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на полупроницаемых мембранах является небольшая потеря инфекционной активности вируса от 5,7% при концентрировании в 10 раз до 14,5% - в 100 раз. Однако общее количество белка в концентрате при этом многократно увеличивается, что не позволяет добиться очистки вируса. Так при концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса увеличивается на 13,8%, а при концентрировании в 100 раз на 42,3%.

Наряду с концентрированием вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 90000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование при 90000g в течение 5 часов позволяет практически полностью без потерь осадить РС-вирус из вирус-содержащей суспензии. Очистка при этом достигает 91,0%

Концентрированную и частично очищенную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 90000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1 мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см³, соответствующий уровню 45% сахарозы, с выходом вируса до 91,7%. Одновременно происходит очистка на 97,3%. Максимумы активности в ИФА и РСК совпадают с пиком инфекционной активности. Однако, в нижней фракции на дне центрифужной пробирки наблюдалась небольшая активность, как в РСК (1:4), так и в ИФА при полном отсутствии инфекционности данной фракции.

Определение плавучей плотности РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на "подушке" сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. На дно центрифужной пробирки помещали "подушку" из 55% сахарозы с плотностью 1,25г/см³, затем наслаивали 45% сахарозу с плотностью 1,20г/см³, а сверху - 25% сахарозу с плотностью 1,10г/см³. На такой преформированный ступенчатый градиент наслаивали вирусный препарат. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов. Вирус локализовался в интерфазе между 25% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты, с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты), через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 99,6% (0,5мг/мл белка в исходном препарате и 0,01мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 10 раз. Выход вируса составил 99,2%.

Была также определена плавучая плотность вируса в градиенте Фиколла - 400. Для этого очищенный и концентрированный вирус на этапе осаждения ПЭГ М-6000 ресуспендировали в 0,06 М трис-HCl буфере, содержащем 0,1М NaCl и 1мМ ЭДТА (ТНЕ буфер), рН 7,3 и осветляли низкоскоростным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Вирус из надосадка осаждали ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов. Осадок ресуспендировали в ТНЕ буфере и наносили на линейный 10% - 40% градиент Фиколла-400. Центрифугирование проводили при 90000g в течение 5 часов.

По окончании центрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр комплементсвязывающей активности и активность в непрямом твердофазном ИФА. РС-вирус концентрировался в зоне, соответствующей 37% Фиколла-400 с плотностью 1,19 г/см³, так как здесь был наивысший титр инфекционности вируса, его комплементсвязывающая активность и активность в ИФА.

Фракции, содержащие РС-вирус, объединяли. Степень очистки определяли по отношению титра инфекционности вируса к количеству общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен на 99,5%, потери составили 7%.

Суммируя результаты экпериментов по концентрированию и очистке РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, можно заключить, что осаждение вируса ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7% наиболее оптимальный способ для первоначального концентрирования и очистки, так как при концентрировании в 100 раз позволяет, во-первых, удалить до 90% баласного белка при потере не более 7% инфекционных частиц вируса, во-вторых, работать единовременно с большим объемом вируссодержащей суспензии. Сульфат аммония осаждает вместе с вирусным материалом большое количество баластного белка - очистка не превышает 67%. Ультрафильтрация, несморя на возможность работы с большими объемами вируссодержащего материала и сохранение до 85% инфекционных вирусных частиц, не позволяет добиться одновременной очитки, так как количество баластного белка, в расчете на инфекционную дозу, увеличивается при концентрировании в 100 раз на 42%. Осаждение вируса ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов позволяет практически без потерь осадить вирус на дно центрифужной пробирки при очистке до 91%, но очень трудоемка и позволяет единовременно очищать не более 40 мл вируссодержащей культуральной среды. Тоже самое относится и к ультрацентрифугированию в градиентах сахарозы и Фиколла 400.

Определив условия концентрирования РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, вышеописанными методами, была составлена схема получения концентрированного и очищенного вируса, включающая осаждение вируса из культуральной среды ПЭГ с молекулярной массой 6000 Д в концентрации 7%, переосаждение осадка ультрацентрифугированием при 90000g в течение 5 часов и осаждением полученного материала на градиентную интерфазу сахарозы.

Таким образом, получены препараты РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, которые использовались для изучения белкового состава вируса, выделения гликопротеинов, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для выделения анти-РС антител из сывороток естественно переболевших животных.

При определении условий хранения РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, его помещали в условия, при которых, температура соответствовала -500, -200, -70, +40, +200 и +37⁰С.

РС-вирус хранится в условиях температуры от +40 до -500С практически без снижения титра инфекционности в течение 1 месяца. При дальнейшем хранении вируса происходит снижение титра инфекционности на 1 lg ТЦД_50/МЛ прaктичecки ежемесячно.

В течение первых суток титр инфекционности РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, снижается с 5,75 до 5,5 lg в условиях температуры +20⁰ и до 4,5 lg - при +З7⁰С. Далее при температуре +37⁰С титр инфекционности снижается до 0 через 4 суток и до 2,25 lg при +20⁰С.


Антиген РС-вируса для определения уровня антител в иммуноферментном анализе.

Для изучения белков, входящих в состав РС-вируса, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию обрабатывали 2% тритоном Х-100 и инкубировали при +20⁰С в течение 60 минут на шейкере. Затем нуклеокапсид и неразрушенные вирусные частицы осаждали центрифугированием при 100 тыс. g в течение четырех часов, а белки из надосадка концентрировали ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения 3 кД до концентрации 500 мкг/мл. Далее белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ. Тритоном X-I00 отщепляется 9 белков с ММ от 28 до 180 кД.

Вирусные белки, индуцирующие выработку анти-РС антител у восприимчивых к РС-инфекции КРС животных, определялись посредством иммуноблотинга с индикацией белков в непрямом методе ИФА. В качестве анти-РС антисыворотки использовали сыворотку от переболевших животных в разведении I:50 (титр в непрямом ИФА 1:12800). Иммуноглобулины КРС выявляли антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом. У переболевших животных вырабатываются антитела к 6 вирусным белкам с ММ от 42 до 180 кД.

Таким образом, в составе РС-вируса, штамм "Randall", репродуцированного в культуре клеток ЛЭК, выявлено 9 белков, отщепляющихся при обработке тритоном X-I00 с ММ от 28 до 180 кД. Шесть из них с ММ от 42 до 180 кД индуцируют выработку анти-РСВ антител у восприимчивых к РС-инфекции животных.

Концентрированные ультрафильтрацией белки РС-вируса, отщепленные Тритоном Х-100 были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения анти-РС антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки анти-РС IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные анти-РС IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 8мг белка на 1мл геля, согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки анти-РС IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритон Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение ночи при +4⁰С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1М глицин HCl, pH 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5 - 50мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3кД при давлении 0,3мПа до концентрации белка 0,1мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины РС-вируса практически без примесей.

Специфичность аффинно очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с анти-РС сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ. Все гликопротеины сохранили свою антигенную активность после аффинной очистки на иммуносорбентах с анти-РС IgG.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов РС-вируса из вирус-содержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены РС-вируса.


Очистка и концентрирование вируса парагриппа-3.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ПГ-3 -10⁸ ТЦД₅₀/см³.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 применяли методику, разработанную в отделе молекулярной биологии ВНИТИБП (Быкова Н.Н.,1989; Филиппов С.Ю., 2004).

Клетки выращивали на культуральной среде, содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.

После образования монослоя клеток инокулировали вирус ПГ-3, штамм "ЗКСМ" в течение часа при 37°С из расчета 1-2 ТЦД₅₀ на клетку. Репродукцию вируса проводили в бессывороточной среде ГЛАХ, содержащей 40 единиц гентамицина на литр среды.

После проявления 80% ЦПД клетки разрушали однократным замораживанием-оттаиванием и клеточный детрит осаждали центрифугированием.

Надосадочную вирус-содержащую среду исследовали на инфекционную и гемагглютинирующую активность. Вирус, выращенный в перевиваемой культуре ПТ-80, проявлялся в реакции ГА в титрах 1:64 - 1:128, обладал инфекционностью на уровне 6,8 - 8,0 lg ТЦД_50/мл. Во всех проведенных экспериментах он по всем показателям превосходил вирус, репродуцированный в монослое клеток легкого (ЛЭК), трахеи (ТЭК) эмбриона коровы и куриных эмбрионов (ККЭ). Однако величины этих различий от опыта к опыту были не однозначными и варьировали в значительном диапазоне.

В образцах перевиваемой культуры клеток ПТ-80, инфицированных дозой 1-2 ТЦЦ₅₀/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ПГ-3 КРС было использовано несколько принципов выделения вируса из вируссодержащих суспензий.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС были изучены различные условия осаждения его полиэтиленгликолем (ПЭГ). Был испытан ПЭГ с различным молекулярной массой: 3000, 6000 и 20 000 дальтон в концентрации 5,0; 7,5 и 10,0%.

При концентрировании вируса ПГ-3 КРС ПЭГ очистка вируса достигает 88,1 - 97,9%. Потеря вируса равна 36,9 - 84,2%. Лучшие результаты получены в случае применения ПЭГ с молекулярной массой 6000 дальтон.

Для концентрирования вируса ПГ-3 КРС также был использован принцип осаждения вируса высаливанием. Для этой цели использовали 40% сульфат аммония. До 80% вируса ПГ-3 КРС осаждается 40% сульфатом аммония при концентрировании в 10 раз. Очистка от балластных белков составляет в этом случае 91,6%.

Концентрирование вирус-содержащей суспензии проводили с использованием ядерных фильтров, изготовленных в лаборатории ядерных реакций Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна). О кратности концентрирования судили по накоплению фильтрата в мерном сосуде на выходе из ячейки.

В препаратах культурального вируса ПГ-3 КРС до и после концентрирования определяли титр инфекционной активности, общий белок и агглютинирующую активность. Метод ультрафильтрации позволяет концентрировать препараты вируса ПГ-3 КРС в 10 - 50 раз. Особенностью концентрирования вирусной суспензии на ядерных фильтрах является снижение в концентрате количества общего белка. При концентрировании вирусной суспензии по объему в 10 -50 раз количество белка в расчете на инфекционную дозу вируса снижается на 85,0 - 87,4%. При концентрировании препарата в 10 раз потерь вируса не наблюдалось, с повышением кратности концентрирования до 50 раз потеря вируса составляла 20,4%.

Биологическая активность препарата вируса ПГ-3 КРС по мере концентрирования ультрафильтрацией достоверно увеличивается. В РГА с 1:64 в исходной суспензии при 50 - кратном концентрировании до 1:516.

Наряду с концентрированием вируса ПГ-3 КРС вышеописанными методами испытывался также метод осаждения вируса высокоскоростным ультрацентрифугированием. Вирус из предварительно осветленной низкоскоростным центрифугированием культуральной жидкости осаждали при 100 000g в течение 1, 2, 3, 4 и 5 часов. Высокоскоростное центрифугирование позволяет практически полностью без потерь осадить вирус ПГ-3 КРС из вируссодержащей суспензии. Очистка при этом достигает 97,5 - 98,6%.

Для изучения возможности очистки вируса ПГ-3 КРС осаждением в градиенте сахарозы концентрированный и частично очищенный вирус ПГ-3 КРС центрифугировали при 100000g в ступенчатом градиенте сахарозы от 15 до 55% с диапазоном изменения концентрации в 10%. По окончании ультрацентрифугирования собирали фракции по 1мл. В каждой фракции измеряли рефрактометрический индекс, титр инфекционности, титр гемагглютинирующей активности и титр в ИФА. Пик инфекционной активности приходится на фракции с плотностью 1,20г/см³, соответствующий уровню 45% сахарозы с выходом до 63,08% вируса. Одновременно происходит очистка вируса ПГ-3 КРС на 97,1%.

Определение плавучей плотности вируса ПГ-3 КРС, штамм "ЗКСМ", позволило при очистке вируса использовать центрифугирование на "подушке" сахарозы или иначе на градиентную интерфазу. Вирус локализуется в интерфазе между 45% и 55% сахарозы. Посторонние компоненты с меньшей плавучей плотностью (белки и нуклеиновые кислоты) через зону 45% сахарозы не проходят и остаются в верхней части центрифужной пробирки. При этом достигается не только очистка на 88,4% (3,2мг/мл белка в исходном препарате и 1,9мг/мл - в конечном), но и концентрирование его в 6 – 7 раз. Выход вируса составил 55,4%.

Таким образом, ультрацентрифугирование вируса ПГ-3 КРС в градиенте плотности 15% - 55% и на "подушке" сахарозы позволяет получить высокоочищенный и концентрированный препарат вируса ПГ-3 КРС.

Была также определена плавучая плотность вируса ПГ-3 КРС в линейном 10 - 40% градиенте Фиколл - 400. Вирус ПГ-3 КРС концентрировался в двух зонах, соответствующих 19% и 29% Фиколла-400 с плотностью 1,065 и 1,098 г/см³, соответственно, так как в этих зонах отмечены наивысшие титры инфекционности вируса, его гемагглютинирующей активности и активности в ИФА.

Фракции, содержащие вирус ПГ-3 КРС, объединяли. Степень очистки определяли по титру инфекционности вируса на количество общего белка. В результате проведенной работы вирус был очищен в 156 раз, потери составили 49%.

Таким образом, в линейном 10% - 40% градиенте плотности Фиколла-400 вирус ПГ-3 КРС штамм "ЗКСМ", располагался в двух зонах и имел плавучую плотность 1,065 и 1,098г/см³, соответственно.

Анализ результатов электронно-микроскопических исследований и сопоставление их с вирусологическими данными, показывает, что высокие и стабильные показатели биологической активности вируса, репродуцированного в перевиваемой культуре ПТ-80, обусловлены прохождением вирионами полного цикла морфогенеза и образованием ультраструктур (пепломеров), ответственных за гемагглютинирующую, инфекционную и в значительной мере антителообразующую активности.

В образцах перевиваемой культуры ПТ-80, инфицированных дозой 1-2 ТЦД₅₀/клетку, вирусные частицы с типичной для вируса парагриппа-3 морфологией обнаруживаются уже через 24 ч, достигая максимума к 72 ч культивирования. По мере снижения заражающей дозы первые вирусные частицы обнаруживаются в пробах, полученных спустя 72 и даже 144 ч после инфицирования.

Следует отметить, что количество вирионов с пепломерами, являющимися морфологическими структурами, содержащими гемагглютинин и нейраминидазу, возрастает по мере снижения дозы заражения и удлинения сроков культивирования.

Таким образом, получены препараты вируса ПГ-3, которые использовались для изучения белков вируса, отщепляющихся при обработке последнего тритоном Х-100, обладающих антигенной активностью, с целью синтеза иммуносорбента для аффинного выделения анти-ПГ-3 антител из сывороток естественно переболевших животных.

Очистка и концентрирование вируса диареи-болезни слизистых.

Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус ВД-БС – с инфекционностью на уровне 10⁷ ТЦД₅₀/см³.

Исходным материалом для получения антигена служила суспензия вируса ВД-БС в перевиваемой культуре клеток ПТ-80.

Для концентрирования ВД-БС вирус-содержащий материал подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию с последующим осветлением его путем центрифугирования. Полученный супернатант собирали и подвергали дальнейшей обработке полиэтиленгликолем (ПЭГ, М.М. 6000).

Концентрированный вирусный препарат очищали методом ультрацентрифугирования (125000 g в течение 1,5 часов) в линейном (30-45%) градиенте плотности сахарозы.

На каждом этапе контролировали специфическую активность вируса.

Результаты исследований показали, что после осаждения вирус концентрировался с сохранением своих антигенных свойств. При очистке в линейном градиенте плотности сахарозы вирус располагался в компактной опалесцирующей зоне, из которой его отбирали, и использовали в дальнейшей работе. Конечная концентрация белка в вирусном антигене составляла 0,8-1,0 мг/мл в зависимости от концентрации исходного препарата. Биологическая активность препарата вируса ВД-БС по мере очистки и концентрирования достоверно увеличивалась. В РИД с 1:16 в исходной суспензии до 1:64 при 50-кратном концентрировании, в РНГА -с 1:16 до 1:64.

Результаты проведенных исследований показали, что данный метод получения высококонцентрированного и очищенного препарата вируса ВД-БС позволяет получать его в препаративных количествах и впоследствии эффективно использовать в качестве антигена.

Альтернативно активный антиген ВД-БС получали обработкой зараженных клеток Тритоном Х-100 или 1-оctyl-beta-D-glucopyranoside (OGP).


Очистка и концентрирование вируса аденовирусной инфекции. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирус – с инфекционностью на уровне 10⁶ ТЦД₅₀/см³.

Вирус АВИ, штамм "Bovine 10" (cеротип 1), с титром инфекционности 4,0-4,5 lg ТЦД ₅₀/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка - Т-1.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса АВИ проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.

В работе по очистке вируса АВИ от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400.


Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для тест-системы

Известно, что ключевыми реагентами любой системы иммунологического анализа являются вирус-специфические антитела, специфичность и аффинность которых, во многом предопределяет основные аналитические параметры всех иммунохимических методов, и, прежде всего ИФА

Низкое содержание специфических антител в неочищенной сыворотке (20-30% от общего количества) снижает ее эффективность в одних тестах и может приводить к повышению фоновых значений в других.

Наиболее эффективным, позволяющим существенно повысить чистоту препарата, является метод аффинной хроматографии, с помощью которого выделяют антитела только к определенному антигену. Идеальным методом очистки антител является иммуноаффиннная хроматография. Иммуноаффинные колонки можно готовить после активации перйодатом натрия обычно используемых матриц, таких как агароза (сефароза) или целлюлоза.

Получение антител иммуносорбционным методом является наиболее универсальным, так как антитела могут быть получены к любому антигену. Другое достоинство метода - высокая степень избирательности, которая связана с индивидуальной специфичностью антител, а значит и возможность получения индивидуальных антигенов. Главное его преимущество - одноступенчатость процессов, гомогенность получаемого препарата и практически отсутствие потерь.

Для получения положительных анти-ИРТ, анти-ПГ-3, анти-ВД-БС, анти-РС, анти-АВ контрольных сывороток и отрицательного контроля использовали метод аффинной хроматографии.

Таким образом, были получены контрольные положительные и отрицательные образцы, представляющие собой препараты гомогенных иммуноглобулинов, содержащих и не содержащих вирус-специфические антитела, соответственно.


Определение допустимых величин оптической плотности (ОП) контрольных сывороток.

Для получения достоверных результатов при тестировании сывороток по одному разведению необходимо было определить допустимые величины оптической плотности контрольных сывороток. Для исследования брали 17 повторностей проб положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведении 1:400. Получили, что значения оптической плотности контрольных сывороток в диапазоне от 0,949 до 1,309 для положительного контроля и от 0,102 до 0,142 для отрицательного контроля являются оптимальными.(Табл.4)

Таблица 4

Допустимые значения ОП контрольных сывороток.

показатели	Положительный контроль (Р)	Отрицательный Контроль (N)	Разница между контролями (Р- N)
Среднее значение стандартного отклонения+&	1,129+0,18	0,122+0,02	1,006+0,135
Доверительный интервал	0,949-1,309	0,102-0,142	0,871-1,141

Если значения оптической плотности контрольных сывороток выходят за рамки допустимых значений, то результаты реакции будут считаться сомнительными, и пробы должны быть исследованы заново.


Оптимизация условий проведения ИФА

Концентрацию антигенов, рабочие разведения контролей и конъюгата определяли в предварительных экспериментах методом "шахматного" титрования, делая последовательные разведения компонентов по горизонтальным и вертикальным рядам одной микропанели.


Таблица 5

Результаты "шахматного" титрования антигена вируса ИРТ и контролей в

ИФА

Концен­трация анти­гена (мг/мл)	ОП 450 положительного/отрицательного контролей, взятых в разведении:
1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1: 1600
0,5	1,36/0,15	1,23/0,15	1,11/0,12	0,99/0,12	0,78/0,11	0,62/0,11
0,25	1,19/0,16	1,05/0,13	0,90/0,12	0,75/0,12	0,60/0,12	0,45/0,11
0,125	1,11/0,15	1,01/0,13	0,84/0,13	0,66/0,11	0,50/0,11	0,36/0,11
0,06	1,01/0,15	0,99/0,13	0,82/0,13	0,64/0,11	0,50/0,11	0,34/0,11

Примечание: в данном эксперименте использован конъюгат в разведении 1:10000.

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов иммуноферментной тест-системы считали их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительным контролем ОП 450 > 1,0, а в лунках с отрицательным - < 0,2. Из данных, приведенных в табл.5, видно, что данным условиям отвечают следующие параметры реакции: концентрация антигена ИРТ- 0,06 мг/мл / разведения контролей - 1:50 или концентрация антигена - 0,125 мг/мл / разведения контролей - 1:100 и т.д. Оптимальным временем для адсорбции антигена была 18-ти часовая его инкубация при +4°С.

Аналогично устанавливали оптимальные рабочие концентрации антигенов вирусов ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекций - 1,0, 1,5, 0,75 мкг/ см³ и 1,25 мкг/ см³ соответственно.

В этих же экспериментах для повышения чувствительности и специфичности тест-системы подбирали буфер для сорбции антигена и антител, блокирующий белок и время инкубации иммунологических реагентов на твердой фазе. Исследования проводили эмпирически в системе непрямого варианта твердофазного ИФА, сравнивая различные варианты буферных смесей, временные и температурные показатели. Для предотвращения неспецифической реакции проводили подбор блокирующего белка, испытывая БСА, желатину, казеин, овальбумин, фетальную сыворотку крупного рогатого скота и сыворотку крови лошади. Во всех опытах в качестве субстратной смеси использовали раствор ТМБ, а в качестве раствора, останавливающего реакцию (стоп-раствор) - 0,1 М Н₂SО₄. Реакцию оценивали по показателям ОП₄₅₀ в лунках с положительным и отрицательным контролями и референтными сыворотками крови.

Полученные результаты показали, что оптимальными буферами являются ФСБТ (для промывки лунок), ФСБ и БРК (для разведения антигена и конъюгата соответственно). В качестве раствора, блокирующего несвязавшие белок участки пластика, был выбран ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. Этот же раствор использовали для разведения испытуемых и контрольных проб. При соблюдении этих условий и использовании специфических реагентов в следующих концентрациях (разведениях): антигена вируса ИРТ - 0,06 мг/мл, контролей - 1:50 и конъюгата - 1:10000 при 60 минутной инкубации на каждом этапе, неспецифическое взаимодействие компонентов полностью исключалось, а показатели ОП ₄₅₀ в лунках с положительными и отрицательными пробами были > 1,0 и < 0,2 соответственно.


ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РАЗРАБОТАННОЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Следующим этапом нашей работы было определение показателей качества разработанной тест-системы для выявления специфических антител к респираторным вирусам, в сравнении с методами аналогичной направленности. В качестве референтных методов были использованы реакция нейтрализация и РНГА.

В исследованиях использовали сыворотки крови иммунных и неиммунных животных различного пола и возраста, полученные из 15 хозяйств РФ. Кроме того, апробировали тест-систему для исследования проб молозива и молока, полученных от коров из этих же хозяйств. Чувствительность и специфичность тест-системы оценивали согласно стандартам МЭБ (Мапиаl of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004.)

Заявляемая тест-система была испытана при сравнительном титровании исследуемых сывороток методами РН, РНГА и ИФА для каждой вирусной инфекции соответственно. (Таблицы 6-11)

Установлено, что в 86 % случаях положительные результаты были получены во всех предложенных методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательны и в РН, РНГА.

Таблица 6

Сравнительная оценка титров антител к РС-вирусу КРС в РНГА, РН и ИФА.

количество сывороток	титр в ИФА	титр в РН *	титр в РНГА
41	-	-	-
6	200	-	-
83	400	2-4	4-8
56	400-800	4-16	16-64
27	800-1600	16-32	32-256
17	3200-6400	32-64	128-512
6	12800	64-128	1024

Примечание *: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 7.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ИРТ в РН и ИФА.

Общее количество сывороток	Количество сывороток, положитель-ных в РН	Титр в РН *	Количество сывороток, положитель-ных в ИФА	Титр в ИФА
28	14	2-4	28	200
12	12	2-4	12	800-1600
18	18	8-16	18	800-1600
22	22	32-64	22	3200-6400
27	27	128-256	27	12800-25600
17	17	>256	17	>25600

*: представлены данные обратные значениям титров РН и ИФА.

Таблица 8.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ВД-БС в РН, РНГА и ИФА

количество сывороток	Титр в ИФА*	Титр в РН *	Титр в РНГА*
77	-	-	-
16	200	-	-
183	400	2-4	4-8
156	400-800	4-16	16-64
99	800-1600	16-32	32-256
17	3200-6400	32-64	128-512

*: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 9.

Сравнительная оценка титров антител к вирусу ПГ-3 в РН, РНГА и ИФА

количество сывороток	Титр в ИФА	Титр в РН *	Титр в РНГА
41	-	-	-
6	200	-	-
83	400	2-4	4-8
56	400-800	4-16	16-64
27	800-1600	16-32	32-256
17	3200-6400	32-64	128-512
6	12800	64-128	1024

*: представлены данные обратные значениям титров РН, РНГА и ИФА.

Таблица 10.

Сравнительная оценка титров антител к аденовирусной инфекции (АВИ) в РН, РНГА и ИФА

количество сывороток	титр в ИФА	титр в РН *	титр в РНГА
41	-	-	-
6	200	-	-
73	400	2-4	4-8
54	400-800	4-16	16-64
28	800-1600	16-32	32-256
37	3200-6400	32-64	128-512
6	12800	64-128	1024