Geum.ru

Химико-фармакологическое исследование специфических органических веществ торфа 15. 00. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

Вид материалаИсследование

Содержание


Научный руководитель
Чучалин Владимир Сергеевич
Общая характеристика работы
Научная новизна
Практическая значимость.
На защиту выносятся положения
Апробация работы.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Структура и объем диссертации.
Содержание работы
Результаты исследования
Pinus sylvestris
Carex lasiocarpa
Качественное и количественное содержание БАВ торфа месторождения «Темное»
го47Название группы
Легкогидролизуемые вещества
Исследование химической структуры гуминовых кислот торфа месторождения «Темное»
Обоснование способа получения натрия гумата из торфа и оценка его фармакологической активности
Первый способ
Третий способ
...
Полное содержание
Подобный материал:

На правах рукописи


ФЕДЬКО ИРИНА ВАЛЕРЬЕВНА


ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ТОРФА


15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук


Томск – 2006


Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»


Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Дмитрук Степан Евгеньевич


Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Чучалин Владимир Сергеевич

кандидат фармацевтических наук, доцент Шкаренда Вадим Васильевич


Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»


Защита диссертации состоится «___ » декабря 2006 г в « ___ » ч.

на заседании диссертационного совета Д 208.096.04 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2


С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке

ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 107


Автореферат разослан «____» ноября 2006 г.



Ученый секретарь

диссертационного совета






Е.В. Ермилова



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В последнее время все больше внимания стало уделяться природным источникам биологически активных веществ (БАВ), так как они обладают низкой токсичностью и ограниченным спектром побочных эффектов. К таким природным источникам относится и торф.

Торф − перспективное сырье для получения препаратов, широко используемых в сельском хозяйстве, поскольку характеризуется высоким содержанием гумусовых веществ, которые обладают различными фармакологическими свойствами.

С точки зрения физико-химических позиций торф представляет собой болотное отложение из остатков отмершей растительности и является сложной полифракционной, полуколлоидно-высокомолекулярной, гидрофильной системой, с признаками полиэлектролитов и микромозаичной гетерогенности. Перечисленные признаки характеризуют торф с одной стороны, как сложную природную систему, с другой стороны, показывают широкие возможности, с точки зрения биологической активности, составляющих ее компонентов. Поэтому не случайно, что изучению химического состава торфа (гуминовым веществам, битумам, и т.д.) посвящено большое количество исследований, и значительно меньше внимания уделяется оценке фармакологической активности выделенных из торфа биологически активных веществ. Но именно широкомасштабный химико-фармакологический скрининг компонентов торфа может выявить наиболее интересные и перспективные из них для применения в медицине. Тем более, что в пользу торфа как уникального источника биологически активных веществ свидетельствуют и его огромные ресурсы. Так, только в Западной Сибири торфяные болота занимают 32 млн га, из которых 26% приходится на территорию Томской области. Этот факт определяет экономическую и технологическую целесообразность использования торфа в качестве сырья для широкого производства. Таким образом, проблема химико-фармакологического изучения торфа является весьма актуальной, имеющей большие перспективы для медицины.

Целью диссертационной работы является определение возможности использования специфических органических веществ торфа месторождения «Темное» Томской области в медицинской практике.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
  1. Провести анализ данных литературы о распространении, ресурсах, степени химической и фармакологической изученности торфа.
  2. Провести сравнительное химическое исследование торфа различных типов.
  3. Обосновать технологию выделения из торфа натрия гумата и оценить его фармакологическую активность.
  4. Разработать методики стандартизации и идентификации торфа, составить проект нормативной документации (проект ФС) на новый вид лекарственного сырья.
  5. Разработать способ получения лечебно-профилактического средства на основе натрия гумата.

Научная новизна: Впервые проведено сравнительное исследование химического состава и фармакологических свойств трех типов торфа месторождения «Темное» (низинного древесно-травяного, переходного осокового, верхового сосново-пушницевого) Томской области и выявлен оптимальный тип, который предложен в качестве источника гуминовых кислот. Разработан рациональный способ получения гуминовых кислот в виде водорастворимой соли – натрия гумата. Доказано, что натрия гумат относится к малотоксичным при внутрибрюшинном и практически нетоксичным веществам, при внутрижелудочном способах введения, он обладает антимикробными, противовоспалительными, ранозаживляющими свойствами. Впервые для фармацевтических целей предложены методики стандартизации торфа, разработан проект нормативной документации (ФС) на новый сырьевой источник. Разработан состав и технология получения мази на основе натрия гумата, выделенного из низинного древесно-травяного торфа.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований показана возможность использования низинного древесно-травяного торфа месторождения «Темное» Томской области в качестве сырьевого источника гуминовых кислот. Разработаны показатели и нормы качества сырья, его морфологические особенности и диагностические признаки, а также методики качественного и количественного определения в сырье гуминовых кислот. Разработана технологическая схема получения натрия гумата и установлены нормы его качества. Экспериментально обоснована возможность использования данной субстанции в медицинской практике и получение на ее основе лечебно-профилактического средства.

На защиту выносятся положения:

− результаты сравнительного анализа химического состава низинного древесно-травяного, переходного осокового и верхового сосново-пушницевого торфа Томской области;

− обоснование метода получения натрия гумата, выделенного из низинного древесно-травяного торфа и итоги результатов его фармакологического исследования;

− целесообразность использования лечебно-профилактического средства на основе натрия гумата в фармацевтической практике;

− методики идентификации и стандартизации нового сырьевого источника – низинного древесно-травяного торфа.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2004); Научной конференции «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (г. Барнаул, 2004); VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005); Международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии» (г. Минск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л.Н. Березнеговской (г. Томск, 2006), на заседаниях кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск, 2002–2006), а также на проблемной комиссии «Изыскание и изучение новых лекарственных средств. Вопросы фармации» (г. Томск, 2006).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ и комплексной целевой программой СО РАМН «Здоровье человека в Сибири» (номер государственной регистрации 01.85.0069848).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 2 журнальные статьи, 1 методическое пособие.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 31 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 137 источника литературы, в том числе 20 зарубежных.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методики исследования

В качестве объектов исследования использовали: образцы торфа низинного, переходного и верхового типа, заготовленные в 2002–2005 гг. на месторождении «Темное», расположенном на территории Томской области. Из исследуемых типов торфа для проведения химического исследования и оценки их фармакологических свойств получали извлечения, в качестве экстрагента использовали воду очищенную, 40 и 70%-й этанол, 0,1М раствор натрия гидроксида.

Для обнаружения, количественного определения и выделения БАВ в исследуемых объектах использовали различные качественные реакции, спектральные, хроматографические и другие общепринятые методы анализа.

Антигрибковые свойства натрия гумата, полученного различными способами, исследовали методом двухкратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро. Его антибактериальные свойства изучали методом дисков и методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Оценку антиоксидантной активности выделенного гумата проводили методом катодной вольтамперометрии, в качестве модельной реакции использовали процесс электровосстановления кислорода.

Ранозаживляющие свойства натрия гумата проводили на модели кожных экспериментальных ран, которые были вызваны путем отсечения лоскута с предварительно выстриженных участков спины крыс. В качестве контроля использовали "естественное заживление" раневой поверхности.

Противовоспалительное действие натрия гумата изучали на модели отека лапок крыс, вызванных медиаторами воспаления (гистамином, серотонином, брадикинином, простагландином и каррагенином). Степень депрессии отека оценивали в сравнении с ортофеном (10 мг на 1 кг массы тела).

Острую токсичность выделенного гумата определяли на крысах при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом с определением среднего арифметического значения (М) и ошибки среднего (m). Достоверность результатов оценивали параметрически по t-критерию Стьюдента. Кроме того, использовали пакет статистических программ «Statistica for Windows 7.0».


Результаты исследования


Исследование ботанического и химического состава торфа месторождения «Темное»


Оценка ботанического и группового состава торфа

Результаты изучения ботанического состава торфа трех типов позволяют определить что:

– верховой торф составляют остатки таких растений как Pinus sylvestris L., Carex lasiocarpa Ehrh., Eriophorum vaginatum L., Menyanthes trifoliate L., Sphagnum magellanicum Brid., Sphagnum angustifolium C. Jens., Chamaedaphne calyculata Moenh. и Andromeda polifolia L..

– ботанический состав переходного торфа определяют Betula pubescens Ehrh., Equisetum fluviatile L., Sphagnum fuscum Klingg., Sphagnum angustifolium C. Jens., Carex lasiocarpa Ehrh., Eriophorum vaginatum L., Sphagnum magellanicum Brid., Sphagnum balticum C. Jens., Chamaedaphne calyculata Moenh., Andromeda polifolia L. и Betula nana L..

– низинный торф состоит из растительных остатков Carex lasiocarpa Ehrh., Carex cespitosa L., Carex omskiana Meinsh., Menyanthes trifoliate L., Equisetum fluviatile L., Sphagnum centrale C. Jens и Веtula pubescens Ehrh..

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных, исследуемые образцы торфа отнесены нами к следующим группам: верховой торф – к группе сосново-пушницевых, переходный – к осоковым, низинный – к древесно-травяным.

По данным группового анализа, проведенного нами по методу Н.Н. Бамбалова, установлено содержание органических веществ (см.табл. 1).

Результаты анализа (табл.1) свидетельствуют, что количественное содержание органических веществ торфа, в т.ч. гуминовых кислот, битумов, лигнина и др. варьирует в широких пределах и зависит непосредственно от типа торфа.


Качественное и количественное содержание БАВ торфа месторождения «Темное»

На основании проведенных качественных реакций с определенной степенью достоверности можно заключить, что в низинном, переходном и

Таблица 1

Групповой состав органического вещества типов торфа

месторождения «Темное», (% на ОВ)

го47Название группы
Тип торфа

Низинный древесно-травяной
Переходный осоковый
Верховой сосново-пушницевый

Гуминовые вещества:

-гуминовые кислоты

-фульвокислоты
50,00  0,31

43,60  0,12

6,40  0,45
27,10  0,26

22,80  0,15

4,30 0,28
18,12  0,21

13,60  0,14

4,52  0,12

Легкогидролизуемые вещества
17,10  0,84
24,70  0,89
26,10  1,14

Трудногидролизуемые вещества (целлюлоза)
7,30  0,12
8,10  0,21
8,50  0,18

Негидролизуемый остаток (лигнин)
20,40  0,32
24,20  0,23
27,20  0,47

Битумы
5,20  0,23
15,90  0,33
20,08  0,36


верховом типе торфа присутствуют фенольные соединения (флавоноиды, дубильные вещества, фенолокислоты и кумарины), полисахариды и алкалоиды. Сапонины и антрагликозиды отсутствуют. Для установления количественных показателей основных групп БАВ в исследуемых типах торфа определено содержание соединений фенольной природы и полисахаридов. Результаты представлены в табл. 2.


Таблица 2

Количественное содержание биологически активных веществ в типах торфа месторождения «Темное», %



БАВ
Тип торфа

Низинный древесно-травяной
Переходный

осоковый
Верховой

сосново-пушницевый

Сумма фенольных соединений
1,400 ± 0,030
1,300 ± 0,040
1,120 ± 0,030

Флавоноиды
1,250 ± 0,020
1,120 ± 0,010
0,900 ± 0,020

Фенолокислоты
0,010 ± 0,001
0,010 ± 0,002
0,080 ± 0,010

Кумарины
0,090 ± 0,020
0,070 ± 0,010
0,070 ± 0,020

Водорастворимые полисахариды
14,320 ± 0,280
18,410 ± 0,210
19,820 ± 0,090


Как видно из приведенных в табл. 2 данных, количественное содержание БАВ варьирует в незначительных пределах, однако наблюдается закономерное увеличение содержания соединений фенольной природы от верхового сосново-пушицевого торфа ((1,120 ± 0,030) %) к низинному древесно-травяному ((1,400 ± 0,030) %). В тоже время, количественное содержание водорастворимых полисахаридов, напротив, увеличивается от низинного древесно-травяного типа торфа ((14,320 ± 0,280) %) к верховому сосново-пушицевому ((19,820 ± 0,090) %).

Таким образом, как показывают результаты выполненных исследований качественный состав и количественное содержание флавоноидов, фенолокислот, кумаринов и водорастворимых полисахаридов в образцах торфа варьируют в незначительных количествах.

Исключением из сказанного, являются гуминовые кислоты, по количественному содержанию которых ((43,60 ± 0,12) %) в низинном древесно-травяном, (22,80 ± 0,15) % в переходном осоковом и (13,60 ± 0,14) % в верховом сосново-пушицевом торфе), нами выделен низинный древесно-травяной тип ((43,60 ± 0,12) %).


Исследование химической структуры гуминовых кислот торфа месторождения «Темное»

Так как химическая структура гуминовых кислот торфа до настоящего времени полностью не определенна, нами была предпринята попытка, установить различия в функциональных группировках низинного, переходного и верхового торфа месторождения «Темное». В качестве метода сравнительного анализа использовали ИК-спектроскопию.

ИК-спектры гуминовых кислот записывались на ИК-Фурье-спектрофотометре «Vector-22» фирмы «Bruker» (Германия) в таблетках с KBr в соотношении 1:300 соответственно, в интервале значений частоты от 500 до 4000 см-1. ИК-спектры исследуемых типов торфа представлены на рис. 1–3.





Рис. 1. Инфракрасный спектр гуминовых кислот низинного

древесно-травяного торфа





Рис. 2. Инфракрасный спектр гуминовых кислот верхового

сосново-пушицевого торфа




Рис. 3. Инфракрасный спектр гуминовых кислот

переходного осокового торфа


Представленные на ИК-спектрах данные позволяют судить о наличии характерных полос при длинах волн 3500–3300 см-1 (гидроксилсодержащие соединения), 2920 см-1, 1460–1440 см-1, 2860 см-1 (метильные концевые группы), 1725–1700 см-1 (карбонилсодержащие соединения), 1625–1610 см-1, 1510–1500 см-1, 1390–1400 см-1 (бензольные структуры), 1250–1225 см-1 (С-О−эфирные), 1050–1150 см-1 (СО-углеводов) 700–900 см-1 (длинные метиленовые цепочки), а максимальная интенсивность полос поглощения в спектрах гуминовых кислот низинного, переходного и верхового типов торфа свидетельствует о наличии в указанном сырье карбонильных групп и ароматических фрагментов.

Количественную оценку содержания функциональных групп гуминовых кислот проводили на основании отношений оптических плотностей полос поглощения кислородсодержащих групп к оптическим плотностям, соответствующим ароматическим полисопряженным системам (1610 см-1) и алифатическим заместителям при 2920 см-1. Оценка количественного содержания функциональных групп исследуемых объектов (соотношение оптических плотностей полос поглощения) представлена в табл. 3.

На основании полученных результатов (табл. 3) можно говорить об однотипности и постоянстве функционального состава данных соединений.


Таблица 3

Соотношение оптических плотностей полос поглощения

гуминовых кислот торфа месторождения «Темное»

Тип торфа
ОН3400/

С=С1610
С=О1720/

С=С1610
Салк2920/

С=С1610
СО1225/

С=С1610
ОН3400/

Салк2920
С=О1720/

Салк2920
СО1225/

С=С2920

Верховой 

сосново-пушицевый
1,02
0,95
0,84
0,84
1,22
1,14
1,00

Переходный осоковый
1,04
0,86
0,81
0,82
1,28
1,12
1,02

Низинный древесно-травяной
1,06
0,83
0,77
0,80
1,37
1,07
1,04


Относительное количество гидроксильных групп (D3400/D1610) свидетельствует об их незначительно большем содержании в гуминовых кислотах низинного типа торфа. Карбоксильных же групп, напротив, в указанных кислотах верхового торфа больше, чем в данных кислотах низинного торфа. Кроме того, в макромолекулах гуминовых кислот карбоксильные группы преобладают над алкильными заместителями, отношение D1720/D2920 для всех образцов исследуемого торфа. Близкие значения отношений D1720/D2920 во всех образцах гуминовых кислот характеризуют их как структуры с подобной системой полисопряжения и системой Н-связей. Эти данные также подтверждаются практически одинаковыми значениями относительного содержания алифатических связей по отношению к ароматическим (D2920/D1610). При этом гуминовые кислоты верхового торфа являются более ароматичными по сравнению с указанными кислотами низинного торфа. Значительные различия наблюдаются также в спектральных коэффициентах, отображающих соотношение гидрофильной и гидрофобной составляющей в структурах гуминовых кислот торфа. Полученные данные показывают, что число кислородсодержащих групп всех типов выше числа алифатических С-Н-связей. Для гуминовых кислот верхового торфа спектральный коэффициент D3400/D2920 меньше, чем для гуминовых кислот низинного торфа. В целом, для всех исследуемых кислот низинного, переходного и верхового торфа процесс дегидратации макромолекул превалирует над процессом деалкилирования.

Таким образом, результаты, полученные методом ИК-спектроскопии доказывают, что основные характерные для гуминовых кислот максимумы поглощения обнаруживаются у всех исследуемых образцов. Однако наблюдаются и различия, выраженные, главным образом, в неодинаковой интенсивности, в уширении и сдвигах полос поглощения, что может быть связано с межмолекулярным взаимодействием в аморфных областях и с образованием комплексов. Также установлено, что в составе гуминовых кислот верхового торфа наблюдается больше карбоксильных и С-О-эфирных групп, тогда как в составе гуминовых кислот низинного торфа − большее содержание гидроксильных групп. Таким образом, гуминовые кислоты низинного древесно-травяного типа торфа содержат больше ароматических фрагментов и кислородсодержащих групп, что дает им возможность быть наиболее активными по сравнению с гуминовыми кислотам, выделенными из других типов торфа.

Исходя из полученных результатов, для дальнейшего исследования нами был выбран низинный древесно-травяной тип торфа, так как функциональный состав его гуминовых кислот предполагает наличие у них более выраженных фармакологических свойств по сравнению с гуминовыми кислотами, выделенными из других типов торфа.


Обоснование способа получения натрия гумата из торфа и оценка его фармакологической активности


Поскольку исследованием гуминовых кислот торфа на протяжении десятков лет интересуются многие авторы, то существует достаточно много вариантов выделения данной группы веществ. Нами по результатам анализа данных литературы за основу был выбран метод, в основе которого лежит экстракция торфа 0,1М раствора натрия гидроксида. С целью получения оптимального варианта указанного метода было изучено три способа выделения натрия гумата.

Первый способ позволяет получить комплекс гуминовых веществ, содержащий как гуминовые кислоты, так и более низкомолекулярную фракцию фульвокислот.

Второй способ получения позволяет выделять натрия гумат, очищенный от фракции более низкомолекулярных фульвокислот.

Третий способ заключается в получении натрия гумата с помощью ультразвука.

Преимущество одного из трех способов выделения натрия гумата определяли как по технологическим параметрам, так и по наличию фармакологической активности у выделенных субстанций. В качестве критериев оценки было использовано наличие антиоксидантных и антигрибковых свойств.

Результаты определения антиоксидантной активности представлены в табл. 4.

Таблица 4

Антиоксидантная активность натрия гумата в зависимости

от способа получения

Образец
С раб, г/мл
К, мкмоль/л мин
r
Sr

Комплекс гуминовых веществ
3,8*10-4
0,262
0,987
0,045

3,8*10-3
0,333
0,985
0,036

Натрия гумат, переосажденый 10%-й хлороводородной кислотой
3,8*10-4
0,407
0,979
0,043

3,8*10-3
0,599
0,981
0,032

Натрия гумат, полученный ультразвуковым методом
3,8*10-4
0,269
0,989
0,052

3,8*10-3
0,346
0,989
0,041

ДГКвер
3,85*10-4
0,589
0,989
0,032

1,92*10-3
0,781
0,987
0,038

АсКис
3,97*10-4
0,683
0,995
0,062

1,19*10-3
1,15
0,983
0,054

Примечание: С – концентрация препарата,

К – коэффициент антиоксидантной активности,

r – коэффициент корреляции,

Sr – относительное стандартное отклонение.


Как видно из приведенных данных (табл. 4), все три образца проявляли антиоксидантные свойства, относительно препаратов сравнения – аскорбиновой кислоты и дигидрокверцетина, однако наибольшая активность установлена у натрия гумата, полученного методом экстракции торфа 0,1М раствором натрия гидроксида и последующим переосаждением 10%-й хлороводородной кислотой, в данном случае коэффициент антиоксидантной активности составил 0,407 мкмоль/л мин.

Исследование антигрибковых свойств позволяет установить, что полученные тремя способами натрия гуматы, неактивны по отношению к Candida albicans и Aspergillus niger, в то же время в определенной степени задерживают рост Trychophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes и Microsporium canis, при этом натрия гумат, полученный экстракцией торфа с последующим переосаждением субстанции 10%-й хлороводородной кислотой, обладает активностью, сходной с препаратом сравнения нистатином (15,6–31,2 мкг/мл). Данный факт позволяет выделить его, как продукт, обладающий наибольшими антигрибковыми свойствами.


Оценка фармакологической активности и токсичности

натрия гумата


В результате выполненных фармакологических исследований по определению острой токсичности установлено, что при внутрибрюшинном введении натрия гумат относится к IV классу малотоксичных веществ и характеризуется как продукт с низкой токсичностью, а при введении его внутрижелудочно он относится к нетоксичным веществам. Кроме острой токсичности в числе фармакологических тестов были изучены антибактериальная, противовоспалительная и ранозаживляющая активности натрия гумата.

Антибактериальная активность. Указанная активность натрия гумата была изучена методом серийных разведений в жидкой питательной среде. В качестве тест-культур использовали стандартные штаммы: Staphylococcus aureus, Escherihia col, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. Полученные результаты позволяют говорить, что натрия гумат наиболее значительно подавляет рост Pseudomonas aeruginosa (15,6 мкг/мл) и Staphylococcus aureus (15,6 мкг/мл), чувствительность остальных микроорганизмов к данному препарату проявляется в значительно меньшей степени.

Противовоспалительные свойства. В качестве модели экспериментального воспаления использовали отек, вызываемый каррагенином, гистамином, серотонином, брадикинином и простагландином. Анализ полученных результатов позволяет констатировать, что натрия гумат в дозе 50 мг/кг подобно ортофену (10 мг/кг) угнетает воспаление лапок крыс, вызванное данными флогогенами, тем самым исследуемый объект обладает антигистаминым, антисеротониновым, антибрадикинининовым, антипростагландиновым эффектами.

Исследование влияния натрия гумата на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления, было выполнено на модели имплантации ватных тампонов в подкожную клетчатку крыс. Результаты исследования представлены в табл. 5.


Таблица 5

Влияние натрия гумата на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления (М ± m; n=6)

Препарат и доза
Масса экссудата, мг
Масса пролиферата, мг

Ортофен, 10 мг/кг


495,4 ± 40,5

p < 0,01
59,7 ± 9,3

p < 0,01

Натрия гумат, 50 мг/кг


510,0 ± 39,6

p < 0,02
64,6 ± 6,1

p < 0,01

Контроль (физ.раствор)
676,0±39,1
106,7±10,2

Примечание: p – сравнение с контрольной группой животных


Представленные в таблице результаты показывают, что натрия гумат в дозе 50 мг/кг статистически значимо угнетает экссудативную и пролиферативную фазы воспаления подобно препарату сравнения ортофену.

Ранозаживляющие свойства. Выявление репаративных свойств натрия гумата, проводили на 42 крысах. Кожные экспериментальные раны у животных вызывались путем отсечения лоскута с предварительно выстриженных участков спины. В качестве контроля исследовали "естественное заживление" ран, регистрирующееся на 1, 3, 7, 15 день. В эти сроки оценивали состояние ран, качество и зрелость грануляции, характер раневого отделяемого, сроки полной эпителизации. Исследование велось до полного заживления ран.

Полученные результаты представлены в табл.6.

Представленные результаты (см.табл. 6) дают основание считать, что натрия гумат проявляет выраженные ранозаживляющие свойства, о чем свидетельствует тот факт, что все исследуемые варианты введения и дозы натрия гумата статистически достоверно сокращали сроки заживления ран.


Стандартизация низинного древесно-травяного торфа


Исследование химического состава торфа и полученного на его основе натрия гумата, проявившего в эксперименте антимикробные, противовоспалительные и ранозаживляющие свойства позволили сформулировать подходы к стандартизации предложенного сырья. В результате выполненных исследований были разработаны и представлены в проекте ФС «Торф медицинский низинный» методики его качественного и количественного анализа, а также следующие числовые показатели, позволяющие оценить качество сырья: содержание гуминовых кислот – не менее 40 %, золы общей – не более 8 %, золы, нерастворимой в 10 %-м растворе кислоты хлороводородной – не более 1 %, органической примеси – не более 5 %, минеральной примеси – не более 0,5 %. Влажность сырья должна быть не более – 75%, степень разложения – не более 25 %.


Таблица 6

Влияние натрия гумата на изменение площади (S, мм2) экспериментальной раны в динамике (М ± m; n=6)

Группы

животных
Вводимый препарат, доза
Площадь раневой поверхности, см

1-е сут
3-и сут
7-е сут
15-е сут
Срок полного заживления, сут

1 контроль
–
168,4±20,0

p<0,01
143,6±15,4

p<0,01
92,7±9,8

p<0,01
31,2±2,7

p<0,01
24,5±1,4

p<0,01

2
Гумизоль, 0,01%-й р-р, 0,2 мл п/к
157,0±18,0

p<0,01
125,2±12,3

p<0,01
101,0±10,0

p<0,01
14,0±1,9

p<0,001
16,8±1,2

p<0,001

3
Торфот,

0,2 мл п/к
139,0±14,8

p<0,01
124,7±12,3

p<0,01
99,5±9,6

p<0,01
21,5±1,9

p<0,02
17,0±1,8

p<0,01

4
Натрия гумат, 5%-й р–р, местно
211,7±17,3

p<0,01
171,6±16,5

p<0,01
114,6±6,5

p<0,01
7,7±1,5

p<0,001
15,0±1,6

p<0,001

5
Натрия гумат, 1%-й р–р,

0,2 мл п/к
188,3±23,5

p<0,01
164,6±19,5

p<0,01
126,7±12,5

p<0,01
12,0±1,4

p<0,001
17,0±1,19

p<0,01

6
Натрия гумат, 2%-й р–р,

0,2 мл п/к
177,0±18,2

p<0,01
125,2±12,1

p<0,01
83,1±10,2

p<0,01
p для c2<0,01

100%
12,2±1,4

p<0,001

7
Натрия гумат, 5%-й р–р,

0,2 мл внутрь
162,3±18,9

p<0,01
122,5±13,5

p<0,01
101,16±9,0

p<0,05
11,8±1,7

p<0,001
17,9±1,8

p<0,05

Примечание: p – сравнение с контрольной группой животных


Разработка лечебно-профилактического средства

на основе натрия гумата и оценка его фармакологической активности

С учетом полученных результатов по химико-фармакологическому изучению торфа месторождения «Темное» была разработана технологическая схема получения натрия гумата. С этой целью была проведена экстракция торфа 0,1 М натрия гидроксидом, с последующим переосаждением полученного продукта 10%-й хлороводородной кислотой. Готовый продукт (натрия гумат), после высушивания методом конвективной сушки при температуре 28˚С, представляет собой сухой порошок темно-коричневого цвета, с характерным запахом.

На основе предложенной субстанции была разработана пропись 1, 3, 5 и 8%-х мазей. Компонентный состав предложенного средства в зависимости от концентрации натрия гумата представлен в табл. 7.

Влияние полученных вариантов мази на процессы репаративной регенерации кожи изучается под руководством профессора А.У. Зиганшина и Р.Р. Исматовой на базе Казанского государственного медицинского университета. Получены предварительные положительные результаты.


Таблица 7

Компонентный состав мази натрия гумата, в зависимости от его концентрации

Компоненты мази
Количественное содержание компонентов, г

1% мазь
3% мазь
5% мазь
8% мазь

Натрия гумат

1,00
3,00
5,00
8,00

Вода дистиллированная

5,00
5,00
5,00
8,00

Полиэтиленгликоль (ПЭГ400)

(ФС 42-1242-79)
67,00
65,00
63,00
57,00

Полиэтиленгликоль

(ПЭГ-1500)

(ФС 42-811-79)

25,00

25,00

25,00

25,00

Димексид

2,00
2,00
2,00
2,00



ВЫВОДЫ:
  1. Установлено, что из трех типов исследованного торфа месторождения «Темное», низинный древесно-травяной торф является перспективным для использования в медицинской практике так как, по результатам химического исследования, он характеризуется наибольшим содержанием гуминовых кислот ((43,6 ± 0,12) %), которые в свою очередь отличаются высоким содержанием ароматических фрагментов и кислородсодержащих групп, и тем самым обладают более ярко выраженными фармакологическими свойствами.
  2. Определен ботанический состав трех типов торфа, позволяющий отнести исследуемые образцы к следующим группам: верховой – к группе сосново-пушницевых, переходный – к осоковым, низинный – к древесно-травяным.
  3. В качестве способа получения натрия гумата из низинного древесно-травяного торфа рационально использовать экстракцию 0,1М натрия гидроксидом с последовательным осаждением субстанции 10%-й хлороводородной кислотой и растворением выделенных гуминовых кислот в 0,1М натрия гидроксиде. Выход готового продукта при данном способе составляет (43,75 ± 0,21) %.
  4. Установлено, что натрия гумат при внутрибрюшинном введении относится к IV классу малотоксичных веществ и характеризуется как продукт с низкой токсичностью (ЛД50 = 348мг/кг), а при введении его внутрижелудочно относится к нетоксичным веществам (в дозе 2000 мг/кг не вызывает смерти животных).
  5. Экспериментальные исследования показали, что натрия гумат на фоне препаратов сравнения (нистатин, нитрофунгин, ортофен) обладает выраженными антибактериальными, антигрибковыми, ранозаживляющими и противовоспалительными свойствами.
  6. Разработаны методики качественного обнаружения (методом ИК-спектроскопи) и количественного определения (гравиметрическим методом) гуминовых кислот низинного древесно-травяного торфа, внесенные в проект ФС «Торф медицинский низинный».
  7. На основании выполненных исследований обоснованы товароведческие показатели, внесенные в проект фармакопейной статьи «Торф медицинский низинный», позволяющие оценивать качество сырья: содержание гуминовых кислот – не менее 40 %, золы общей – не более 8 %, золы, нерастворимой в 10 %-м растворе кислоты хлороводородной – не более 1 %, органической примеси – не более 5 %, минеральной примеси – не более 0,5 %; влажность сырья должна быть – не более 75 %, степень разложения – не более 25 % .
  8. Предложен состав и технологическая схема получения лечебно-профилактического средства в виде мази на основе натрия гумата.


ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
    1. Оценка возможности применения торфяных ресурсов Томской области для производства новых лекарственных препаратов антигрибкового действия // Сб. статей «Информационные системы мониторинга окружающей среды». - Томск, 2003. - Выпуск 2. - С. 56–59 (Соавт. С.Н. Ефимов, Е.О. Писниченко).
    2. Торф как возможный источник для получения новых противогрибковых препаратов // Сб. научных работ «Актуальные проблемы медицины». - Том №3. - Томск, 2004. - С. 289–290. (Соавт. С.Н. Ефимов, Е.О. Писниченко, М.В. Гостищева).
    3. Перспектива использование биологически активных гуминовых комплексов торфов Томской области в медицине // Сб. статей по материалам конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2004. - С. 367.
    4. Перспектива использования торфяных ресурсов Томской области для производства новых лекарственных препаратов антигрибкового действия // Сб. научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». – Вып. 59. - Пятигорск, 2004. – С. 326–327. (Соавт. С.Н. Ефимов, Е.О. Писниченко, М.В. Гостищева).
    5. Перспективы использования гуминовых комплексов торфов в медицине // Сб. научных трудов «Лекарственные растения в фармакологии и медицине». - Барнаул, 2004. - С. 283–285. (Соавт. Е.О. Писниченко, М.В. Гостищева).
    6. Химико-фармакологическое исследование гуминовых комплексов торфов Западной Сибири // Сб. статей «Информационные системы мониторинга окружающей среды». – Вып. 3. - Томск, 2004. - С. 54–57. (Соавт. М.В. Гостищева, Е.О. Писниченко).
    7. Сравнительная характеристика методов выделения гуминовых кислот из торфов с целью получения гуминовых препаратов // Доклады Томского государственного университета систем управления и радиоэлектроники. Сб. статей. - Томск, 2004. -С. 66–68. (Соавт. М.В. Гостищева, Е.О. Писниченко).
    8. Изучение антиоксидантных свойств торфов Томской области // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере», Санкт-Петербург, 2004. - С. 120–121 (Соавт. М.В. Гостищева, Е.О. Писниченко).
    9. Противогрибковая активность гуминовых веществ торфов // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере», Санкт-Петербург, 2004. - С. 97–98. (Соавт. М.В. Гостищева).
    10. Исследование антиоксидантной активности гуминовых комплексов торфа //

Сб. статей по материалам конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2005. - С. 101–102. (Соавт. М.В. Гостищева).

11. Исследование специфических веществ торфов // Сб. статей по материалам Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации». - Новосибирск, 2005. - С. 420–421. (Соавт. М.В. Гостищева).

12. Медицинские аспекты использования биологически активных гуминовых комплексов // Химия растительного сырья. - 2005. № 1. – С. 49–52. (Савт. М.В. Гостищева, Р.Р. Исматова).

13. Антиоксидантная активность торфов западной Сибири // Тезисы докладов Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». - Москва, 2006. - С. 88–89. (Соавт. М.В. Гостищева, М.Н. Солдаткина).

14. Экспериментальное изучение ранозаживляющего действия гумата натрия из торфа Томской области // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л.Н. Березнеговской. - Томск, 2006. - С. 135–137. (Соавт. Р.Р. Исматова, А.У. Зиганшин, С.Е. Дмитрук).

15. Оценка молекулярных параметров гуминовых кислот торфов, полученных разными способами // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Л.Н. Березнеговской. - Томск, 2006. - С. 71–74. (Соавт. М.В. Гостищева, А.И. Щеголихина).

16. Фармацевтическая оценка свойств гуминовых веществ торфов, полученных различными способами // Материалы международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». - Минск, 2006. – С. 249–251. (Савт. М.В. Гостищева, Р.Р. Исматова).

17. Исследование химических и биологических свойств гуминовых кислот торфов различного происхождения // Материалы международной конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». - Минск, 2006. – С.181-184 (Соавт. М.В. Гостищева, Л.И. Инишева).

18. Оценка токсичности и противовоспалительной активности гуматов, выделенных из торфа и сапропеля Томской области // Казанский медицинский журнал. - Казань. - 2006. -№ 6. С. 412–413. (Соавт. Р.Р. Исматова, А.У. Зиганшин, С.Е. Дмитрук).

19. Фармацевтические аспекты использования торфа // Методическое пособие. - Томск, 2006. – 20 с. (Соавт. М.В. Гостищева).


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АсКис – аскорбиновая кислота

БАВ – биологически активные вещества

ГК – гуминовые кислоты

ГФ – государственная фармакопея

ДГКвер – дегидрокверцитин

ОВ – органическое вещество

ФС – фармакопейная статья