Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Программа

Содержание Исследование повреждения днк и индукции апоптоза в сетчатке мышей под действием ионизирующей радиации и метилнитрозомочевины Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Индивидуальная радиочувствительность онкологических больных как показатель эффективности лучевой терапии Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва

Подобный материал:

• Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные, 9808.28kb.
• Распоряжение Президиума ран от 23 сентября 2008 г. №10104-653 "Об утверждении Порядка, 422.29kb.
• Тезисы докладов, 4952.24kb.
• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки медицине, 320.86kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран, 3259.61kb.
• Программа фундаментальных исследований президиума ран «Биоразнообразие» 2005-2008,, 173.94kb.
• Программа отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума, 123.52kb.
• Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные, 8.63kb.
• Научный журнал "Вопросы филологии" Оргкомитет: Сопредседатели, 47.73kb.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК И ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА

В СЕТЧАТКЕ МЫШЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ

В.А.Тронов¹⁾, М.Ю.Логинова²⁾, Т.А.Белецкая,¹⁾ А.Д.Козлова¹⁾, Т.Б.Фельдман²⁾

¹⁾Институт химической физики им. Н.Н.Семенова РАН, Москва

²⁾Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Спонтанный и индуцированный апоптоз фоторецепторов сетчатки лежит в основе распространенных патологий зрительных органов – дистрофии сетчатки и пигментного ретинита. Существуют экспериментальные доказательства в пользу двух механизмов инициации апоптоза в фоторецепторах. Первый связан с увеличением уровня внутриклеточного кальция и активацией кальпаина и эффекторной каспазы-12, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме. Второй механизм связан с накоплением повреждений ДНК и дефицитом их репарации. Он наименее изучен в клетках сетчатки.

Цель работы состояла в изучении радиационно- и химически-индуцированного апоптоза клеток сетчатки, в котором пусковым событием предполагается повреждение ДНК. Объектом исследования были сетчатка мышей линии СВА (in vivo) и лимфоциты крови человека (in vitro). В качестве генотоксических агентов использовали гамма-облучение и метилнитрозомочевину (МНМ). Для оценки повреждения ДНК и репарации использовали метод ДНК-комет. Частоту апоптотических клеток оценивали по частоте «апоптотических» ДНК-комет, формируемых клетками in vitro спустя >24 ч после введения агента, считая это время достаточным для завершения репаративных процессов, инициированных МНМ в клетках. Дегенеративные изменения сетчатки и признаки апоптоза наблюдали микроскопически на стандартно фиксированных и окрашенных тканевых срезах.

Показано, что в/б введение мышам МНМ (50-70 мг/кг) вызывало деструктивные изменения сетчатки, выражавшиеся в >2-кратном изменении толщины наружного сетчатого и фоторецепторного слоев клеток, в характерной для апоптоза гиперконденсации хроматина и фрагментации ядер клеток фоторецепторного слоя. Гамма-облучение мышей не вызывало таких изменений в сетчатке. Апоптогенная способность МНМ резка снижалась в узком диапазоне доз агента: при дозе 35 мг/кг эффект отсутствовал. Морфологическим изменениям в сетчатке предшествовало формирование в ДНК щелочелабильных сайтов и разрывов, которые представляют собой интермедиаты процесса репарации метилированных оснований. Эффективность репарации зависела от дозы МНМ: в дозе 35 мг/кг (не вызывающей апоптоза в сетчатке) до 80 % возникших повреждений ДНК удалялись к 48 час после введения агента. Уровень репарации после введения МНМ в апоптогенной дозе не превышал 20 %. Мы полагаем, что это снижение репаративной активности связано с ингибированием активности генов, кодирующих белки репарации в результате повреждения самих генов под действием МНМ. Подавление активности ДНК-метилтрансферазы с помощью субстратного ингибитора 06-бензилгуанина увеличивало выход разрывов ДНК, но не изменяло динамику и эффективность репарации в клетках сетчатки. Метоксиамин снижал эффективность эксцизионной репарации модифицированных оснований ДНК в клетках сетчатки и усиливал цитотоксический эффект МНМ на сетчатку мышей in vivo.

Полученные результаты говорят о связи повреждений ДНК с индук-цией апоптоза в клетках сетчатки у мышей под действием МНМ. В то же время наши результаты не исключают того, что цитотоксическое действие МНМ на сетчатку мышей может быть опосредовано репарацией возник-шего обширного повреждения генома, что приводит к энергетическому коллапсу и гибели клеток. Наши дальнейшие исследования путей апоптотического сигналинга в сетчатке проверят эту возможность.

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ

И.И. Пелевина¹⁾, В.Я. Готлиб¹⁾, О.В. Кудряшова¹⁾, Н.Ю. Воробьева¹⁾, Е.Ю. Лизунова ¹⁾, А.Н. Осипов¹⁾, А.М. Серебряный²⁾, А.В. Алещенко²⁾, Л.П. Семенова²⁾, В.К. Боженко³⁾, Т.М. Кулинич³⁾, Г.П. Снигирева³⁾

¹⁾Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва

²⁾Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва

³⁾ ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росздрава, Москва

Одним из важнейших методов лечения онкологических больных является лучевая терапия, которая используется самостоятельно или в сочетании с другими агентами. Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа у отдельных больных резко различается, что существенно осложняет разработку общих подходов к лечению. Поэтому выявление показателей, по которым можно было бы определить индивидуальную реакцию отдельных больных на радиационные воздействия, представляется важной проблемой.

Целью настоящей работы является определение индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови онкологических больных на проведение курса локальной лучевой терапии и изменений чувствительности лимфоцитов к дополнительному облучению in vitro по сравнению со здоровыми донорами.

Были обследованы пациенты с разными типами опухолей, но детальный анализ был проведен у больных раком предстательной железы. Определяли следующие показатели: поврежденность ДНК и степень ее репарации, гибель клеток по пути апоптоза, частоту клеток с микроядрами (МЯ) и нестабильные аберрации хромосом.

Было обнаружено, что спонтанный уровень двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК), которые определяли методами ДНК-комет, выявления фосфорилированного гистона Н2АХ и включения бромдезоксиуридина, повышен у онкологических больных до лечения по сравнению со здоровыми донорами. Поврежденность ДНК лимфоцитов в процессе лечения еще более возрастает. При дополнительном облучении (в дозе 1Гр) лимфоцитов in vitro у леченых больных радиочувствительность выше, чем у больных, не подвергавшихся лучевой терапии (до лечения).

Эффективность репарации ДР ДНК лимфоцитов до и во время лечения различаются не существенно. Обнаружено возрастание доли лимфоцитов в стадии раннего апоптоза у онкологических больных до лечения (по сравнению со здоровыми донорами) и значительное возрастание доли клеток, гибнущих как по пути апоптоза, так и некроза во время курса лучевой терапии и дополнительного облучения in vitro.

Частота клеток с цитогенетическими повреждениями у большинства онкологических больных по сравнению со здоровыми индивидуумами повышается при лечении. Особенно следует отметить, что частота всех изученных молекулярно-биологических и цитогенетических показателей сильно варьирует у отдельных индивидуумов.

Результаты работы показывают, что у онкологических больных как до, так и во время лечения, отмечается повышение уровня поврежден-ности ДНК, гибели лимфоцитов, частоты клеток с МЯ, а также высокая повреждаемость ДНК при облучении лимфоцитов in vitro. Можно пола-гать, что наблюдаемые у большинства онкологических больных увеличе-ние поврежденности генома лимфоцитов при лечении и повышение доли гибнущих клеток являются показателями эффективности лечения.