Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?лота27,5г
Дистиллированная вода до 500мл
Разделяющий 6%-ый ПААГ (заливка стекол). На 100 мл (2 стекла) необходимо:
%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 20мл
х ТВЕ 10мл
%-ый APS 4 мл
Н2О 66мл
ТEMED 60мкл
%-ый ПААГ (пробка). На 8 мл (2 стекла) необходимо:
х ТВЕ 800мкл
%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 7,2мл
%-ый APS 400мкл
ТEMED 10мкл
Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле осуществляли следующие процедуры.
. Подготовка камеры для вертикального электрофореза (Приложение 6 и 7).
Собирали камеру для вертикального электрофореза на два геля. Если необходим только один гель, вторую пару стекол заменяли одним квадратным стеклом. Важно, чтобы стекла были чистыми без ворсинок и пятен. На стол плашмя клали остов камеры, накрывали его стеклом с рогами, совмещая с боковыми и нижним контурами остова. Вдоль боковых сторон стекла помещали по спейсеру и накрывали стеклом без выемки. Совмещали с помощью скальпеля края стекол и спейсеров, так чтобы последние не выглядывали (особо нижний край). Закрепляли стекла на остове прищепами бульдог по середине. Переворачивали конструкцию закрепленными стеклами на стол и повторяли процедуру с другой парой стекол. Окончательно выравнивали стекла так, чтобы поставленная на ровную поверхность камера не качалась. После этого закрепляли стекла с каждой стороны еще двумя парами бульдогов. Камера готова к работе.
. Проводили пролимеризацию полиакриламидной пробки. Для этого на ровную поверхность (например, нижняя сторона поддона от камеры) наносили по разметке две дорожки 26%-ого ПААГ и вдоль них опускают дно камеры. Гель поднимается между стеклами на высоту около 1 см. Для застывания гелевой пробки камеру оставляли на 20 минут. Затем камеру с пробкой заливали разделяющим 6%-ым ПААГ. Для удобства гель рекомендуется заливать 20 ил 10-кубовым шприцем по внутренней стороне цельного стекла. Верхняя граница геля должна совпадать с верхней границей рогатого стекла. Заливали гель равномерно, стараясь не допускать попадания пузырьков воздуха. Сверху между стекол вставляют гребенку, ориентируясь по верхнему краю рогатого стекла, и давали гелю застыть около 1 часа. Камеру с гелем помещали в поддон и заливали её и ёмкость поддона 1-кратным ТВЕ буфером. Гребенки вынимали строго вертикально. Через клеммы камеру подключали к источнику питания.
. Префорез. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при постоянной силе тока 100 мА в течнение 30 минут.
. Нанесение проб на гель. Во избежание искривления дорожек пробы желательно не наносить в самые крайние слоты.
ПЦР-пробу смешивали с красителем в соотношении примерно 2:0,5, отбирали от общего объёма 15 мкл и вносили в слот.
. Электрофорез. Режим электрофореза - постоянная сила тока 55-70 мА. Процесс прекращали, когда расстояние от дна слот до середины полосы красителя составит не менее 13 см.
. Окраска и отмывка геля. После отключения от источника питания сливали
-кратный ТВЕ, камеру разбирали, гель помещали в поддон с 0,5 л дистиллированной воды (можно оставить гель на нижнем стекле для удобства его перемещения). Добавляли 20 мкл 10 мкг/мл раствора бромистого этидия. Окрашивали гель в течение 30 минут на шейкере. Затем отмывали гель дистиллированной водой в течение 30 минут на шейкере.
После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуореiенции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия. Получали электрофореграммы, которые позволяют визуализировать исследуемые микросателлитные локусы. Каждому бэнду (тёмной полосе) на электрофореграмме соответствует аллель определённой длины. Аллели разной длины в электрическом поле двигаются с разной скоростью, поэтому на электрофореграмме темные полосы располагаются на разных уровнях: ниже расположены короткие аллели, выше располагаются более длинные аллели. Толщина бенда зависит от количества ДНК в пробе. Аллели одинаковой длины будут располагаться на одном и том же уровне, поэтому толщина бенда увеличивается. Это будет свидетельствовать о гомозиготности исследуемой особи по определённому локусу.
Глава 3. Результаты исследований
.1 Возрастной состав форелей
Среди изученных особей обнаружены рыбы разного возраста. Возрастной состав форелей отражён в таблице 6 и на рис.1. Преобладающей возрастной группой явились трёхлетки, в меньшем количестве оказались четырёхлетки и пятилетки. Среди исследованных особей только одна особь оказалась двухлеткой.
Таблица 6. Возрастной состав исследуемых форелей.
Общее количествоВозраст1+2+3+4+3111686
Наличие четырёхлеток и пятилеток может свидетельствовать о том, что исследованные рыбы являются представителями жилой расы (форели).
Рис.1. Возрастной состав исследуемых форелей
3.2 Морфологические параметры форелей
Морфометрические показатели исследуемых форелей разных возрастных групп отражены в таблицах 7, 8, 9, 10 и 11.
Таблица 7. Показатели 2-летней (1+) форели из р. Том.
№Длина (см)Ширина рыла (см) (SR)Диаметр глаз (см) (Y)Высота головы (см) (HC)Вес (г)тела (абсолютная) (L1)тела (до конца средних лучей) (L2)тела (до корней средних лучей) (L3)Головы (С)рыла (R)хвост. стебля (Fr)111,310,79,82,30,51,80,70,51,520
В реке Том (приток р.Ингур) на территории с. Саберио нами выловлены: одна рыба в возрасте 1+, шестнадцать в возрасте 2+, восемь в возрасте 3+, две в возрасте 4+. Рыбы из реки Кодор (4 особи) относились к одной возрастной группе 4+.
Таблица 8. Показатели 3-ле?/p>