Конспект лекцій дисципліни «основи біотехнології рослин»

Вид материала

Конспект

Содержание Клітинна селекція Калусна тканина Клітинна суспензія Генні, або точкові, мутації

Подобный материал:

• Програма вступних фахових випробувань за спеціальністю «фізіологія рослин» освітньо-кваліфікаційний, 164.35kb.
• Конспект лекцій з навчальної дисципліни «основи охорони праці» для студентів 3 курсу, 15.25kb.
• Конспект лекцій з дисципліни „Радіоекологія для студентів спеціальності 040106  „Екологія,, 1393.76kb.
• В. О. Кодін конспект лекцій з дисципліни «Основи реконструкції історичних міст» для, 703.58kb.
• Конспект лекцій Удвох частинах Частина 1 Суми, 2323.63kb.
• Конспект лекцій Удвох частинах Частина 2 Суми, 1998.47kb.
• Конспект лекцій Суми Видавництво Сумду 2010, 2423.29kb.
• Конспект лекцій з дисципліни „ Управління інноваційним розвитком" для студентів факультету, 2082.69kb.
• Конспект лекцій з дисципліни «Оподаткування підприємств», 2062.58kb.
• І. М. Золотарьова конспект, 427.49kb.

Тема: Мутагенез та клітинна селекція.

1. Процес одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні;
   
2. Вихідні матеріали для клітинної селекції;
   
3. Мутагенез та відбір клітин за ознаками;
   
4. Науково-практичне значення робіт з клітинної селекції;
   
5. Кріозбереження рослинного матеріалу.
   

1. Селекція (від лат. selectio – вибір, відбір) – наука, яка досліджує і застосовує на практиці принципи і методи поліпшення існуючих та виведення нових сртів і гібридних форм рослин, необхідних для задоволення харчових, лікарських, естетичних та інших потреб людини.

Успіх у селекції рослин визначається наявністю стійкої генетичної мінливості у первинній або вихідній популяції. Якщо розглядати кожну клітину суспензійної популяції як індивідуальний організм, то перехід на клітинний рівень дозволяє селекціонеру мати справу з величезною кількістю особин. Дослідник в одному експеременті в умовах ін вітро використовує мільйони клітин (у порівнянні з сотнями-тисячами рослин при роботі селекціонера у полі).

^ Клітинна селекція – сукупність методів відбору клітинних ліній з новими успадкованими знаками в умовах ін вітро.

Щоб одержати клітинний штам, стійкий до певного фактора, суспензію клітин піддають мутагенній дії, а потім висівають на середовище з цим фактором, але у концентраціях, які пригнічують ріст нормальних клітин (клітин дикого типу). Можливо, що після мутагенезу на мільйон клітин зустрінеться одна з генетичними відхиленнями, які дозволять їй вижити у жорстких селективних умовах. Клітина формує калус, який, у свою чергу, дає початок рослині-регенеранту.

Таким чином, користуючись способом селекції мікроорганізмів, в умовах ін вітро на селективних середовищахвідбирають клітини з мутантними генотипами, а потім одержують з них рослини, що стійкі до конкретного селективного фактора. Такий шлях селекції дозволяє відносно швидко одержувати нові форми рослин.

Оснвні етапи одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні:

1. Відбір об’єкту для мутагенезу – калусні, суспензійні культури, ізольовані протопласти;
   
2. Обробка об’єкту мутагеном (фізичні фактори – температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.;
   
3. Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах;
   
4. Перенесення суспензії у селектиивні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.);
   
5. Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах;
   
6. Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів;
   
7. Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу;
   
8. Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами;
   
9. Висадка рослин у грунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість.
   

2. Об’єктом для мутагенезу і селекції можуть бути калусні, суспензійні культури або ізольовані протопласти. Вибір об’єкту залежить від наявності розробленої технології стосовно до конкретної культури, а також від кінцевої мети дослідження.

^ Калусна тканина – доступний матеріал, який відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділену калусну тканину, що не втратила регенераційної здатності (тема: «регенерація рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу»). Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, (стійких до фітозахворювань) і стресових факторів (Левенко Б.О., 1991).

^ Клітинна суспензія – це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація об’єктів забезпечується такими способами:

• Культурою клітин, які занурені у рідке поживне на качалках ротаційного або шейкерного типу (накопичувальне культивування);
  
• Вирощуванням шматків калусуна містках-підтримках з фільтрувального паперу.
  

Більшість суспензійних культур одержують шляхом перенесення шматочків пухкої калусної тканини на рідке поживне середовище, яке постійно перемішується. Швидкість обертання кругової качалки повинна бути у межах 30-150 об/хв з амплітудою обертання 2-4 см. Через певний проміжок часу процес зупиняють; системі дають відстоятись і піпеткою (шприцем) відбираютьверхній шар суспензійної культури клітин. Для вилучення великих за розміром агрегатів клітин існує спосіб фільтрування культури крізь найлонове сито. В процесі субкультивування клітини проходять наступні послідовні фази:

1. – латентну або лаг-фазу;
   
2. – експотенціальну (логарифмічну) фазу;
   
3. – лінійну фазу;
   
4. – стаціонарну фазу;
   
5. – фазу загибелі клітини.
   

Накопичувальні суспензії, як правило, культивують до стаціонарної фази росту, що у більшості випадків складає тривалість пасажу 21-28 днів. Після нанесеня суспензії на сітку Горяєва або Фукса-Розенталя клітини підраховують.

Широкі можливості для клітинної селекції відкривають технології ізольованих протопластів (тема: «одержання та культивування протопластів»). У великих однорідних популяціях гаплоїдних або диплоїдних протопластів проводять кількісні дослідження мутагенезу соматичних клітин, аналізують експресію індукованих фенотипових змін на клітинному і організменому рівні.

Основними вимогами, що ставляться до модельних об’єктів у клітинній селекції є:

• швидкий ріст у культурі ін вітро,
  
• збереження регенераційної здатності,
  
• невелика кількість хромосом,
  
• наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів, клітин,
  
• існування справжніх гаплоїдів,
  
• короткий життєвий цикл рослин (Сидоров В.А.,1990).
  

3. Спадкова передача ознак від батьківських клітин своїм нащадкам – процес консервативний, але ця консервативність не є абсолютною. У деяких випадках мають місце помилки, в результаті чого структура хромосом або послідовність нуклеотидів ДНК дочірних клітин стає іншою. Ці раптові зміни спадкового матеріалу називають мутаціями. Клітини або організми, які є носіями змінених генів і відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів, так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК (мітохондрії, хлоропласти).

Розрізняють такі типи мутацій:

1. ^ Генні, або точкові, мутації – спадкові зміни гена, які найчастіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. Мутантні гени є переважно рецесивними.
   
2. Хромосомні мутації – одна або декілька хромосом виявляють структурні зміни, що викликано розривами та перебудовами хромосомного матеріалу.
   
3. Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінамикількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії (кратне збільшення числа хромосом).
   
4. Плазмонні мутації виникають внаслідок можливих мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.
   
5. Пластидні мутації характеризуються змінами пластид хлорофільних зерен (білоплямистість, строкатолистість у зелених рослин)
   

Мутагенез – процес виникнення мутацій під впливом ріхних фізичних і хімічних мутагенних факторів.

Серед хімічних супермутагенів ін вітро використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів). Найбільш поширені супермутагени:

• етилметансульфонат (ЕМС);
  
• диметилсульфонат (ДМС);
  
• метилметансульфонат (ММС);
  
• етиленмін (ЕМ) та ін.
  

Розчини мутагенів готують, як правило, на середовищі для культивування і додають до суспензії клітин. Через певний час клітини промивають середовищем від мутагенів і ресуспензують у свіжому середовищі. Після 4-7 днів інкубаційного росту клітини знову промивають і ресуспензують до необхідної щільності. Спектр дії хімічних супермутагенів дуже широкий – від генних мутацій до різноманітних хромосомних перебудов.

Поряд з хімічними мутагенами в експерементах з культурами клітин широко використовують іонізуюче (рентгенівське, гама-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин вченими одержані пігментдефектні лінії дурману і петунії, хлорстійкі лінії тютюну.

Загальна методологія відбору мутантів ін вітро складається з таких етапів:

1. Селекція необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні.
   
2. Регенерація з клітин рослин.
   
3. Експресія мутаційних змін на рівні цілих рослин-регенерантів.
   

Вибір часу для проведення селекції залежить від кількості клітин у вихідних колоніях, типу мутацій, стадії клітинного циклу, числа поділів мутантних клітин до початку селекції.

Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні можна класифікувати так:

• Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний мутантний тип клітин;
  
• Непряма (негативна) селекція. Грунтується на вибірковій загибелі клітин дикого типу та виживанні метаболічно неактивних клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;
  
• Візуальна селекція та неселективний відбір, коли ідентифікація лінії серед всієї популяції клітин відбувається візуально або за допомогою біохімічних методів;
  
• Тотальна селекція, яка передбачає індивідуальне тестування всіх клітинних клонів.
  

Пряма селекція – є найбільш поширений метод виділення мутантів стійких до антибіотиків, гербіцидів, токсинів та ін. антиметаболітів.

4. Клітинна селекція – процес зростаючого домінування в культурі клітин певного типу, який цікавить дослідника. Це відкриває широкі можливості клітинної селекції при вирішенні багатьох теоретичних і практичних питань біологічної і сільськогосподарської науки. Наприклад, якщо шляхом мутагенезу і селекції відібрати клітину, стійку до засолення або гербіциду, то і одержана з неї рослина-регенерант також повина бути стійка до цього фактора.

За допомогою методів клітинної селекції вже одержано багато біологічних об’єктів, серед яких:

• Картопля, яка стійка до кільцевої гнилі;
  
• Стійкі до механічного збирання томати;
  
• Цукрова тростина із стійкістю до склероспоріозу, борошнистої роси та підвищеним вмістом цукру;
  
• Калус пшениці, який витримує температуру - 40ºC (перспективний напрямок робіт з зимостійкості злакових).
  

На сьогодні більшість експерементів проводяться на модельних об’єктах. Проте саме їх використання дозволяє розрробити тонкі методи селекції різних різних мутантів, визначити можливості клітинної селекції при створенні нових біотехнологій у таких напрямках:

• одержання та вивчення хлорофілдефектних мутантів;
  
• маркірування сільськогосподарських культур і використання їх у подальших генетично-селекційних дослідженнях;
  
• одержання більш збалансованого амінокислотного складу білка зернових культур;
  
• регуляція метаболічних шляхів РНК і ДНК в клітинах;
  
• використання спецефічних інгібіторів процесів фотодихання і біосинтезу поліамінів як селективних факторів при клітинній селекції;
  
• селекція мутантів, стійких до дії гербіцидів, засолення, посухи, радіації, екстремальних температур і патотоксинів;
  

Підводячи деякі підсумки, можна стверджувати, що одержання нових генотипів шляхом клітинної селекції – реальність, яка потребує подальшого вивчення і більш широкого застосування на практиці.


5. Кріобіологія (від грецьк. kryos – холод, мороз, лід) – розділ біології, який вивчає дію на живі системи низьких та наднизьких температур (від 0 ºC до абсолютного нуля). Кріостійкість клітин, тканин і органів рослин, їх природний та штучний захист від кріопошкоджень стає актуальною проблемою з теоретичної і практичної точки зору. Це пов’язано з необхідністю збереження генофонду елітних, рідкісних і зникаючих рослин, а також клітинних штамів-продуцентів, які складають основу біотехнологічних виробництв лікарських, харчових та біологічно активних речовин.


Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation) застосовується для позначення складного багатоетапного процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його парів (- 150ºС). Позитивність глибокого заморожування полягає в тому, що при температурах, близьких до - 196 ºС, фактично повністю зупиняються процеси метаболізму клітин і тим самим зберігається їх генетична і епігенетична характеристика. Це дозволяє зберігати і потенційно використати навіть через сотні роківнеобхідний генотип, який буде знаходитись у кріогенному банку рослин.

Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування –зберігання – розморожування) складається з таких етапів:

• підготовка об’єкту,
  
• додавання кріопротектора,
  
• заморожування в певному режимі,
  
• зберігання в рідкому азоті,
  
• розморожування,
  
• видалення кріопротекторів (відмивка),
  
• рекультивація (для клітин),
  
• регенерація цілих рослин.
  

Найбільш відповідальним етапом кріозбереження вважається процедура заморожування. Цей процес відносно простий для об’єктів здуже низьким вмістом води (пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах. Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин великого розміру. Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до - 40 ºС. Присутність кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже на поверхні у розчині.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини-кріопротектори: диметилсульфоксид(ДМСО), поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних культур ін вітро здійснено майже для 70 видів рослин, половина з яких – меристеми. Вченими вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Активно проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин. Таким чином, захист і збереження рослинних ресурсів являє собою гідну задачу для біотехнології.

Лекція 8.

Тема: Генна іеженерія рослин.

1. Історія становлення та сутність генної інженерії;
   
2. Інструменти генної інженерії та їх використання;
   
3. Методи переносу чужорідних генів в рослини;
   
4. Проблеми, досягнення і перспективи генної інженерії.
   

1. Генну інженерію можна визначити як систему штучного конструювання рекомбінантних (гібридних) ДНК і введення їх в живий організм з метою одержання спадкових змін. Іншими словами, сутність генної інженерії складає цілеспрямоване переміщення окремих генів з одного генетичного оточення в інше. У результаті спадкова інформація організму змінюється, йому надаються нові генетичні і, відповідно, біохімічні та фізіологічні властивості, корисні для людини. Одержаний в результаті таких маніпуляцій організм позначається як трансгенний.

У науковій літературі використовуються два терміни — генна інженерія і генетична інженерія, які вважаються синонімами. історія становлення цього напрямку пов'язана із кінцем 60-х - початком 70-х років, коли Дж.Беквіс з колегами виділили "чистий" ген - галактозидази Е.соli, а в лабораторії Г.Корани був синтезований хімічним шляхом ген аланінової т-РНК дріжджів. У дослідників з'явилась можливість маніпуляції з генами (введення їх або замша на інші).

Формально народженням генної інженерії як самостійної дисципліни можна вважати грудень 1972 р., коли Поль Берг із співробітниками (США, Стендфорський університет) сповістили про створення першої рекомбінантної молекули ДНК. Ця молекула складалася з фрагментів ДНК вірусу SV-40, бактеріофагу А, і генів E.соli. Перші експерименти по перенесенню чужорідних генів у рослину датуються 1980 роком.

Деякі дослідники висловлюють побоювання щодо використання генної інженерії. Засновник молекулярної генетики Дж.Уотсон виступив із проханням заборонити роботи з генної інженерії, аналогічно, як у свій час

Роберт Оппенгеймер, батько атомної бомби, виступав проти створення цієї страшної зброї. У 1974 році було накладено добровільний мораторій на деякі види досліджень з генної інженерії, проте у 1975 році на міжнародній Асилморській конференції у США мораторій було відмінено, бо очікувані прибутки від генної інженерії перевищують можливу шкоду.

Чим викликані побоювання дослідників?

Генна інженерія має можливість долати генетичні бар'єри між організмами, які до цього не вступали у генетичний контакт. Людина починає створювати нові генетичні системи, властивості яких неможливо передбачити. Ступінь ризику обумовлений тим, що основний об'єкт досліджень - мікроорганізми, які мають широку природну розповсюдженість, — швидко розмножуються і легко обмінюються генетичною інформацією. Гіпотетично існує можливість синтезувати форми з новими генетичними якостями, що раніше не зустрічались в природі і проти яких людина виявиться безсилою, Наприклад, введення у кишкову паличку Е.соli генів стійкості до антибіотиків або утворення токсинів. Жах-ливий прогноз наукових фантастів відносно можливості введення генів ботулінічної палички у плазміди Е.соli, що призведе до створення страшної бактеріологічної зброї. Неприємні думки викликають роботи з включен­ням у плазміди генів злоякісного переродження клітин (онкогени).

Навіть проста недбайливість експериментатора або його некомпетентність можуть привести до непередбачених наслідків. Крім того, не виключена можливість спрямованої селекції шкідливих для людства генних рекомбінацій (своєрідної біологічної ядерної зброї). Виробництво бактеріологічної зброї, на відміну від атом­ної або водневої бомби, не потребує великих капіталовкладень, енергетичних витрат і може бути замасковане будь-якою фірмою, що виготовляє вакцини або гормони.

Деякі вчені розглядають генну інженерію більш оптимістично, тому що вважають неможливим виникнення глобальних потрясінь (клітини і віруси еволюційно існують вже мільярди років разом). Кишечник людини вже багато тисячоліть є чудовим хемостатом з ідеальними умовами співіснування мікроорганізмів з різними фрагментами ДНК. Дискусія вже закінчилась, але науку неможливо зупинити. Генна інженерія являє собою центральний шлях розвитку теоретичних і практичних проблем генетики і селекції мікроорганізмів, рослин і тварин. Не заперечуючи присутності еле-ментів ризику, вчені вимушені визнати необхідність генетичного конструювання організмів при дотриманні суворих заходів обережності.


2. Для того, щоб штучним шляхом надати будь-якому організму нові властивості, необхідно ввести у нього новий ген або трупу генів, які будуть там працювати синтезувати свої білки.

Гени одержують одним із трьох способів: безпосереднім виділенням з природного матеріалу, шляхом хімічного синтезу або копіюванням інформаційних РНК для одержання комплементарних ДНК (ензиматичний метод). Ген, тобто певну ділянку ДНК, "впізнають" і "вирізають" з цілої молекули ДНК за допомогою спеціальних рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз). У нинішній час відомо понад 500 рестриктаз, що ферментативно розривають дволанцюгову ДНК лише у тому унікальному сайті (місці) нуклеотидної послідовності, який специфічний тільки для конкретної рестриктази.

Наприклад, якщо сайт впізнавання - ААТ (і комплементарний йому - ТТА), то такий розрив відбувається у ланцюгах ДНК з обох протилежних кінців цих послідовностей.

Два розриви в однакових позиціях комплементарних ланцюгів утворюють на кінцях фрагменту так звані "липкі" кінці. Взаємно комплементарні одноланцюгові фрагменти таких кінців можуть знову з'єднуватись і відновлювати двоспіральну структуру за рахунок міжланцюгових водневих зв'язків. Процес з'єднання в єдину структуру фрагментів, що розрізані рестриктазами, здійснюють інші ферменти – лігази.

Таким чином, якщо користуватись генноінженерним жаргоном, то молекулярними "ножицями" -рестриктазами - вирізають гени, а "голками " - лігазами -їх зшивають (з'єднують). Ці ферменти не мають видової специфічності і тому фрагменти ДНК різного походження можна об'єднувати у будь-які послідовності. Рестриктази однаково "ріжуть" ДНК бактерій, вірусів, рослин, тварин або людини.

Головне правило - рестриктаза повинна впізнати специфічну для неї ділянку в молекулі ДНК. В природі рестрикційні ендонуклеази захищають клітину від сторонньої дії ДНК, яку вони відрізняють від своєї і розщеплюють на фрагменти, тобто обмежують дію чужорідної генетичної інформації (анг. restriction - обмежуdати, закінчувати).

Як виділеному гену потрапити в клітину і почати гам працювати?

Для цього використовують