Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Содержание

Изучение внутри и межгеномного полиморфизма нук-леотидных последовательностей днк в области ядрыш-кового организатора у человека
Институт биологии гена РАН, Москва
Выявление повышенной наследственной радиочувствительности с помощью оценки репаративного потенциала на клеточном уровне
Институт цитологии РАН

Подобный материал:

1 ... 48 49 50 51 52 53 54 55 ... 74

ИЗУЧЕНИЕ ВНУТРИ И МЕЖГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА НУК-ЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ОБЛАСТИ ЯДРЫШ-КОВОГО ОРГАНИЗАТОРА У ЧЕЛОВЕКА И ВЫСШИХ ОБЕЗЬЯН

А.П. Рысков, Д.В. Шибалев, К.К. Нечволодов, Н.С. Куприянова

Институт биологии гена РАН, Москва

Рибосомный межгенный спейсер (рМГС) человека содержит в своей центральной части два высоко гомологичных повтора, размером 2 т.п.н., LR1 и LR2. Нами изучалась гетерогенность вариабельных сегментов LR2 (LR2_var) в рМГС человека. Определены нуклеотидные последовательности 547 копий LR2_varиз десяти неродственных геномов человека. Централь-ную часть практически у всех вариантов LR2_var занимают протяженные сложные микросателлитные кластеры (G)_n (AG)_m, с произвольно варьиру-ющими значениями ‘n’ и ‘m’. Нуклеотидные последовательности, фланки-рующие центральный микросателлитный кластер, представлены более чем тридцатью структурными группами, из которых две (A и B) являются основными и шесть (C-H) минорными вариантами. Анализ результатов секвенирования позволяет предположить, что вариабельность LR2_var_, помимо неточного спаривания цепей за счет соскальзывания в процессе репликации, может возникать за счет неравного кроссинговера и сег-ментарного обмена ДНК между LR1_varи LR2_var по механизму генной кон-версии. рМГС человека значительно отличается по нуклеотидной после-довательности и распределению регуляторных элементов от рМГС мыши, крысы и Xenopus laevis. Нами амплифицированы, клонированы и секве-нированы фрагменты рМГС человекообразных обезьян Pan troglodytes, Gorilla gorilla и Pongo pygmaeus., размером более 2 т.п.н., непо-средственно предшествующие точке начала транскрипции. Выравнивание вновь полученных нуклеотидных последовательностей высших приматов с ортологичной областью человека показало, что области гомологии меж-ду ними распределяются неравномерно. Между 40952 –41021 п.н. (в соот-ветствии с нумераций нуклеотидов в рДНК человека по U13369) лока-лизован элемент Alu1, и гомология здесь составляет 85 %. Далее, на про-тяжении ~ 350 п.н. гомология не превышает 50 %, и возрастает до преж-него (~85 %) значения вплоть до стартовой точки транскрипции (от 41350 до 43000 п.н.). Значение таких перепадов гомологии должно стать яснее после проведения функционального картирования данного участка рМГС.

Ранее было высказано предположение, что микросателлиты, видоспецифичные для предпромоторной области рДНК человека, могут исполнять роль энхансеров транскрипции. Для проверки этого предположения в качестве мишеней были синтезированы два 40-mer олигонуклеотида, соответствующих наиболее характерным микро-сателлитным мотивам из предпромоторной области рДНК высших приматов и использованы для экспериментов по изменению электрофоретической подвижности белков из экстрактов клеток HeLa (EMSA). Полученные результаты не выявили связывания между двунитчатыми олигонуклеотидами и белками экстракта, тогда как комплексы белков с однонитчатыми олигонуклеотидами (CTTT)₁₀и (AGGG)₁₀ активно образовывались. Белки были идентифицированы методом масс-спектрометрии В. Куровой (лаб. Е.Н. Николаева, Институт биохимической физики РАН) как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), соответственно.

ВЫЯВЛЕНИЕ ПОВЫШЕННОЙ НАСЛЕДСТВЕННОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ С ПОМОЩЬЮ ОЦЕНКИ РЕПАРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ

В.М.Михельсон, И.М.Спивак, Т.В.Зимарина, Е.А.Полуботко, Н.В.Томилин

Институт цитологии РАН

Возможность определения наследственной радиочувствительности крайне важна как для людей, у которых в семьях были выявлены больные с синдромами повышенной радиочувствительности, предрасположен-ности к развитию опухолевых заболеваний или для лиц, чья профессиональная деятельность связана с возможными повреждающими воздействиями (врачи-рентгенологи, работники вредных химических производств, атомных станций и пр.). Нами были изучены методом проточной цитометрии и методом электрофореза отдельно взятых клеток (метод комет) набор клеточных штаммов от больных атаксией-телеангиэктазией (АТ) и их кровных родственников и от больных немедуллярным раком щитовидной железы и их кровных родственников. Изменение параметров клеточного цикла после облучения у гетерозиготных носителей АТ и лиц с семейной предрасположенностью к немедуллярному раку щитовидной железы не столь ярко выражены, как у больных, но достоверно отличаются от таковых здорового донора. И в том и в другом случае при облучении у обследованных пациентов G2/M-блок сохраняется в течение нескольких суток после облучения. Если в клетках здорового донора распределение клеток по фазам клеточного цикла быстро восстанавливается, то для гетерозиготных носителей наследственной патологии мы наблюдаем промежуточное состояние, то есть более медленное, чем в контроле, обращение блоков клеточного цикла. Способность к воссоединению разрывов ДНК после облучения в дозе 5 Гр также достоверно снижена в клетках больных по сравнению с клетками здорового донора, но их репаративный потенциал в обоих случаях существенно выше, чем у больных. Если клетки здорового донора способны воссоединить за 2 часа не менее 90 % разрывов ДНК, то в клетках больного немедуллярным раком щитовидной железы количество воссоединенных за это же время разрывов не превышает 20 %, а в клетках члена той же семьи – гетерозиготного носителя – 50 %. Таким образом, использование метода комет и проточной цитометрии является достаточно удобным и адекватным для того, чтобы дискриминировать гетерозиготного носителя заболевания от здорового донора и может быть применено в медицинской практике.