Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Программа

Содержание Механизмы инактивации бактериофага рм2 как модельного патогенного агента в крови В.А. Шарпатый, В.М. Андреев, Н.В. Кузнецова, В.А. Кузьмин Исследование гетероплазмии мтднк в клетках крови людей и в клетках тканей мышей, подвергшихся радиационному воздействию

Подобный материал:

• Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные, 9808.28kb.
• Распоряжение Президиума ран от 23 сентября 2008 г. №10104-653 "Об утверждении Порядка, 422.29kb.
• Тезисы докладов, 4952.24kb.
• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки медицине, 320.86kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран, 3259.61kb.
• Программа фундаментальных исследований президиума ран «Биоразнообразие» 2005-2008,, 173.94kb.
• Программа отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума, 123.52kb.
• Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные, 8.63kb.
• Научный журнал "Вопросы филологии" Оргкомитет: Сопредседатели, 47.73kb.

МЕХАНИЗМЫ ИНАКТИВАЦИИ БАКТЕРИОФАГА РМ2

КАК МОДЕЛЬНОГО ПАТОГЕННОГО АГЕНТА В КРОВИ

И МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТАХ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ВИДИМОГО СВЕТА В ПРИСУТСТВИИ КРАСИТЕЛЕЙ

В.А. Шарпатый, В.М. Андреев, Н.В. Кузнецова, В.А. Кузьмин

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, РАН, Москва

Продолжено исследование инактивации фага РМ2 при комбиниро-ванном воздействии гамма-излучения (кобальт-60, максимальная доза 2,2 кГр) и видимого света в присутствии цианиновых красителей – диэтилтиадикарбоцианина (К1) и диэтилтиакарбоцианина (К2). Использовали неочищенный фаг в лизате, разбавленном питательной средой (0,45 М NaCl, 50 мM MgSO₄, 10 мM CaCl₂, 8 г/л пептона). Под действием гамма-излучения титр жизнеспособного фага (Т) снижался пропорционально дозе (максимально в три раза). Затем гамма-облученные, а также необлученные образцы подвергали фотоинактивации (краситель К2). Установлено, что эффект фотоинактивации почти аддитивно складывается с эффектом гамма-инактивации: ΔlgT = ΔlgT_Ф + ΔlgT_Г. Таким образом, гамма-облучение только незначительно увеличило чувствительность выжившего фага к фотоинактивации.

Ранее мы сообщали о фотоинактивации фага РМ2 в присутствии К1, который имел значительную примесь К2. Оказалось, что в присутствии чистого К1 фотоинактивации практически нет, а чистый К2, наоборот, очень активен (возможно, потому, что К2 более растворим в водной среде, чем К1). Фаг, введенный в нормальную бычью сыворотку (НБС) или в питательную среду с сывороточным альбумином человека (САЧ,50 мг/мл), был резистентен к фотоинактивации, однако, после разбавления НБС или САЧ в 100 или более раз питательной средой фотоинактивация становилась заметной. Это показывает, что в сыворотке краситель захватывается альбумином.

В ряде опытов с К1 + К2 и с К2 (более 13 мкМ) при 0° удалось получить большую глубину фотоинактивации (снижение титра на 5-6 порядков) за 10-15 мин. При таких концентрациях большая часть красителя находилась в виде больших агрегатов. При меньших концентрациях, когда краска оставалась в растворе (мономеры, димеры и более крупные агрегаты) титр фага быстро снижался на два порядка, а при дальнейшем освещении сохранялся почти постоянным. При освещении в питательной среде краситель быстро деградирует. При добавлении в среду азида натрия (0,2 М) фаг не поддавался фотоинактивации. Это указывает на то, что фотоинактивация (и деградация краски) происходит под действием синглетного кислорода. Зависимость начальной скорости фотоинактивации от концентрации красителя сходна с зависимостью концентрации димера от суммарной концентрации красителя. Это позволяет предположить, что в данных условиях именно димеры и более высокие агрегаты являются генераторами синглетного кислорода.

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОПЛАЗМИИ МТДНК В КЛЕТКАХ КРОВИ ЛЮДЕЙ И В КЛЕТКАХ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

А.И.Газиев¹⁾, Н.А.Гуляева¹⁾, В.Н.Антипова¹⁾, С.А.Абдуллаев¹⁾,

К.Н.Муксинова²⁾, М.Л.Захарова²⁾, Л.В.Малахова¹⁾, Э.В.Евдокимовский¹⁾, И.И. Бельская¹⁾

¹⁾Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино ²⁾Южно-Уральский институт биофизики Федерального медико-биологического агентства, г. Озерск

Митохондриальная ДНК (мтДНК), которая имеет ряд особенностей, отличных от ядерной ДНК (яДНК), в клетках представлена множеством копий, содержащих гены системы дыхательной цепи, является более уязвимой мишенью, по сравнению с яДНК, для эндогенных и экзогенных генотоксических агентов, и в митохондриях системы репарации функционируют не эффективно. Поэтому в мтДНК мутации могут возникать с повышенной частотой, чем в яДНК. Выявление мутантных копий и определение сроков их накопления в клетках тканей представляет значительный интерес для оценки радиационного поражения и уровня генотоксического груза.

В настоящей работе были продолжены анализы по выявлению мутаций мтДНК в клетках периферической крови профессионалов-работников ядерного предприятия, подвергшихся хроническому гамма-облучению. Кровь у этой группы была взята через 16-20 лет после облучения в дозе 250-350 сГр. Для сравнения были анализированы также наличие мутации мтДНК в клетках крови трех групп доноров: 13 молодых (23-26 лет), 15 пожилых (65-74 лет) доноров и 17 пациентов с раком молочной железы, через 7 дней после прохождения сеансов радио-химиотерапии (РХТ).

Анализы проводили PCR-TTGE методом. Мутации определяли во фрагментах четырех генов, кодирующих белки комплекса дыхательной цепи и в одном фрагменте участка D-петли (DloopI) мтДНК. Установлено, что чаще всего мутации выявляются при PCR-TTGE анализах участка DloopI. Результаты показали, что гетероплазмия мтДНК по участку DloopI обнаруживается только у 8 из 23 человек, подвергавшихся хроническому гамма-облучению. Наиболее высокий уровень мутации мтДНК по всем анализируемым локусам наблюдается в клетках крови пациентов, прошедших РХТ. Вместе с тем во всех случаях, уровень гетероплазмии мтДНК в клетках крови не превышает 50 %. Возможно, в обновляющихся клетках крови доноров часть молекул мтДНК с мутациями и делециями элиминируется. Это исследование было продолжено в экспериментах на мышах линии BALB/c, подвергнутых облучению Х-лучами. Образцы ДНК получали из тканей мозга и селезенки мышей через 2 и 4 недели после облучения в дозе 2 и 5 Гр. Определяли наличие мутаций мтДНК и изменения количества копий мтДНК относительно ядерного гена бета-актина.

Результаты экспериментов показывают, что точечные мутации и делеции в мтДНК клеток пролиферирующей ткани селезенки существенно меньше, чем таковые в клетках постмитотической ткани мозга, выявляемые после облучения мышей. Результаты анализов также указывают, что уровень гетероплазмии мтДНК в тканях явно снижается на 4 недели после облучения животных, по сравнению с данными, регистрируемыми на 2 недели после облучения. Причем более выраженное снижение гетероплазмии мтДНК выявляется в селезенке мышей, по сравнению с таковым в ткани мозга. Ранее нами было показано, что в клетках тканей мозга и селезенки мышей сразу после их облучения наблюдается резкая активация репликации мтДНК, как развитие компенсаторной реакции, направленной на возмещение поврежденных копий мтДНК. Этот синтез мтДНК, в отличие от синтеза яДНК, не блокируемый системой контроля клеточного цикла, способствует накоплению мутации и делеции в мтДНК. Количественный анализ числа копий мтДНК, относительно фрагмента ядерного гена, показывает, что на 2 и 4 недели после облучения мышей в клетках тканей этих животных число копий мтДНК существенно снижается.

Полученные результаты позволяют полагать, что поврежденные и несущие мутаций и делеций молекулы мтДНК элиминируются из клеток тканей. Более активное удаление таких копий мтДНК происходит из пролиферирующей ткани, чем из постмитотических.