Geum.ru

Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материалаПрограмма

Содержание


Молекулярный полиморфизм ферментов человека
Изучение биохимического полиморфизма сн-домен содержащих и других актин-связывающих белков
Подобный материал:
1   ...   61   62   63   64   65   66   67   68   ...   74




МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ФЕРМЕНТОВ ЧЕЛОВЕКА




И.Н. Курочкин1,2), В.С. Курова1), Г.В. Дубачёва2), М.В. Порус2), А.В.Немухин1,2)




1) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
2)Химический факультет Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова



Объектом исследования данного проекта являются ферменты человека, сигнальные белки и их молекулярное разнообразие. Важнейшей задачей настоящего этапа выполнения проекта является разработка унифицированных платформ анализа ферментативных активностей в биологических жидкостях. Были исследованы возможности трех типов аналитических платформ: электрохимической, масс-спектрометрической и платформы, основанной на использовании гигантских нелинейных оптических эффектов на поверхности наночастиц металлов (SERS).

Для электрохимической платформы была показана возможность одновременной регистрации нескольких ферментативных реакций и выделения вкладов отдельных ферментов на основе анализа кинетических кривых накопления продуктов. Так, в частности, разработан метод одновременного количественного определения ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы в смеси, основанный на использовании двухэлектродной сенсорной системы, состоящей из холиноксидазного и тирозиназного биосенсоров. Разработанная система позволяет за короткое время определять содержания этих трёх ферментов со средней ошибкой 8 %. Методы протеомного анализа на основе масс-спектрометрии позволяют идентифицировать белки даже в таких сложных объектах, как конденсаты выдыхаемого воздуха человека (КВВ). Несмотря на ультранизкие концентрации белка (<1 мкг/мл) и сложный состав конденсата, для каждого образца здорового донора удалось идентифицировать масс-спектры 10-20 белков. Исследование КВВ шести здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет показало, что мажорными белками в образце являются клеточные кератины. Инвариантными для всех проб являются пары цитоскелетных кератинов 1/10 и 2/9. Мутаций в последовательностях этих белков у здоровых доноров выявлено не было. Качественный состав других кератинов существенно отличается для каждого индивидуального образца. В некоторых конденсатах присутствуют почти все пары (4/13, 5/14, 6/15, 6/16, 8/18), а также независимые кератины внутреннего эпителия (7, 20) и кожи (17, 19). В других же обнаружены лишь одна или две таких пары, а также неполные пары, представленные либо кислотной компонентой (кератины типа I), либо основной компонентой (кератины типа II). Особый интерес представляют пептидные фрагменты, идентифицирующие изоформы кератинов разных типов. Например, в индивидуальных образцах найдены кератины 1В (кератин 77), кератин 28, а также несколько изоформ кератина 6 (6 F, 6B, 6 irs 3).

Проведен анализ возможностей использования метода SERS для высокопроизводительного анализа ферментативных активностей в биологических жидкостях. На основе проведенного анализа и данных современной литературы сделан вывод об исключительной перспективности метода SERS для целей изучения молекулярного полиморфизма ферментов. Были продолжены работы по развитию математических методов обработки генетической и протеомной информации. Пополнена компьютерная база, обобщающая собственные и литературные данные, являющиеся основой разработки теоретических представлений о значимости выявленных изменений ДНК и ферментов для физиологического и медицинского статуса человека.

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА СН-ДОМЕН СОДЕРЖАЩИХ И ДРУГИХ АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

ПРИ РАКЕ ПРОСТАТЫ

В.О.Попов1), С.С.Шишкин1), Л.И.Ковалев1), И.Н.Крахмалева1), Л.С.Еремина1), К.В.Лисицкая1), О.С.Соколова2), И.Ю.Торопыгин3), Н.К.Дзеранов4), М.А.Ковалева1), К.И.Тотров4), И.В.Кононков5),О.Б.Лоран5)




1)Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва;
2)Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва;
3)НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва;
4)НИИ урологии Росмедтехнологий, Москва;
5)Российская медицинская академия постдипломного образования, Москва


Использование разных подходов для комплексного изучения полиморфизма актин-связывающих белков (АСБ) и, в частности, АСБ, содержащих так называемые СН-домены, представляет значительный интерес для выяснения особенностей состояния клеточного цитоскелета и его изменений при опухолевой трансформации. В соответствии с целями проекта, направленного на обеспечение разработки методов эффективной диагностики рака простаты (РП), был проведен сравнительный анализ биопсийных и/или операционных материалов при раке и гиперплазии простаты с помощью двумерного электрофореза по по О’Фарреллу и при использовании компьютерного анализа результатов, а также MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации белков. Полученные результаты позволили построить синтетическую двумерную карту и на ее основе сформировать (с использованием программы Firefox 2 и ряда программных средств из набора Microsoft Office) компьютерную базу данных о «мажорных» белках тканей простаты человека с РП, в которую включили 64 белковые фракции. Общее число идентифицированных белков превысило 80 и среди них выявлено несколько изоформ СН-домен содержащих АСБ, а также некоторых других АСБ, в частности, изоформа 1 аннексина 2, один из вариантов изоформы 2 аннексина 2 и две дополнительные изоформы трансгелиновых белков (4301690, 4330625). В структуре 16 из идентифицированных белков обнаружены так называемые «конфликтные» определения аминокислотных остатков, что в некоторых случаях является проявлениями белкового полиморфизма.

Для обеспечения исследований сформирована также база данных, содержащая личностную информацию и результаты генотипирования в сочетании с некоторыми медицинскими или физиологическими характеристиками пациентов с опухолевыми заболеваниями простаты (рак или гиперплазии) и лиц контрольных групп (n400). Собрано несколько ДНК-коллекций и разработана система кодирования, что позволяет эффективно использовать имеющиеся материалы для разработок новых методов диагностики и определения групп риска возникновения РП при гарантированной конфиденциальности. На образцах ДНК из этих коллекций с помощью специальной модификации ПЦР в реальном времени (Taqman-анализ для дискриминации аллелей) было проведено сравнительное изучение встречаемости аллелей двух известных SNP’s (rs 11072170 – T/C, ведущего к аминокислотной замене 239 E/G, и rs 2306277 – C/T с заменой 463 P/L) в гене FMN1, который кодирует АСБ формин. Параллельно был проведен анализ еще одного SNP (1630 А/C) в гене GHR, который обеспечивает синтез рецептора гормона роста – принципиально значимого участника гормональной системы регуляции клеточной пролиферации. Результаты показали существенные различия между проанализированными выборками, например, у больных РП соотношение TT, TC и СС для SNP rs 11072170 оказались: 4,8, 33,3 % и 61,9 %, тогда как в контрольной группе: 16,6, 58,3 % и 25,6 % соответственно. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования генотипирования по определенным SNP’s для формирования групп риска РП.

Работа поддержана Программой Президиума РАН «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ» и ОАО МКНТ, проект «Исследования молекулярных нарушений при раке простаты для разработки эффективных методов диагностики».