Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
дрейфом, то по мини- и микросателлитным локусам ? и дрейфом и мутациями. Гетерозиготность по минисателлитам может более чем на порядок превышать аллозимную, достигая почти 100%, тогда как по микросателлитам встречается разный уровень полиморфизма, хотя, как правило также выше аллозимного.
. Микро- и однолокусные минисателлиты обладают менделевским кодоминантным наследованием.
. Микросателлиты одинаковы у близких видов, что позволяет использовать одни и те же праймеры и сходные протоколы анализа.
. Для анализа микросателлитов требуется очень малое количество крови или какой-либо ткани организма, поэтому возможно прижизненное взятие образцов (у рыб, например, пригодны также высохшая чешуя, отолиты).
. Возможен автоматизированный анализ микросателлитов.
Используются мини - и микросателлитные локусы в самых различных генетических исследованиях в связи с их высокой скоростью мутирования, большим аллельным разнообразием и гетерозиготностью.
Микросателлитные маркёры нередко выявляют генетическую дифференциацию в тех случаях, когда она не обнаруживается по аллозимным маркёрам, например, у организмов с низкой изменчивостью ферментных локусов, у подвижных морских рыб, на микрогеографической шкале, среди близкородственных популяций или экологических групп одного вида. Высокое аллельное разнообразие микросателлитных локусов, которое позволяет идентифицировать с их помощью потомство конкретных родителей не только в первом, но и в последующих поколениях, открывает возможность для исследования репродуктивного успеха и приспособленности среди особей, отличающихся биологическими и экологическими характеристиками.
В то же время следует указать, что микросателлитные локусы непригодны для эволюционных построений (филогении) на межвидовом и более высоких уровнях, так как наблюдаемое при этом сходство в величине аллелей может отражать не идентичность их происхождения, а так называемую гомоплазмию. Это явление возникает из-за высокой скорости мутирования, когда микросателлитные аллели одинакового размера образуются в результате конвергенции от разного числа прямых или обратных мутационных событий. Ещё одна проблема, с которой сталкиваются при анализе микросателлитов, ? наличие нулевых аллелей, появляющихся вследствие мутаций в сайте связывания с праймером, что не позволяет точно идентифицировать генотипы (Алтухов, 2004).
.3.1 Выделение тотальной ДНК
Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, нужно получить их в относительно чистом виде. Перед выделением ДНК образец ткани (часть хвостового плавника рыбы) извлекали из коллекционной пробирки и ножницами отделяли фрагменты необходимого размера. Мелкие фрагменты исследуемой ткани затем переносили в отдельную чистую пробирку.
Для экстракции ДНК применяли солевой метод (модифицированный) (Приложение 5). Для выделения ДНК этим методом необходимы следующие компоненты:
. лизирующий буфер.
. раствор протеиназы К (20 мг/мл)
. раствор 6М NaCl
. изопропанол
. 70% этанол
. бидистилят
Состав лизирующего буфера следующий: 0,4М NaCl; .01M TrisHCl (pH8.0); 2 mM EDTA (pH 8.0); 2% SDS.
На 100 мл лизирующего буфера приходятся следующие компоненты:
мкл 4М-ого NaCl
мкл1М-ого TrisHCl (pH 8.0)
мкл0,5М-ого EDTA (pH 8.0)
мкл 20%-ого SDS
,6 млводы
SDS (додецилсульфат) - поверхностно-активное вещество, создающее на белках сильный отрицательный заряд, вследствие чего происходит их денатурация и отделение от нуклеиновых кислот. Вызывает разрушение структуры мембран, вследствие разрушения её белковых составляющих.
EDTA (этилендиаминтетраацетат) - хелатирующий агент, связывающий ионы металлов переменной валентности; используется для устранения ингибирования катализируемых ферментами реакций следовыми количествами тяжёлых металлов.
Для выделения ДНК данным методом необходимо осуществить следующие процедуры:
. навеску ткани поместить в 1,5мл-ую пробирку с 400 мкл лизирующего буфера и 2 мкл раствора протеиназы К. Оставить для лизиса на ночь или 2-3 часа при температуре +580С и периодическом перемешивании.
. к лизату добавить 300 мкл 6М NaCl, перемещать 30с на вортексе и осадить центрифугированием при 10тыс./мин. в течение 30мин.
. отобрать в чистые пробирки верхнюю фазу (около 600мкл), стараясь не трогать возможную липидную пленку сверху.
. к верхней фазе прилить 600 мкл изопрапанола для осаждения ДНК. Смешать. Оставить при минус 200С на 20 минут.
. отцентрифугировать при 10тыс./мин. в течение 20мин.
. отобрать изопрапаноловый спирт, промыть осадок 70%-ым этанолом, добавляя 500 мкл этанола и центрифугирования при 12тыс./мин. в течение 12мин.
Осадок ДНК должен быть белым или беiветным, поэтому цветной осадок 70%-ым этанолом можно промыть неоднократно.
. спирт слить, подсушить осадок в течение 5-10 минут при 370С.
. растворить осадок в бидистиляте в течение 10 минут при 500С.
.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода полимеразной цепной реакции (Polymerase chain reaction) был разработан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госэпидемнадзора. Метод очень эффективен для изучения полиморфизма ДНК. Он позволяет относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.
Для реализации ПЦР необходимы следующие