Методическая разработка к лекции по теме: методические основы тонкослойной хроматографии

Вид материала

Содержание

Определение активности сорбента.
Приготовление пластинок с закрепленным слоем.
Нанесение образцов.
Обнаружение хроматограмм.
Обработка результатов.
Запись результатов разделения в тонком слое и хранение хроматограмм.
Использование метода тсх для анализа лекарственных средств.
Разделение местных анестетиков

Подобный материал:

Методическая разработка к лекции по теме:

МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

ВВЕДЕНИЕ. ЗАКРЕПЛЕННЫЕ И НЕЗАКРЕПЛЕННЫЕ СЛОИ.

Продолжительность лекции: 2 часа

Цель занятия: Ознакомить студентов с методами тонкослойной

хроматографии и с требованиями, предъявляемым к ней. Также ознакомить с применением данного метода при анализе лекарственных препаратов.

План лекции: а) тонкослойная хроматография и предъявляемые к

ней требования

б)сорбенты, закрепленные и незакрепленные хроматографические пластинки

в) определение степени активности сорбентов

г)методы приготовления пластинок с тонким слоем сорбента и нанесение образцов исследуемых веществ

д) хроматографирование, обнаружение зон локализации исследуемых веществ на хроматограмме

е) применение метода тонкослойной хроматограммы при анализе лекарственных веществ.

литература

Государственные фармакопеи, Х-ХI, 1968-1990.
Ибадов А.Ю. –Фармацевтическая химия, Т.1996г.
М.Шаршунова, В.Шварц,Ч.Михалец-Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии,1,2 часть.Изд. «Мир»1980г.
А.А. Лурье-Хроматографические материалы.М. «Химия»,1978г.
Б.В. Айвазов- Практическое руководство по хроматографии «Высшая школа»,М.1968г.
Ф.В.Бабилов,Т.В.Трапицина- Газожидкостная хроматография в фармацевтическом анализе. Изд. «Штиинца»,Кишинев.1978г.

Методические основы тонкослойной хроматографии.

Введение. Закрепленные и незакрепленные слои.

Тонкослойная хроматография имеет три аспекта применения. Самым распространенным является качественный анализ веществ и их смесей. Количественный анализ смеси веществ и препаративное выделение индивидуальных компонентов составляют две другие области применения тонкослойной хроматографии. Проведение хроматографии в тонком слое слагается из нескольких операций: а) приготовление слоя; б) подготовка образца; в) нанесение образца; г) проведение хроматографического разделения; д) обнаружение хроматограммы; е) интерпретация результатов разделения и фиксирование хроматограммы в рабочем журнале.

Для осуществления этих операций необходимо иметь лабораторный стол, стеклянные пластинки и необходимые сорбенты( или готовые фирменные пластинки), микропипетки, камеры для проведения хроматографического разделения на пластинке, пульверизатор для разбрызгивания обнаруживающих растворов, вытяжной шкаф с подводкой сжатого воздуха или инертного газа и сушильный шкаф.

При хроматографированиии в тонком слое применяют два основных типа пластинок: с закрепленным слоем и незакрепленным. Пластинки с закрепленным слоем готовят, заливая их суспензией мелко размолотого хроматографического материала в воде или органическом растворителе. К суспензии обычно добавляют связующее вещество для закрепления слоя. В некоторых случаях, когда присутствие связующего вещества отрицательно сказывается на результатах анализа, его не добавляют в суспензию. Пластинки с незакрепленным слоем готовят из сухого сорбента, разравнивая его по стеклянной пластинке до получения слоя одинаковой толщины.

Оба типа слоя вошли в аналитическую практику одновременно. Преимущество пластинок с незакрепленным слоем адсорбента состоит в том, что их можно легко и быстро приготовить при помощи простого вспомогательного оборудования. Что касается пластинок с закрепленным слоем, то они стали очевидным и неотъемлимым элементом лабораторной техники; механическая прочность позволяет готовить их впрок, они не требуют особой осторожности в обращении, хроматограммы на закрепленном слое удобно обнаруживать. Однако их главное преимущество заключается в большей разделительной способности по сравнению с незакрепленными слоями.

СОРБЕНТЫ.

Силикагель и окись алюминия пригодны для разделения самых различных типов соединений, т.е.являются универсальными сорбентами. Они доступны, недороги, обладают замечательной разделительной способностью. Эти сорбенты удобны тем, что можно регулировать их активность, меняя рН, зернение и т.д. Силикагель хорошо зарекомендовал себя также и в качестве носителя неподвижной фазы при распределительной хроматографии. Качество силикагеля определяют не только эффективность разделения, но и стабильность некоторых химически неустойчивых соединений при их хроматографировании. Например, при разделении пиразолона наблюдалось заметное разложение образца, если хроматографирование проводили не сразу, а спустя некоторое время после их нанесения на стартовую зону. Очень удобным сорбентом для ТСХ является окись алюминия. Окись алюминия имеет различную активность и характеризуется различными значениями рН. Хорошим сорбентом является также  - форма окиси алюминия, получаемая нагреванием окси алюминия до 1250 С. На такой окиси алюминияф получаются более качественные и воспроизводимые результаты, чем при использовании обычных фирменных препаратов. Для разделения некоторых веществ, например сахаров, применяется так называемые алусил, представляющий собой силикагель с окисью алюминия. В последнее время получила хроматография на полиамиде большое распространение. Полиамиды в зависимости от способа получения обладают различной разделительной способностью. В качестве связующего для полиамидных слоев хорошо зарекомендовала себя целлюлоза. Помимо целлюлозы в качестве связующего можно использовать крахмал. Слои с прекрасными механическими свойствами можно получить из смеси полиамида, силикагеля и крахмала. Полиамид пригоден для разделения фенолов.

Большое распространение получила также хроматография в тонких слоях целлюлозы. При разделении на этом сорбенте можно использовать опыт, накопленный при проведении хроматографии на бумаге. В отличие от бумажной хроматографии эта методика обладает всеми преимуществами хроматографии в тонком слое: быстрое хроматографирование, диффузия пятен подавлена, емкость слоя значительная, а методы обнаружения более чувстительны.

Универсальные сорбенты для закрепления слоев.

Для приготовления закрепленных слоев требуется сорбент с величиной зерна в пределах 5 – 40 мкм, хотя используется и сорбент с более грубым зернением. На сорбентах слишком грубого или, наоборот, слишком тонкого зернения качество разделения ухудшается.

Для увеличения механической прочности слоя к сорбенту добавляют 10- 20% связующего вещества. Связывающее вещество не должно влиять на разделение. В большинстве случаев это влияние настолько мало, что им можно пренебречь. Наиболее распространенным связующим веществом является гипс. Очень эффективным веществом является крахмал. Однако его применение не имеет универсального характера, поскольку крахмал нельзя использовать при обнаружении хроматограмм реагентами, содержащими концентрированные кислоты, с последующим нагреванием. К группе связующих веществ относится также агар – агар. Его присутствие в слое практически не сказыавется на качестве разделения хроматографируемых веществ. Из других веществ, применяемых в качестве связующего, следует упомянуть полиэтилен, используемый при приготовлении слоев из активированного угля, а также связующее на основе целлюлозы, применяемое в быту в качестве обойного клея.

Для приготовления слоя тонкоразмолотый материал суспендируют в жидкой фазе до получения гомогенной суспензии.

Незакрепленные слои до сих пор применяются для быстрого и простого анализа смесей фармпрепаратов.

Для приготовления незакрепленных слоев используют сорбенты с более крупным зернением. Оптимальная величина зерна составляет 0.02 – 0.12 мм. Применение сорбентов с более мелким зернением ограничено трудностями приготовления слоя. При использовании сорбента с большим размером зерна ухудшается качество разделения веществ, пятна становятся растянутыми и размытыми. Материал, предназначенный для приготовления насыпных слоев, должен быть предварительно очищен просеиванием от механических загрязнений, мещающих получению равномерного слоя. В большинстве случаев пригодны сорбенты, предназначенные для колоночной хроматографии.

Наиболее распространенным сорбентом для приготовления незакрепленных слоев является окись алюминия. Его основной недостаток заключается в неоднородности качества. Силикагель соответствующего зернения также пригоден для приготовления незакрепленного слоя. В качестве материала для приготовления незакрепленных слоев применим также полиамид зернения 0.1- 0.2мм.

Готовые хроматографические пластинки, которые в настоящее время производятся в большом ассортименте во всем мире, находят все большее применение. Стеклянные пластинки с тонкими слоями сорбентов поставляют фирмы Merck, Schleicher and Schull; Customs Service Chemicals, Camag.Удобнее пользоваться готовыми слоями, нанесенными на алюминиевую фольгу или на гибкую фольгу из пластмассы. Преимущества фирменных пластинок бесспорны. Их не требуется предварительно готовить, они тщательно упакованы, хранятся неограниченно долго обладают механической прочностью, изготовлены из качественных материалов достаточной чистоты, обладающих высокой разделительной способностью.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СОРБЕНТА.

Определение адсорбционной активности требуется проводить прежде всего в тех случаях, когда необходимо обеспечить частичную или полную воспроизводимость результатов. При установлении воспроизводимости необходимо знать основные свойства применяемого сорбента, к которым относится и активность. Содержание воды, определяющее активность сорбента, меняется в зависимости от относительной влажности воздуха. Активность окиси алюминия определяют хроматографированием стандартного набора азокрасителей на насыпном слое, приготовленном из определяемого материала.

Значения h Rf азокрасителей в зависимости от степени активности окиси алюминия и силикагеля ( хроматограммы проявлены в четыреххлористом углероде).

азокраситель	2	3	4	5	2	3	4	5
Азобензол	59	74	85	95	61	70	83	86
n- метоксиазобензол	16	49	69	89	28	43	67	79
Судановый желтый	1	25	57	78	18	30	53	64
Судановый красный	0	10	33	56	11	13	40	50
n-Аминоазобензол	0	3	8	19	4	7	20	29
n- Оксиазобензол					1	1	7	18

Этим методом можно довольно точно определять степени активности от 3 до 5. Активность 1 установить нельзя, активность 2 можно определить при работе в атмосфере четыреххлористого углерода. Очевидно, что при работе с образцами более активной окиси алюминия вся оперфция должна занимать как можно меньше времени; при некотором навыке приготовления насыпного слоя, нанесение контрольной смеси азокрасителей и помещение хроматограммы в хроматографическую камеру занимает меньше одной минуты. Чтобы снизить до минимума воздействие воздуха на слой окиси алюминия хроматограмму оставляют на ночь в эксикаторе над серной кислотой, а затем быстро помещают ее в хроматографическую камеру.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛАСТИНОК С ЗАКРЕПЛЕННЫМ СЛОЕМ.

Обычно пластинки заливают с помощью специальных устройств - апликаторов. Большое число авторов пользуются хроматографическими пластинками, приготовленными вручную, причем эти пластинки нисколько не уступают пластинкам, приготовленным с помощью аппликаторов, ни по качеству, ни по разделительной способности, а некоторые различия в толщине слоя не оказывают заметного влияния на величину Rf( при приготовлении пластинок ручным способом трудно обеспечить абсолютно равномерную толщину слоя по всей поверхности). Ручной способ заливки хроматографических пластинок отличается простотой и почти не требует затрат на лабораторное оборудование.

НАНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦОВ.

Применяют калиброванные микропипетки. При проведении качественного анализа образцы можно наносить на хроматограмму с помощью обычного капилляра. Образцы можно наносить также с помощью шпателя или скальпеля. На кончик шпателя помещают очень небольшое, опытным путем подобранное количество вещества. На шпатель, находящийся в горизонтальном положении, рядом с образцом наносят каплю подходящего растворителя и, наклоняя шпатель острием вниз, дают капле стечь к образцу. Вещество растворяется и образует конц.раствор, который затем осторожно наносят на старт хроматограммы. Этим же способом наносят и образцы размельченных таблеток.

Нанесение в точку следует избегать, т.к.в этом случае после проявления и обнаружения хроматограммы вещества детектируются в виде узких растянутых пятен. При этом компоненты смеси с близкой подвижностью не разделяются между собой. Вслучае закрепленных слоев диаметр стартового пятна должен быть равен 3 – 4 мм, у насыпных слоев 6 – 8 мм. Очень хорошее разделение достигается при нанесении растворов веществ в виде узких поперечных полосок. Стартовые полоски должны быть длиной от 1 до 4 см и как можно более узкими.

ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЕ.

Подбор подходящей системы растворителей обычно не составляет большого труда. Одним из преимуществ хроматографии в тонких слоях при адсорбционном варианте является то обстоятельство, что, изменяя полярность системы, можно произвольно перемещать анализируемую смесь веществ в область оптимального деления.

Для предварительного подбора нужной системы испльзуется метод Шталя, согласно которому на пластинку наносят несколько стартовых пятен одной и той же смеси в разные точки. Затем в эти точки с помощью пипетки накапывают небольшие количество различных систем растворителей. Полученные таким образом миниатюрные круговые хроматограммы часто дают возможность судить, какая из систем для данного случая дает оптимальное разделение. Другой быстрый способ оценки заключается в нанесении слоя сорбента на стеклянную палочку или трубку; затем на слой наносят смесь веществ, а проявление проводят в пробирке.

Влияние температуры в масштабах колебаний комнатной температуры относительно невелико. Величины Rf заметно возрастают с температурой только при постоянном значении относительной влажности воздуха. Процесс хроматографирования можно проводить в любом сосуде подходящих размеров, снабженном герметичной крышкой. Камера должна герметично закрываться: необходимо исключить возможность испарения растворителей, поскольку это ведет к нарушению процесса хроматографирования. В неплотно закрытых камерах существует опасность изменения состава многокомпонентных систем. Выгодно применять камеры возможно меньшего объема. Рекомендуют работать с камерами, насыщенными парами системы растворителей, т.е. начинать элюирование после того, как весь объем камеры насытится парами растворителей. Применение насыщенной парами растворителя камеры предупреждает образование нежелательно «краевого» эффекта, при котором одно и то же вещество в середине хроматограммы имеет более низкие значения Rf, чем по краям пластинки. Хроматограммы чаще всего элюируют по восходящему варианту. Насыпные слои элюируют в плоских. При работе с многокомпонентными системами растворителей каждое новое хроматографирование связано с определенным изменением состава системы. Поэтому не рекомендуется хроматографировать серию хроматограмм в одной и той же порции растворителей. Всегда лучше использовать свежую порцию растворителя. При использовании гомогенных азеотропных смесей изменения состава системы не наступает, поэтому в одной и той же камере можно элюировать одну за другой до десяти хроматограмм без замены растворителя.

ОБНАРУЖЕНИЕ ХРОМАТОГРАММ.

Окрашенные вещества не требуют специального обнаружения однако подавляющее большинство веществ необходимо сделать видимыми по оканчании хроматографического разделения. Обнаружение осуществляют таким же образом, как и при бумажной, опрыскиванием хроматограммы соответствующим реагентом - обнаружителем. Ряд веществ обнаружить бае применения химических реагентов, например наблюдением хроматограммы в УФ – свете.

ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

Подвижность отдельных веществ характеризуется так называемой величиной Rf , представляющей собой отношение расстояния между центром пятна вещества и стартом(а) к расстоянию между фронтом растворителя и стартом (б). Величина изменяется в пределах от 0 до 1. Вещества на старте имеют Rf= 0.0; вещества в середине хроматограммы имеют Rf=0.5, а вещества на фронте растворителя- Rf=1.00. Величина Rf не является физической константой, если эксперимент не провидится в строго стандартных условиях. В большинстве случаев величина Rf характиризует только подвижность вещества и является величиной эффективности разделения данной хроматографической системы. Поскольку величина Rf данного вещества зависит от ряда факторов и от любого измененения условий экспиремента, более точную информацию дают относительные величины Rc , т.е.величины Rf, отнесенные к Rf стандартного соединения.

ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ЗНАЧЕНИЙ Rf.

Введение величины Rf позволило численно выразить положение пятна на хроматограмме. Большинство авторов не приписывают этой величине характер физической или физико – хмической константы и считают ее лишь приблизительными показателем относительного положения определяемого вещества в сравнении с положением остальных веществ, присутствующих в анализируемой смеси. При идентификации вещества посредством сравнения величин Rf определяемого соединения с Rf стендартного вещества достижение воспроизводимости разделения, а тем самым и воспроизводимости значений Rf приобретает большое значение.

На воспроизводимость этой величины при проведении тонкослойной хроматогафии влияет целый ряд факторов. Прежде всего система растворителей, форма и степень насыщения парами растворителя хроматографической камеры, активность хроматографических слоев, относительная влажность, длина пробега фронта растворителя, значение рН сорбента или системы растворителей.. На значение Rf сказывается также чистота растворителей, сотавляющих систему, толщина слоя, зернение сорбента, консистенция пасты при изготовлении пластинок, количество насенного образца и удаленность стартовой линии от нижнего края, глубина погружения нижнего края слоя и направление проявления.

ЗАПИСЬ РЕЗУЛЬТАТОВ РАЗДЕЛЕНИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ И ХРАНЕНИЕ ХРОМАТОГРАММ.

Часто возникает необходимость максимально точно запротоколировать результаты хроматографического разделения. Хранить хроматограммы трудно вследствие неустойчивости окраски пятен и малой механической прочности хроматогафического слоя.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ТСХ ДЛЯ АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ.

Местные анестетики.

Анестетическим действием обладают эфиры n-аминобензойной кислоты и n-оксибензойной кислоты. У некоторых местных анестетиков сложная эфирная связь заменена амидной (совкаин и кокаин)или в отдельных случаях кето-группой (фаликаин).

Сорбенты. Препараты этой группы разделяли на силикагеле, подщелоченным 0,5н NaOH, который замещал воду и обеспечивал щелочную реакцию.

Проводится разделение 16 местных анестетиков в 11 системах растворителей, сорбент Al₂O₃, без связующего. А также изучены закономерности разделения этих веществ в системе бензол-абсолютные низкомолекулярные спирты.

Система растворителей. Для разделения местных анестетиков на силикагель G, подщелоченным 0,5н NaOH пользовались нейтральными системами растворителей, а именно системой хлороформ-метанол (8:1), или циклогексан-хлороформ-метанол (5:3:1)(30:55:15).

Обнаружение. После разделения на сорбенте, к которому был прибавлен флуоресцирующий индикатор, местные анестетики обнаруживали в УФ=254нм. Вещества обнаруживались в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. Для идентификации пользовались раствором n-диметиламинобензальдегида, реактивом Драгендорфа, а также подкисленным раствором йода и йодида калия или парами йода.

Анестетики, содержащие фенольный гидроксил в молекуле обнаруживали реакцией с диазотированной сульфаниловой кислотой.

РАЗДЕЛЕНИЕ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ

Анестетики	С₁	С₂	С₃	С₄	С₅	С₆	С₇	С₈	С₉	С₁₀	С₁₁
Новокаин	0	14	31	52	65	27	34	43	60	54	11
Совкаин	10	19	46	65	75	42	51	47	75	61	20
Дикаин	17	34	65	75	82	57	67	60	80	70	30
Кокаин	8	15	40	63	72	40	43	56	59	58	20
Анестезин	18	25	48	н	н	53	52	62	70	75	31

С₁ –бензол С₆ – хлороформ

С₂- бензол этанол 98:2 С₇- хлороформ этанол 99:1

С₃- бензол этанол 95:5 с₈ –хлороформ n-бутанол 98:2

С₄ –бензол этанол 90:10 С₉ – хлороформ-ацетон 1:1

С₅ – бензол этанол 80:20 С₁₀- эфир

С₁₁ – эфир- петролейный эфир 1:1

Blog

Методическая разработка к лекции по теме: методические основы тонкослойной хроматографии

Содержание

литература

РАЗДЕЛЕНИЕ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ

Дикаин