Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Программа

Содержание Исследование no-зависимых механизмов клеточной радиочувствительности Исследование комплексного воздействия ионизирующей и ультрафиолетовой радиации на растворы кристаллинов и на хрусталик глаза мыш

Подобный материал:

• Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные, 9808.28kb.
• Распоряжение Президиума ран от 23 сентября 2008 г. №10104-653 "Об утверждении Порядка, 422.29kb.
• Тезисы докладов, 4952.24kb.
• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки медицине, 320.86kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран, 3259.61kb.
• Программа фундаментальных исследований президиума ран «Биоразнообразие» 2005-2008,, 173.94kb.
• Программа отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума, 123.52kb.
• Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные, 8.63kb.
• Научный журнал "Вопросы филологии" Оргкомитет: Сопредседатели, 47.73kb.

ИССЛЕДОВАНИЕ NO-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

Н. Я. Гильяно, Л.В. Коневега, С.И. Степанов, Е.Г. Бикинеева

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН, Гатчина

Общеизвестно, что ведущую роль в радиационно-индуцированной инактивации макромолекул в клетках млекопитающих играют первичные продукты радиолиза воды (Н*, ОН* и е^-_гидр.). Между тем показано, что в регуляции баланса свободных радикалов участвуют также и радикалы, продуцируемые в клетке энзиматически, такие как оксид азота (NO) и супероксид (Ō₂)_. Кроме того, ионизирующее излучение потенцирует активность NO-синтазы (NOS) и тем самым увеличивает продукцию этих радикалов. Известно, что NOS является уникальным ферментом, продуцирующим оба этих радикала в зависимости от наличия субстрата (L-аргинина) и кофактора тетрагидробиоптерина (ВН₄). Свободно-радикальная природа NO позволяет ему как активизировать цепные радикальные реакции, так и ингибировать их в зависимости от его концентрации в клетке. Контроль изменений внутриклеточного уровня NO и супероксида при физиологических условиях является первостепенной задачей для выяснения их роли в регуляции клеточной радиочувствительности. Используя флуоресцентные индикаторы NO (4,5-диамино-флуоресцеин диацетат) и супероксида (дигидроэтидин), мы провели одновременный анализ уровня этих радикалов в клетках двух линий, экспрессирующих различные изоформы NOS: карциномы (HeLa) и эндотелиоцитов (ECV 304) человека. Выполнены сравнительные исследования по оценке изменения уровней NO и супероксида в клетках после обработки их агентами (³Н бета-частицы), индуцирующими генерацию этих радикалов, а также ингибиторами NOS (аминогуанидин и L-NAME (ω-N-нитро-L-аргинина метиловый эфир) и антиоксидантами (аскорбиновая кислота, аминотиолы). Показана возможность управления эндогенной продукцией NO и супероксида в этих клеточных линиях. Облучение клеток гамма-лучами ¹³⁷Cs в различных дозах сложным образом влияло на изменение уровня NO в клетках, при этом наблюдалась корреляция между уровнем NO и модификацией уровня хромосомных повреждений ингибиторами NOS.

Сравнительные исследования изменения уровней NO и супероксида при модификации внутриклеточного уровня L-аргинина (избыток L-орнитина + L-лизина в среде) в клетках карциномы и эндотелиоцитах человека выявили увеличение уровня супероксида, без изменения уровня NO. При замене L-аргинина на его метилированную эфирную форму L-NAME, который, являясь N-производным аргинина, представляет собой альтернативный субстрат-ингибитор синтеза NO, наблюдаются сущест-венные различия в регистрируемых уровнях NO и супероксида в исследуемых клеточных линиях. L-NAME снижал уровень как супер-оксида, так и NO в клетках карциномы человека. При этом его неактивный изомер D-NAME (ω-N-нитро-D-аргинина метиловый эфир) снижал только уровень супероксида. При обработке этими агентами эндо-телиоцитов человека регистрировалось снижение только уровня суперок-сида. Неэффективность L-NAME в модификации уровня NO при обработ-ке эндотелиоцитов подтверждает их NO-резистентность. Ранее между эти-ми двумя линиями клеток нами были выявлены существенные различия в эффективности L-NAME в модификации радиационно-индуцированных хромосомных повреждений. Выявленная корреляция между изменениями внутриклеточного уровня NO и модифицируемостью радиационно-индуцированных хромосомных повреждений свидетельствует об NO-зависимом пути модификации клеточной радиочувствительности.

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ РАДИАЦИИ

НА РАСТВОРЫ КРИСТАЛЛИНОВ И НА ХРУСТАЛИК ГЛАЗА МЫШИ

К.О.Муранов¹⁾, Н.Б.Полянский¹⁾, А.В.Спасский²⁾, К.А.Труханов²⁾, Б.С.Федоренко³⁾, А.Н.Кабаченко³⁾, М.А.Островский ¹⁾

¹⁾Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, ²⁾МГУ им. М.В.Ломоносова, ³⁾ Объединенный институт ядерных исследований, Дубна

Катаракта – одно из отдаленных последствий воздействия космических лучей на здоровье космонавтов (Cucinotta et al., 2001; Rafnsson et al., 2005; Rastegar, Eckart, Mertz, 2002). Недавно мы показали, под действием облучения растворов белков хрусталика глаза – кристаллинов ядрами высокой энергии в них возникают скрытые повреждения. Такие повреждения выявлялись при последующем облучение кристаллинов УФ светом (Островский и др., 2003, 2004). Таким образом, УФ облучение может служить фактором, провоцирующим и ускоряющим развитие радиационной катаракты. Проверка этого предположения проводится нами в рамках программы «Фундаментальные науки – медицине». Конкретными задачами были, во-первых, продолжение изучение повреждающего действия высокоэнергетических частиц на β_L-кристаллин хрусталика глаза быка in-vitro и, во-вторых, исследование in-vivo влияния комбинации однократного облучения γ-излучения и последующего ежедневного ультрафиолетового облучения на формирование катаракты у мышей.

Методика. Раствор β_L-кристаллина (4-5 мг/мл) облучали альфа- частицами (7 Мэв/нуклон) в интервале доз от 2.5 до 50 Gy. Показано, что облучение в дозах больших 5 Gy вызывает повреждение в виде образования меж- и внутримолекулярных сшивок, приводящих к агрегации белка. Облучение в меньших дозах вызывает образование скрытых внутримолекулярных повреждений как в виде разрывов полипептидной цепи белка, так и внутримолекулярных сшивок.

В эксперименте in-vivo использовали мышей-самцов F1 (C57Black X CBA). Были сформированы следующие группы: (1) контроль – 18 шт.; (2) однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Gy – 20 шт.; (3) однократное облучение γ-лучами в дозе 4 Gy – 20 шт.; (4) однократное облучение γ-лучами в дозе 2 Gy + ежедневное облучение ультрафиолетом – 20 шт.; (5) однократное облучение γ-лучами в дозе 4 Gy + ежедневное облучение ультрафиолетом – 20 шт.; (6) ежедневное облучение ультрафиолетом – 18 шт. Облучению γ-лучами подвергали все тело животного. Ежедневное облучение мышей ультрафиолетом в диапазоне 280-380 нм в течение 15 мин (мощность ультрафиолета в районе облучения 5.5+0.8 Вт/М²) проводили в специальной клетке, для увеличения дозы ультрафиолета, попадающего в глаз животных периодически беспокоили. Развитие катаракты оценивали методом экспертных оценок фотографии хрусталиков, полученные с помощью щелевой лампы (ЩЛ-1), снабженной цифровым фотоаппаратом (Kodak CoolPix P5000).

Результаты. Показано, что на пятый месяц после начала эксперимента в хрусталиках животных появляются слабые кортикальные помутнения (1-2 балла) во всех экспериментальных группах, а также образование заднеполярных помутнений у отдельных животных из групп, облученных γ-лучами, что совпадает с данными описанными в литературе.

Статистически значимая разница в степени повреждения хрусталика обнаружена между животными, получавшими 2 Gy и получавшими комбинации дозы 4Gy и УФ облучения (p = 0.015, критерий Манна-Уитни). На основании полученных результатов эксперимент продлен еще на 5 месяцев для достижения образования выраженных помутнений.