Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Содержание

Технология функционального анализа инсерционного полиморфизма ретроэлементов и ее применение
Ю.Б.Лебедев, И.З.Мамедов, А.Л.Амосова, С.В.Устюгова
Анализ гаплогрупп y хромосомы у народов евразии и молекулярно-генетическое исследование ряда наследственно обусловленных заболев
Э.К. Хуснутдинова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа
PCOL1*D и генотип PCOL1*I*D
Исследование молекулярного полиморфизма протеома мочи человека новым методом точной массовой метки с использованием масс-спектро

Подобный материал:

1 ... 60 61 62 63 64 65 66 67 ... 74

ТЕХНОЛОГИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО АНАЛИЗА ИНСЕРЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Ю.Б.Лебедев¹⁾, И.З.Мамедов¹⁾, А.Л.Амосова¹⁾, С.В.Устюгова¹⁾

¹⁾Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина

и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва

Современные данные сравнительной геномики подтверждают, что ретроэлементы (РЭ) составляют структурный каркас секвенированных геномов млекопитающих. По существующим оценкам десятки тысяч копий Alu и L1 повторов видоспецифичны, а приблизительно половина из них могут представлять инсерционные РЭ полиморфизмы человека. Согласно общепринятой к настоящему времени гипотезе, амплификация РЭ является одним из существенных движущих факторов молекулярной эволюции, а инсерционный полиморфизм РЭ представляет богатый источник вариабельности генома человека. В том числе широко обсуждается возможная связь РЭ полиморфизмов с развитием опухолевых, аутоиммунных и некоторых других мультигенных заболеваний человека. Наряду с изучением структурной вариабельности генома человека, еще более остро стоит проблема определения функциональной роли РЭ в развитии патогенных состояний. Одним из возможных путей ее решения признано выявление активируемых копий РЭ, способных изменять уровень и специфичность экспрессии окружающих генов человека.

Авторами настоящего проекта разработана оригинальная технология, направленная на полногеномную идентификацию и определение модуля-ций транскрипции аллельных вариантов генов человека, связанных с от-дельными типами онкологических или аутоиммунных заболеваний. В хо-де выполнения проекта в 2007 году нами была продолжена экспери-ментальная идентификация РЭ полиморфизмов в серии выборок индиви-дуальных геномных ДНК, среди которых были проанализированы этни-чески разнородная выборка из 60 здоровых доноров, пулированные ДНК из 37 образцов рака молочной железы и 16 образцов Т-клеточных лим-фом. Открыто около 80 новых РЭ полиморфизмов и созданы соответ-ствующие молекулярно-генетические маркеры. Результаты эксперимен-тального и биоинформатического анализа суммированы в интерактивной базе данных инсерционных РЭ полиморфизмов генома человека, размещенной на портале ИБХ РАН (ссылка скрыта). База данных содержит характеристики свыше 1,5 тысяч диморфных инсерций Alu, LINE1P и HERV-K LTR элементов, около 30 % которых локализованы в интронных или регуляторных областях известных и кандидатных генов человека. Функциональному анализу интронных РЭ полиморфизмов посвящена вторая часть проводимых нами исследований. В качестве основного подхода используется оригинальный метод срав-нительного анализа уровня и специфичности транскрипции аллельных пар генов, отличающихся по интронным инсерциям ретроэлементов. На предыдущем этапе проекта при анализе гетерозиготных опухолевых клее-точных линий нами был выявлен ингибирующий эффект полиморфных AluYa5/b8 и L1Hs инсерций на транскрипционную активность соответствующих аллелей. К настоящему времени ингибирующий эффект показан для 26 генов различных функциональных групп и продолжается увеличиваться число анализируемых локусов генома. Изучение возможных механизмов обнаружило, что присутствие интронного ретроэлемента способно приводить к преждевременной остановке транскрипции РЭ-содержащего аллеля или изменению спектра ядерных белков, связывающихся с РЭ-содержащим аллелем по сравнению с предковым. Результаты сравнительного анализа транскрипции аллельных пар как в клеточных линиях, так и в клетках лимфоцитарной фракции крови показали явно выраженный тканеспецифический характер степени проявления и механизмов ингибирующего воздействия полиморфных РЭ на экспрессию генов человека.

АНАЛИЗ ГАПЛОГРУПП Y ХРОМОСОМЫ У НАРОДОВ ЕВРАЗИИ

И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЯДА НАСЛЕДСТВЕННО ОБУСЛОВЛЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Э.К. Хуснутдинова, И.М. Хидиятова, А.С. Карунас, Р.И. Хусаинова, В.Л.Ахметова, М.А. Бермишева, И.Р. Гилязова, А.В. Казанцева, Т.Г.Носкова, Г.Г. Фасхутдинова, Ю.В. Федорова, А.Х. Хузина, Л.И.Селезнева, Э.С.Галимова, А.С. Лобов, Б.Б. Юнусбаев, И.А. Кутуев

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа

Проведен анализ 43 биаллельных маркеров нерекомбинирующего участка Y хромосомы в 37 популяциях Евразии. Выявлена значительная генетическая дифференциация популяций по данным частот гаплогрупп Y хромосомы, что объясняется феноменом патрилокальности. Геногеографический анализ свидетельствует о значительном циркум-полярном потоке генов в направлении с востока на запад на территории Северной Евразии. Проведено изучение 22 генов-кандидатов 8 широко распространенных наследственно обусловленных заболеваний с учетом этнической принадлежности больных.

Обнаружена ассоциация алкогольного психоза с генотипом ADH1B*С/*Т у русских (OR=4.15) и татар (OR=4.64), гаплотипом ADH1B*Arg*T локуса RsaI гена алкогольдегидрагеназы 1В (ADH1B) у русских (OR=1.60), с генотипом ADH1C*G/*Т локуса EcoRI гена (ADH1C) у башкир (OR=2.21), гаплотипом ADH1С*G*G*A полиморфных маркеров EcoRI, HaeIII и Ile349Val в гене ADH1С (OR = 2.20) у башкир.

Маркерами повышенного риска униполярной депрессии являются генотип TPH1*A/*A (OR=1.61) и аллель TPH1*A (OR=1.31) полиморфизма A6526G гена TPH1, генотип MTHFR*T/*T (OR=2.03) и аллель MTHFR*T (OR=1.35) полиморфного локуса C667T гена MTHFR, генотип HTR1A*C/*C (OR=1.67) полиморфного локуса гена HTR1A.

Установлено, что маркерами повышенного риска развития псориаза являются аллель Сw*6 (OR=3.5) и генотип Сw*6/Сw*6 гена HLA-C (OR=2.4), аллели 325*Т (OR=3.76), 1723*Т (OR=4.95), 1911*G (OR=1.74), 2327*G (OR=2.65) и генотипы 1911*G/1911*G (OR=1.69), 325*Т/*Т (OR=5.91), 2327*G/*G (OR=4.34) гена HCR, а также гаплотип HLACw*6/HCR*325Т/HCR*1911G/CDSN*1243С. Аллель 1243*С (OR=2.14) и генотип 1243*C/*C гена корнеодесмозина CDSN ассоциирован с псориазом у русских (OR=2.26).

Установлено, что мутации CHEK2dele9,10(5kb) (OR=20.8) и IVS2+1G>A гена CHEK2, генотипа *Arg⁷²/*Рro⁷² гена опухолевого супрессора (ТР53) являются маркерами высокого риска развития рака молочной железы (р<0,05, OR=1.8).

Обнаружено, что аллель «медленного ацетилирования» NAT2*S3 локуса c.857G>A ассоциирован c возрастом манифестации болезни Паркинсона (БП) от 40 до 60 лет (OR=2.2), генотип NAT2*S2/*S2 и аллель NAT2*S2 локуса c.590G>A являются генетическими маркерами риска развития БП у татар (OR=2.46), а также генотип NAT2*S2/*S2 ассоциирован с тяжелой стадией БП (OR=3.24). Генотип *6/*8 гена THO1 является генетическим маркером риска в общей выборке больных (OR=2.79), при акинетико-ригидной форме (OR=4.75), а также при 3-й (OR=3.12) и 4-й (OR=3.04) степенях тяжести БП. Показано, что маркерами повышенного риска бронхиальной астмы являются генотипы IL1B*3953С/*С (OR=1.58) локуса 3953C>T гена интерлейкина 1, GSTM1*0/*0 (OR=1.27) гена детоксикации ксенобиотиков GSTM1.

Проведенный анализ ассоциации промоторного полиморфизма –590C>T гена интерлейкина-4 и двух полиморфных вариантов Ile50Val и Gln576Arg гена α-цепи рецептора интерлейкина-4 с аллергическим ринитом выявил, что аллель IL4Rα*Val50 является маркером повышенного риска развития аллергического ринита у татар (OR=1.9).

Аллель PCOL1*D и генотип PCOL1*I*D гена коллагена 1 типа (COL1A1) и гаплотип PCOL2*G/PCOL1*D/SpI*s (р=0,04; β=2,02) являются факторами повышенного риска развития переломов у русских. Генотип CALCA*10*10 гена кальцитонина (CALCA) ассоциирован с повышенными показателями МПКТ поясничных позвонков у женщин русской этнической принадлежности (F=4,033; р=0,019), генотип CALCA*17*17 ассоциирован с низкими показателями МПКТ у татар (F=4,502; p=0,021).

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ПРОТЕОМА МОЧИ ЧЕЛОВЕКА НОВЫМ МЕТОДОМ ТОЧНОЙ МАССОВОЙ МЕТКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ИОННОГО ЦИКЛОТРОННОГО РЕЗОНАНСА

Е.Н.Николаев ^{1, 2}, А.С.Кононихин ^{1, 2}, В.Г.Згода ³, С.А.Мошковский ³, О.Н.Харыбин ^{2, 3}, И.А.Попов ^{1, 2}, Д.М.Автономов ^{1, 2}, И.А.Агрон ³, В.С.Курова ¹, С.Д.Варфоломеев ¹

¹ Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

² Институт энергетических проблем химической физики РАН

³ Институт биомедицинской химии РАМН

Протеомика занимается систематическим исследованием белков с целью получения информации по их структуре и функциям в биологических системах. Протеом представляет собой набор белков, присутствующих в клетке, ткани или жидкости тела в данный момент времени, в данной среде, в данном физиологическом или патологическом контексте. Протеомные исследования требуют проведения анализа большого количества образцов в различных физиологических условиях и в разных средах. Динамическая природа протеома является основной трудностью в протеомном анализе и необходимы мощные аналитические методы для обнаружения изменений в картине протеома и соотнесения наблюдаемых изменений с физико-патологическим состоянием исследу-емого объекта. Недавно было показано, что если масса пептида может быть измерена с точностью, достаточной для его однозначной иденти-фикации среди всех пептидов, предсказанных по данной геномной последовательности, то она (масса) может служить биомаркером для определения исходного белка. Требуемая точность измерений (одна миллионная доля измеряемой массы) достигается при помощи масс спектрометрии ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR), как было показано в прошлых работах лаборатории. Это делает возможным применение высокопроизводительных количественных методов с применением хромато-масс-спектрометрии. Развиваемый нами метод точной массовой метки – времени элюции основан на двухстадий-ном подходе, использующим жидкостную хроматографию и масс- спектрометрию ионного циклотронного резонанса. Разработаны альтернативные стандартному методу приготовления биологических жидкостей для анализа с целью увеличения количества детектируемых белков включающие фильтрацию, избавление от альбумина и введение ингибитора протеаз. Разработаны методы трипсинолиза белковых смесей образцов мочи с мечением изотопом ¹⁸О. Также разработаны методы нормирования хроматограмм пептидов-продуктов трипсинолиза белковых смесей для унификации времен элюции пептидов из хроматографической колонки и сформулированы рекомендации по подбору внутренних стандартов. Проведено дальнейшее совершенствование методов ионизации пептидов с целью достижения высокой чувствительности при масс-спектрометрическом анализе путем использования самодельных хроматографических колонок комбинированных с электроспрейными эмиттерами. Проведены серии хромато-масс-спектрометрического анализа белковых смесей из мочи отдельных доноров и пула мочи от многих доноров при разных способах приготовления образцов. Выявлены сильные влияния на протеомный состав образцов как методов приготовления, так и индивидуальных различий доноров. Был опробован метод MRM (multiple reaction monitoring) с целью повышения динамического диапазона аналитической платформы и чувствительности путем измерения продуктов диссоциации только специфичных для интересующего белка пептидов, выбранных методами биоинформатики. Показано, что его применение может поднять чувствительность детектирования пептидов более чем на порядок величины. Проведено дальнейшее совершенствование методов фрагментации пептидов при MS/MS анализе с использованием столкновительной диссоциации, многофотонной лазерной диссоциации и диссоциации при захвате медленных электронов. Созданы протоколы выбора параметров процессов столкновительной диссоциации, многофотонной лазерной диссоциации и диссоциации при захвате медленных электронов для получения наиболее полной и информативной фрагментации при использовании этих трех методов фрагментации. Усовершенствована разработанная в лаборатории программа выявления и характеризации посттрансляционных модификаций и проведен поиск посттрансляцион-ных модификаций белков мочи с ее помощью

Связь полиморфизма определенных генов

с психическими свойствами человека: агрессивность, восприятие времени

О.В.Сысоева¹, Г.В.Портнова¹, Н.В.Малюченко ², М.А.Тимофеева ², М.А.Куликова ², А.Г.Тоневицкий ², А.М.Иваницкий ¹

¹Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия

²Биологический факультет МГУ им. Ломоносова

Дополнительные исследования группы девушек-неспортсменок под-твердили данные о связи полиморфизма гена 5-HTT c опосредованно-стью выражения агрессивности у женщин (опросник Басса-Дарки), полученные в прошлом году на спортсменках синхронного плавания: косвенная агрессия увеличивается, а негативизм уменьшается у лиц с коротким аллелем (SS), по сравнению с другими группами (SL, LL). Сопоставление группы синхронисток и неспорсменок позволило оценить взаимовлияние спортивной среды и генетического полиморфизма на различные аспекты агрессивности. Было показано, что спортсменки синхронного плавания обладали более низкими значениями по физической агрессивности, негативизму и вербальной агрессии, по сравнению с контрольной группой, уравненной по возрасту. Эта зависимость прослеживалась как внутри каждого генотипа, так и для группы в целом. Можно предположить, что спорт способствует пониже-нию данных аспектов агрессивности. Раздражительность была меньше у спортсменок, но только внутри SS-генотипа, что предполагает сложное взаимодействие генетических и средовых факторов. Частота встречаемости SS генотипа не отличается между группой спортсменок и студенток, не занимающихся спортом. Но процент носителей LL генотипа больше, а LS генотипа меньше среди синхронисток. Это может свидетельствовать о том, что LL-полиморфизм, ранее ассоциированный с большей устойчивостью к стрессу, важен для успешности в профессио-нальном синхронном плавании. Другой блок исследований выявил связь индивидуальных особенностей восприятия различных интервалов времени с разными генами, что соответствует результатам проведенных ранее физиологических исследований. В работе показано, что эти физиологические механизмы имеют также различную молекулярно-нейрохимическую основу. Данный подход, таким образом, способствует преодолению имеющегося разрыва между исследованиями системного и молекулярного уровня.

Blog