Разработка биотехнологий получения иммобилизованных дрожжей и их применения в бродильных производствах 05. 18. 07 Биотехнология пищевых продуктов (пивобезалкогольная, спиртовая и винодельческая промышленности) 05.
| Вид материала | Автореферат |
- Интенсификация процесса брожения методом электронно-ионной обработки (эио) пивных дрожжей, 547.73kb.
- Методические рекомендации по выполнению лабораторного и научно-исследовательского практикума, 952.7kb.
- Учебно-методический комплекс дисциплины Молекулярная и промышленная биотехнология Специальность, 49.3kb.
- Учебное пособие по курсу "Биотехнология" для студентов фармацевтического факультета, 1364.67kb.
- Потребительское поведение на рынке функциональных пищевых продуктов приморского края, 71.92kb.
- Совершенствование биотехнологий высокоочищенной α-циклодекстринглюканотрансферазы, 372.26kb.
- Санкт-Петербургский Государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий, 55.14kb.
- Особенности использования иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности, 89.87kb.
- Совершенствование технологии производства природно-полусладких вин в условиях российской, 313.28kb.
- Микробиология пищевых продуктов специальность 111201 «Ветеринария» Пояснительная записка, 312.22kb.
На правах рукописи
СТЕПАНОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ
РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВАХ
05.18.07 Биотехнология пищевых продуктов (пивобезалкогольная, спиртовая и винодельческая промышленности)
05.18.10 Технология чая, табака и биологически активных веществ и субтропических культур
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва − 2007
Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московском государственном университете пищевых производств» и на кафедре «Химическая Энзимология» Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова
| Научные руководители: | доктор биологических наук, профессор Грачева Ирина Михайловна |
| | кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник Ефременко Елена Николаевна |
| Официальные оппоненты: | доктор технических наук, доцент Карпенко Дмитрий Валерьевич |
| | кандидат технических наук Морозов Анатолий Михайлович |
| Ведущая организация: | Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Россельхозакадемии |
Защита состоится «29» мая 2007 г. в 12 00 часов в ауд. III-101 на заседании Диссертационного Совета Д 212.148.04 при ГОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.
Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, ГОУ ВПО МГУПП, ученому секретарю Совета.
Автореферат разослан «27» апреля 2007 г.
| Ученый секретарь Диссертационного Совета, д.т.н., доц. | Крюкова Е.В. |
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Во всех отраслях пищевой промышленности все большее значение приобретает проблема снижения себестоимости выпускаемой продукции с сохранением ее высокого качества и конкурентоспособности на рынке. Эта же проблема затрагивает и винодельческое производство.
В России сегодня жесткие требования предъявляются к качеству вина, производимому внутри страны и импортируемому из-за рубежа. Разработка новых технологий виноделия при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объем производимой продукции при сохранении ее высокого качества является актуальным решением современных задач виноделия.
Согласно известным публикациям, применение иммобилизованных клеток дрожжей во многих отраслях виноделия может обеспечивать повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции (Taillandier, 1994; Саришвили, 1996; Fumi, 1998; Silva, 2002; Tsakiris, 2004). Иммобилизованные дрожжевые клетки отличаются от свободных клеток повышенной устойчивостью к различным неблагоприятным условиям ведения процесса и возможностью их применения для получения готового продукта с более высоким содержанием этанола, в том числе в режиме непрерывных технологий, а также позволяют существенно упростить отделение готового продукта от биомассы дрожжей.
Наибольшую популярность при разработке препаратов на основе иммобилизованных клеток дрожжей для виноделия в качестве носителя приобрел гель альгината кальция, несмотря на то, что его структура, как правило, характеризуется низкой механической прочностью в присутствии компонентов вина (фосфат-ионов и органических кислот). Кроме того, установлено, что в подобных гелевых системах массообменные процессы внутри массы геля существенно затруднены вследствие мелкопористой структуры матрицы, что неизменно приводит к постепенному отмиранию клеток во внутренних слоях гранул биокатализатора и снижению его продуктивности.
Другой наиболее широко распространенной проблемой в виноделии при использовании иммобилизованных препаратов является накопление свободных клеток в вине в процессе брожения, вызывающее помутнение готового продукта и ухудшение его качества. Существуют различные предложения по преодолению накопления свободных клеток в сбраживаемой среде (Klein, 1992, Divies, 1995, Yokotsuka, 1997), однако, одним из наиболее эффективных подходов к преодолению этой проблемы является использование новых носителей. Так, применение для этих целей криогеля поливинилового спирта (ПВС), обладающего макропористой структурой, высокими прочностными и массообменными характеристиками наряду с высокой химической стабильностью, представляется перспективным решением указанных проблем.
Криогели ПВС формируются в результате замораживания концентрированных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания (Лозинский, 2002). В основе образования криогеля лежит структурирование полимера за счет образования множественных водородных связей. Очевидно, что для клеток необходима оптимизация условий проведения криоиммобилизации и установление оптимального состава биокатализатора (концентрации клеток и полимера в грануле) для обеспечения высокой жизнеспособности и метаболической активности иммобилизованных клеток.
В связи с этим, актуальной представляется разработка новой технологии получения высокоэффективного иммобилизованного биокатализатора с использованием криогеля ПВС в качестве носителя, позволяющей свести к минимуму накопление свободных клеток в среде при высокой продуктивности и стабильности функционирования иммобилизованных клеток.
Исследование характеристик разработанного биокатализатора и условий его возможного применения в различных областях виноделия являются актуальными, так как направлены на повышение качества готового продукта при одновременном упрощении технологического процесса.
Целью данной работы являлась разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, и исследование его свойств при использовании в производстве различных спиртосодержащих напитков.
В ходе работы решались следующие основные задачи:
- выбор условий подготовки клеток дрожжей к криоиммобилизации на основе показателей метаболической активности клеток и их биохимических характеристик;
- оптимизация состава иммобилизованного биокатализатора по концентрации клеток и полимера, а также выбор условий формирования гранул биокатализатора;
- применение разработанного иммобилизованного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование его свойств (продуктивность, операционная стабильность и стабильность при хранении);
- определение и сравнение основных характеристик готовой продукции (концентрации спирта, сахара, органических кислот и ароматических веществ), производимой с использованием разработанного препарата иммобилизованных клеток и свободных клеток дрожжей;
- выяснение возможности применения разработанного биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для кислотопонижения вина, устранения винных недобродов и получения вина по красному и белому методам;
- оценка возможности использования разработанного иммобилизованного биокатализатора для получения биоэтанола из различных отходов сельского хозяйства и промышленности, в том числе и пищевой.
Научная новизна работы. Получен новый биокатализатор на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для получения спиртосодержащих напитков. Новизна разработки подтверждена заявкой на патент РФ на изобретение способа получения иммобилизованного биокатализатора для получения различных спиртосодержащих напитков (заявка № 2006113768, приоритет от 24.04.2006).
Показана важность выбора условий наращивания клеток для их иммобилизации в криогель ПВС. Установлено влияние концентрации клеток, носителя и условий формирования гранул биокатализатора на его конечные характеристики, в частности, пористость матрицы носителя и бродильную активность иммобилизованных клеток.
Впервые показана возможность и перспективность использования одного и того же разработанного метода для получения биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных штаммов дрожжей, в частности, для применения в технологиях получения различных спиртосодержащих напитков, а также для получения биоэтанола из гидролизатов различных отходов промышленности и сельскохозяйственных культур.
Практическая значимость работы. Разработанный биокатализатор перспективен, с точки зрения его эффективного использования для получения различных спиртосодержащих напитков вместо традиционно применяемых для этих целей свободных клеток дрожжей.
Установлена возможность многократного использования биокатализатора при шампанизации вина по классической технологии, что может способствовать усовершенствованию существующего биотехнологического процесса с технологической, экологической и экономической точек зрения. Разработан лабораторный технологический регламент на получение иммобилизованного биокатализатора для шампанизации вина.
Показано существенное улучшение ароматических характеристик красных, белых и игристых вин, приготовленных с применением иммобилизованных клеток, что было подтверждено высокими дегустационными оценками от экспертов производственной дегустационной комиссии отдела химии и биохимии вина Национального института винограда и вина «Магарач» (г. Ялта, АР Крым).
Показана возможность успешного применения дрожжевых клеток, иммобилизованных по разработанному способу, в технологии производства биоспирта из отходов пищевых производств с выходом более 90% от теоретически возможного.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих Международных конференциях и конгрессах: Межд. конференции «От фундаментальной науки – к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, Россия, 2002); XII (Vitoria, Spain, 2004), XIII (Kingston, Canada, 2005), XIV Intern. Workshop on Bioencapsulation (Lausanna, Switzerland, 2006); 2-ом (2003), 3-ем (2005), 4-ом Москов. Межд. конгрессах «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); Всерос. симпозиуме с межд. участием «Биотехнология микробов» (Москва, Россия, 2004); 9-ой и 10-ой Межд. пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006); Intern. Congress on Bioprocessing in Food Production (Patras, Greece, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, 4 статьи в сборниках статей международных конференций, 7 тезисов докладов на международных конференциях и конгрессах, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 175 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 265 ссылок, и приложения. Работа содержит 37 таблиц и 32 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экспериментальная часть
Объекты исследования. При проведении шампанизации вина в работе использовался штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Шампанская-39, при сбраживании виноградных соков по красному и белому методам использовали следующие штаммы дрожжей S. vini: Каберне-5, Массандра-3, Кокур-3, Ленинградская, Кислотопонижающая, 47-К. В экспериментах по устранению недобродов и биологическому кислотопонижению вина, а также для получения биоэтанола из отходов промышленности и сельского хозяйства использовались дрожжи S. cerevisiae phv bayanus. Все штаммы дрожжей были получены из коллекции Отраслевой Лаборатории Технологии Игристых вин ВНИИПБиВП (г. Москва) и коллекции микроорганизмов НИВиВ “Магарач” (г.Ялта, АР Крым, Украина).
Методы исследования. В работе для накопления биомассы клеток использовалась полусинтетическая среда (рН 5,6), спиртосодержащие среды на основе виноматериала (рН 3,0-7,0) и среда на основе солодового сусла (рН 5,2). Культивирование клеток осуществлялось при 15-30С в аэробных условиях при постоянном перемешивании (220 об/мин) на термостатируемой качалке IRC-1-U Adolf Kunner G Apparaebau (Швейцария).
Подсчет общего количества клеток дрожжей в образцах вина проводили в счетной камере Горяева, используя световой бинокулярный микроскоп XS 910 (Корея). Жизнеспособность и метаболическую активность иммобилизованных клеток контролировали, определяя концентрацию внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом, используя реагент фирмы «Люмтек» (Россия) и люминометр Microluminometr 3560 New Horizons Diagnostics Co (США). Получение биокатализатора на основе дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС (марка 16/1, «Аcros», Бельгия), осуществляли двумя методами: 1) в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН, согласно ранее известной методике (Мартыненко, 2004), используя криогрануляционную колонну, заполненную гидрофобной жидкостью; 2) суспензию клеток в растворе ПВС распределяли по различным формам, используя дозатор, и замораживали при –20оС в воздушной среде, выдерживали в замороженном состоянии 14÷18 ч, а затем размораживали при +2 ÷ +8оС.
Для шампанизации вина использовали белые сухие виноматериалы, которые смешивали с тиражным ликером для получения тиражной смеси с концентрацией сахарозы 22-24 г/л. Брожение проводили в шампанских бутылках объемом 0,375 л или флаконах для анаэробных культур объемом 15 мл в анаэробных условиях при 15С в течение 28-35 сут. Для получения белых столовых вин использовали виноградный сок с концентрацией сахаров 215 г/л, полученный из одной партии винограда сорта «Рислинг». Брожение проводили в специальных колбах с газоотводными трубками объемом 0,2 л при 20С в течение 12 сут. Для приготовления красных вин в работе использовали виноградный сок с концентрацией сахаров 270 г/л, приготовленный из одной партии винограда сортов «Каберне-Совиньон» и «Саперави». Брожение вели в анаэробных условиях при 25С в течение 20 сут. Для кислотопонижения использовали виноградный сок, приготовленный из винограда сорта «Рислинг», содержащего 8,42 г/л яблочной кислоты, а также крыжовниковый сок, содержащий 15,1 г/л яблочной кислоты. Процесс вели при 20оС в течение 7 сут. При проведении дображивания вина использовали виноматериал, содержащий 10,5 об. % и 13,5 об. % спирта. Брожение вели в течение 20 сут при 20оС.
Для измерения давления СО2 в бутылках с шампанским использовали афрометр. Определение жирнокислотного состава липидов дрожжевых клеток осуществляли методом газожидкостной хроматографии на приборе ЛХМ-8 МД. Для определения массовой концентрации кислот использовали метод прямого титрования. Определение массовой доли сернистой кислоты проводили методом йодометрического титрования. Определение органических кислот проводили методом жидкостной хроматографии на приборе «Цвет – 3006» с кондуктометрическим детектором. Определение концентрации различных сахаров проводили методом газожидкостной хроматографии на приборе «КОНТРОН» с ультрафиолетовым детектором. Для определения концентрации глюкозы в образцах вина использовали глюкозидазный метод с применением стандартного реагента фирмы «Импакт» (Россия). Определение спиртов проводили на газовом хроматографе «Цвет 3700» с пламенно-ионизационным детектором. Анализ ароматических веществ осуществляли с помощью масс-спектрометрии на приборе НР-5988 А (США) и газовой хроматографии, используя прибор HP-5710 (США) с пламенно-ионизационным детектором. Микрофотографии гранул криогеля ПВС, получали, используя сканирующий электронный микроскоп Jeol JSM-S300LV (Япония) и световой микроскоп Intel Play QX3 (США). Ферментативная обработка различных отходов промышленности и сельского хозяйства, использовавшихся для получения биоэтанола, проводилась на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.
При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях.
Результаты и их обсуждение
- Разработка способа получения иммобилизованного биокатализатора на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель ПВС для шампанизации вина, и исследование его свойств
Иммобилизация дрожжей в криогель ПВС, согласно известному способу (Рис. 1А), включает в себя стадии накопления биомассы до глубокой стационарной фазы роста (72ч) на виноматериале при 15оС, приготовление суспензии клеток в растворе полимера, ее замораживание в среде гидрофобной жидкости и размораживание гранул. Эти условия, как было установлено, негативно влияют на жизнеспособность иммобилизованных клеток. Полученный при этом биокатализатор (Рис. 1А) характеризуется бродильной активностью, существенно сниженной по сравнению со свободными клетками дрожжей, что приводит к необходимости дополнительной активации иммобилизованных клеток и последующей их обработки ауторегуляторным фактором d-1 (Батраков, 1993) для устранения активного почкования иммобилизованных клеток. В связи с этим в работе необходимо было подобрать такие условия подготовки и иммобилизации клеток дрожжей в криогель ПВС, при которых обеспечивалась бы максимальная жизнеспособность и метаболическая активность дрожжей в сформированном биокатализаторе.
1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации в криогель ПВС
Разработка технологии получения нового высокоэффективного биокатализатора состояла из нескольких стадий (Рис. 2).
На первой стадии была исследована кинетика роста клеток дрожжей на питательных средах разного состава и с разными значениями рН. Основное внимание при культивировании клеток, которое проводили в аэробных условиях при разной температуре, уделялось величине удельной скорости роста клеток и максимальному выходу биомассы (Табл. 1).
Таблица 1. Кинетические параметры, характеризующие рост дрожжевых клеток при различных условиях культивирования
| Температура | аСреда | μ, ч-1 | td, ч | Максимальное накопление биомассы, г/л |
| 150С | A | 0,11 ± 0,01 | 6,3±0,6 | 6,5 ± 0,3 |
| Б | 0,12 ± 0,02 | 5,8±0,8 | 6,6 ± 0,4 | |
| В | 0,10 ± 0,01 | 6,9±0,6 | 6,4 ± 0,3 | |
| Г | 0,14 ± 0,02 | 4,9±0,8 | 15,0 ± 0,5 | |
| 200С | A | 0,15 ± 0,02 | 4,60 ± 0,3 | 6,8 ± 0,2 |
| Б | 0,16 ± 0,03 | 4,30 ± 0,1 | 6,9 ± 0,3 | |
| В | 0,15 ± 0,02 | 4,60 ± 0,3 | 7,0 ± 0,2 | |
| Г | 0,18 ± 0,01 | 3,85 ± 0,2 | 15,4 ± 0,4 | |
| 300С | A | 0,22 ± 0,03 | 3,15 ± 0,2 | 6,8 ± 0,1 |
| Б | 0,19 ± 0,01 | 3,65 ± 0,3 | 7,0 ± 0,2 | |
| В | 0,22 ± 0,02 | 3,15 ± 0,2 | 7,1 ± 0,2 | |
| Г | 0,28 ± 0,01 | 2,50 ± 0,1 | 15,4 ± 0,3 |
а-Виноматериал с pH 3,0 (A), рН 5,0 (Б) и рН 7,0 (В); полусинтетическая среда pH 5,6 (Г).
-
А
Б