Влияние перекисных условий на показатели функциональной активности нейтрофилов перифирической крови человека
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
онизированной пуловой донорской сывороткой культурой St. aureus и инкубировали при 37?С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии из которых готовили мазки с последующим окрашиванием по методу Романовского-Гимзы. Определение фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа проводили с использованием стандартной методики при условии подiета не менее 100 лейкоцитарных клеток.
мембрана нейтрофил кровь окислительный
2.5 Исследование активности окислительных ферментов полиморфноядерных гранулоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия
Для определения активности окислительных ферментов использовали тест спонтанного и индуцированного восстановления нитросинего тетразолия.
При проведении спонтанного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл, затем добавляли свежеприготовленный раствор НСТ реактива (0,8 %) в таком же объеме и 200 мкл рабочего буфера и инкубировали при температуре + 37?С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл ДМСО. Пробы инкубировали при + 37?С в течение 60 минут, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 640 нм.
При проведении индуцированного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл, затем добавляли свежеприготовленный раствор НСТ реактива (0,8 %) в таком же объеме и 200 мкл суточной культуры St. aureus и инкубировали при температуре + 37?С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл ДМСО. Пробы инкубировали при + 37?С в течение 60 минут, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 640 нм. в объеме 200 мкл.
2.6. Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов
Для определения активности миелопероксидазы нейтрофилов использовали тест спонтанного и индуцированного окисления ортофенилендиамина.
При проведении спонтанного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл и 200 мкл рабочего буфера и инкубировали при температуре + 37?С. Черечной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл субстратной смеси состоящей из ортофенилендиамина (0,04%) и 0,002% перекиси водорода на фосфатно-цитратном буфере, pH=5,0. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10 % серной кислоты, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
При проведении индуцированного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл и 200 мкл 200 мкл суточной культуры St. aureus и инкубировали при температуре + 37?С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл субстратной смеси состоящей из ортофенилендиамина (0,04%) и 0,002% перекиси водорода на фосфатно-цитратном буфере, pH=5,0. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10 % серной кислоты., затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
2.7 Оценка изменения динамического состояния мембраны полиморфноядерных гранулоцитов
При проведении индуцированного теста инкубированные с различными концентрациями H2O2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл и 200 мкл суточной культуры St. aureus и инкубировали при температуре + 37?С. Через 30, 60, 90, 120 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, инкубировали в течение 20 минут при 37 ?С, трижды промывали рабочим буфером. В качестве контроля использовали пробу с суспензией культуры St. aureus, которую проводили через все стадии анализа. Клетки фиксировали этанолом, вносили в каждую лунку по 200 мкл красителя Романовского-Гимзы, икубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, затем краситель удаляли, а планшет трижды промывали. Для экстракции красителя использовали 200 мМ уксусную кислоту. Учет реакции проводили спектрофотометрически при длине волны 650 нм.
.8 Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка полученных экспериментальных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6.0. Оценка достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводилась с использованием анализа ANOVA по Фридману и критерия Вилкоксона для зависимых групп. Различия iитали достоверными при уровне значимости 0,05. Полученные данные представлены в виде медианы и 25-75 квартилей.
3. Результаты и обсуждение
.1 "ияние окислительных условий на динамику фагоцитарной реакции нейтрофилов
В экспериментах были использованы полиморфноядерные гранулоциты периферической крови двадцати здоровых доноров.
Для оценки динамики изменения фагоцитарной активности интактных и предварительно инкубированных с Н2О2 нейтрофилов была использована модифицированная нами методика постановки реакции