Совершенствование ранней диагностики туберкулеза животных
| Вид материала | Автореферат |
- Сдиссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке фгун московский нии эпидемиологии, 946.72kb.
- Современные аспекты клиники и диагностики костно- суставного туберкулеза, 78.65kb.
- Тема №1: Рентгенологические методы диагностики ту- беркулеза. Лабораторные методы диагностики, 66.71kb.
- Обструкция пиелоуретерального сегмента у детей раннего возраста (принципы пре- и ранней, 375.81kb.
- Лекции на 4 курсе, 7.35kb.
- Комплекс, туберкулёзный менингит/. Формы туберкулёза у взрослых / очаговый, инфильтративный,, 12.68kb.
- Темы практический занятий и лекций Тематический план лекций по фтизиопульмонологии, 162.07kb.
- Индивидуальный план прохождения интернатуры по фтизиатрии Место работы, 144.75kb.
- Очаг туберкулеза, 63.86kb.
- Тема №1: Клиническая классификация туберкулеза, 75.16kb.
На правах рукописи
Полякова Ольга Николаевна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ
ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Новочеркасск - 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении
Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный
институт Российской академии сельскохозяйственных наук
^ Научный руководитель: Доктор ветеринарных наук, профессор
Дубовой Борис Лаврентьевич
Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук Попов М.А.
Доктор ветеринарных наук,
доцент Хабузов И.П.
^ Ведущая организация: ГНУ Прикаспийский зональный научно-
исследовательский ветеринарный институт
Россельхозакадемия
Защита диссертации состоится 24 марта 2011 года в 14.00 часов
на заседании диссертационного совета Д 006.106.01 при Государственном научном учреждении Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук.
346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Северо-Кавказский зональный Научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии – 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0.
Автореферат разослан « ___» « ___________» 2011 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета, д.б.н. А.М. Ермаков
^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Борьба с туберкулезом животных – важнейшая проблема. Ликвидация туберкулеза животных имеет не только ветеринарное, но и экономическое и эпидемиологическое значение.
Наиболее важным в системе противотуберкулезных мероприятий является своевременное выявление зараженных животных и удаление их из стада как источника возбудителя туберкулеза.
От момента заражения до появления первых клинических признаков туберкулеза может пройти несколько месяцев и даже лет. При использовании метода аллергической диагностики отмечаются случаи обнаружения реагирующих на туберкулин животных, у которых не удается подтвердить наличие болезни. Объясняют появление таких реакций на туберкулин сенсибилизацией организма животных атипичными и паратуберкулезными микобактериями, заражением микобактериями птичьего вида, наличием некоторых паразитарных болезней и другими причинами. Изучением неспецифических реакций занимались много авторов (А.И. Кузин (1992г.), А.С. Донченко (1987г.), Г.А. Юдин (1990г.), М.А. Сафин (1992г.), Д.Д. Новак (1990г), О.В. Мартма (1978г.), А.Х. Найманов (2009г.), А.Н. Шаров (2000г.), Л.И. Ходун (1987), В.М. Харитонова (1983), А.М. Падалица (1998г.) и др.).
В связи с этим при постановке диагноза на туберкулез особенно важна дифференциация специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.
Одной из важнейших задач профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных является совершенствование диагностики, так как существующие методы не обеспечивают обнаружение больных животных в начальной стадии болезни.
Проблема совершенствования диагностики туберкулеза животных имеет своей целью поиск способа ранней доклинической диагностики болезни и решения ряда задач, связанных с дифференциальной диагностикой туберкулеза, туберкулиновых реакций, вызванных сенсибилизацией организма атипичными микобактериями и птичьим видом. Поэтому необходим способ диагностики, который в кратчайший срок поможет выявить инфицированное и больное животное и предотвратить неоправданный и необоснованный убой высокопродуктивных животных.
^ Цель исследования - разработать способ ранней диагностики туберкулеза животных и дифференциации специфических и неспецифических реакций на внутрикожное введение туберкулина.
Достижение намеченной цели осуществлялось решением следующих задач:
1) определить рабочую дозу аллергена;
2) изучить специфичность и активность реакции лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) in vitro с аллергенами: ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ;
3) исследовать возможность использования реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) для дифференциации специфических и неспецифических реакций у положительно реагировавших на туберкулин коров.
^ Научная новизна. Разработан способ ранней диагностики туберкулеза, позволяющий в течение суток после заражения выявить инфицированное животное и дифференцировать туберкулиновые специфические реакции от неспецифических. Использование реакции специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ позволило выявить неспецифическую сенсибилизацию организма, вызванную атипичными микобактериям.
Научная новизна подтверждена патентом на изобретение №2366454 «Способ ранней диагностики туберкулеза животных».
^ Основные положения, выносимые на защиту:
1. Ранняя диагностика туберкулеза животных.
2. Дифференциация туберкулиновых реакций.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», ГНУ Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН в 2006-2010 гг. и на всероссийских и международной научно-практических конференциях гг. Махачкала, Казань, Новочеркасск.
^ Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по эпизоотологии в ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», проходят апробацию в областной ветеринарной лаборатории, СББЖ г. Новочеркасска, СПК «Рассвет», Матвеево-Курганского района, ОАО «Южное», Сальского района и СПК «Советинский», Неклиновского района, Ростовской области.
^ Публикации по теме. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 научных работ, три из них - в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ и патент РФ на способ диагностики.
^ Практическая значимость. Полученный научный материал позволяет обнаружить инфицированное животное в первые сутки после заражения и отличить положительные неспецифические туберкулиновые реакции, вызванные атипичными и птичьими микобактериями от специфических, что имеет важное практическое значение для сохранения животных с неспецифическими туберкулиновыми реакциями. РСЛЛ рекомендуется применять при ретроспективной диагностике туберкулеза и дифференциальной диагностике специфических и неспецифических реакций на введение ППД–туберкулина для млекопитающих при внутрикожной туберкулиновой пробе.
^ Структура и объем работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. В диссертации приведены 28 таблиц. Список литературы включает 264 источника, в том числе 58 иностранных авторов.
^ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований. Работу проводили на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», в учхозе «Донское» (ДонГАУ, пос. Персиановский), в лаборатории ГНУ СКЗНИВИ, в промышленном районе города Новочеркасска, в хозяйствах Матвеево-Курганского, Неклиновского и Сальского районов Ростовской области.
Для проведения опытов отобрали животных (крупный рогатый скот, свиней, собак и кроликов), у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. Контрольную группу сформировали для сравнения с опытной для доказательства специфичности реакции. Каждая опытная и контрольная группа состояла из пяти животных.
В процессе выполнения работы изучали гематологические показатели свежей крови (количество лейкоцитов) и реакцию специфического лизиса лейкоцитов крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов.
Животных опытных групп разделили на пять групп в зависимости от дозы вводимой вакцины, чтобы определить интенсивность реакции. После введения животным опытных групп живых микобактерий вакцины БЦЖ, а животным контрольных групп вакцины против бруцеллеза шт.82 брали кровь. Кровь от животных при каждом заборе делили на опытные и контрольные пробы. Контрольные пробы - кровь с добавлением 3,8% раствор цитрата натрия и физиологическим раствором, опытные пробы – кровь с добавлением 3,8% раствора цитрата натрия с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.
В опытных и контрольных пробах подсчитывали количество лейкоцитов, чтобы в последующем определить процент лизиса лейкоцитов по формуле.
Подбор рабочей дозы аллергенов выполняли с кровью животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы, выбирая дозу, при которой, процент лизиса лейкоцитов был не более 10. Предположительный поиск аллергена находился в дозе от 0,05 до 0,15 мл.
Для постановки реакции специфического лизиса лейкоцитов использовали существующую методику определения количества лейкоцитов в крови. Подсчитывали количество лейкоцитов в опытных и контрольной пробах, рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле.
В опытную лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу аллергена 0,05мл. Контрольную лунку с кровью заполняли в том же объеме, но с физиологическим раствором вместо аллергена.
Пробы крови с туберкулинами, КАМ и физиологическим раствором инкубировали в термостате в течение 2 часов при +37°С, периодически легко встряхивая. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и трех опытных лунок брали по 0,02 мл крови и переносили в лунки планшета содержащие 0,4мл жидкости Тюрка. Подсчитывали число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех пробах.
Затем рассчитывали процент лизиса лейкоцитов по формуле:
РСЛЛ = Лк-Ло * 100%
Лк
Где Лк и Ло – абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе крови при единовременном заборе.
РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и более.
При моделировании туберкулезного процесса для определения активности и специфичности реакции было сформировано шесть групп животных: пять опытных и одна контрольная.
Каждой опытной группе была введена определенная дозы живых микобактерий вакцины БЦЖ. Животным контрольной группы была введена одна доза противобруцеллезной вакцины шт. 82. В момент введения и через каждые 24 часа от животных брали кровь, делили ее на пробы с добавлением в нее 3,8% раствора цитрата натрия и диагностикумов для определения процента лизиса лейкоцитов, исследования чувствительности, активности и специфичности реакции.
В хозяйствах от реагировавших на туберкулин коров исследовали кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов. Взятую кровь делили на опытные пробы с добавлением ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц, КАМ и контрольную пробу с физиологическим раствором. Подсчитали количество лейкоцитов во всех пробах и рассчитали показатель РСЛЛ.
После исследования реакции специфического лизиса лейкоцитов был проведен контрольно-диагностический убой коров, положительно реагировавших на туберкулин и послеубойная ветеринарно-санитарная экспертиза туш и внутренних органов для обнаружения патологоанатомических изменений, характерных при заболевании и для изучения этиологии вызывающих положительные реакции туберкулиновых проб при неспецифических реакциях.
Учитывали, какая доля положительных туберкулиновых проб совпадает с результатами РСЛЛ, с патологоанатомическими изменениями, характерными для туберкулеза. Какая доля составляет совпадение положительных туберкулиновых проб, РСЛЛ и патологоанатомических изменений, несвойственных туберкулезу. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает в РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, с ППД-туберкулином для птиц и КАМ. Сколько положительных туберкулиновых проб совпадает с эхинококкозом, установленным при патологоанатолическом исследовании туш убитых с диагностической целью коров.
^ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Определение рабочей дозы ППД–туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и КАМ
Рабочую дозу диагностических аллергенов отрабатывали на цитратной крови животных, у которых физиологические и гематологические показатели находились в пределах нормы. Аллерген использовали в дозе 0,05мл, 0,1мл и 0,15мл и в таких же объемах брали физиологический раствор.
Рабочая доза не должна вызывать разрушение лейкоцитов и сенсибилизацию к аллергену, антигену и диагностическим препаратам.
В таблице показано объемное соотношение туберкулинов и КАМ с кровью и 3,8% раствором цитрата натрия.
В опытных и контрольной пробах подсчитывали количество лейкоцитов и по формуле рассчитывали процент лизиса лейкоцитов.
Реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) во всех пробах крови с аллергенами у крупного рогатого скота, свиней и кроликов доходила до 3% , у собак - до 7 %. Поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл аллергена (туберкулина или КАМ), т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15мл. И величина ее была практически одинаковой для ППД – туберкулина для млекопитающих, ППД – туберкулина для птиц и КАМ.
Рабочая доза туберкулинов и КАМ для РСЛЛ была взята 0,05 мл, так как она оказалась экономична и не вызывала разрушения лейкоцитов.
Таблица 1.
^ Определение рабочей дозы туберкулинов и КАМ.
| № пробы | 3,8 % раствор цитрата натрия (мл) | Кровь ( мл) | Опытные пробы с ППД мл., ППД пт. и КАМ (мл) | Контрольные пробы с физиологическим раствором (мл) |
| 1 | 0,05 | 0,1 | 0,05 | 0,05 |
| 2 | 0,05 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| 3 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,15 |
^ 3.2. Изучение специфичности и активности реакции специфического
лизиса лейкоцитов
3.2.1. Изучение специфичности и активности РСЛЛ крови крупного
рогатого скота при введении живых микобактерий вакцины БЦЖ
Опыт проводили в учхозе «Донское», Октябрьского района Ростовской области.
Для исследований отобрали тридцать голов молодняка крупного рогатого скота в возрасте четырех – шести месяцев.
Были сформированы пять опытных и одна контрольная группа животных. В каждую группу взяли по пять животных.
Животным опытных групп вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ в прививочных дозах: одна, три, пять, семь, десять. Бычкам контрольной группы была введена одна доза вакцины против бруцеллеза из шт. 82. Затем от всех животных брали кровь для исследования реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Сенсибилизированные микобактериями вакцины БЦЖ в организме лейкоциты приобретают повышенную чувствительность к антигену и при встрече вне организма (in vitro) с подобным аллергеном лизируются.
В день введения животным вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) вне организма в пробах крови при взаимодействии с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии сенсибилизированных лейкоцитов микобактериями БЦЖ.
Через 24 часа после введения вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах крови вне организма с ППД–туберкулином для млекопитающих уменьшалось в результате их лизиса, вызванного взаимодействием сенсибилизированных клеток с аллергеном. При введении бычкам одной иммунной дозы вакцины БЦЖ количество лейкоцитов составило 9,0·10 9 /л (Табл.№2), трех доз – 8,6·10 9 /л, пяти доз – 8,7·10 9 /л, семи доз – 8,6·10 9 /л, десяти доз – 7,1·10 9 /л (Р<0,001). РСЛЛ составила при одной иммунной дозе – 14%, трех дозах -16%, пяти дозах – 20%, семи дозах – 28%, десяти дозах – 34%. С увеличением дозы вакцины количество сенсибилизированных лейкоцитов возрастало, что и приводило к повышению лизиса.
В пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ количество лейкоцитов через 24 часа увеличивалось под воздействием вакцины БЦЖ на организм. При исследовании проб крови с физиологическим раствором вне организма от животных, которым инъецировали по одной дозе вакцины БЦЖ количество лейкоцитов (в среднем по группе) составило 10,5·10 9 /л, трех доз – 10,2·10 9 /л, пяти доз – 10,9 ·10 9 /л, семи доз – 12,0 ·10 9 /л, десять доз – 12,0·10 9 /л. Процент лизиса лейкоцитов в пробах крови с ППД–туберкулином для птиц и КАМ отсутствовал. Увеличение связано с реакцией организма на введенную вакцину и сопровождается лейкоцитозом. Сенсибилизированные БЦЖ лейкоциты не вступают in vitro во взаимодействие с неродственным аллергеном. Это указывает на специфичность РСЛЛ.
Во всех опытных группах животных количество лейкоцитов в пробах крови с физиологическим раствором, ППД–туберкулином для птиц и КАМ через 48 часов достигало максимального уровня. Число лейкоцитов (в среднем по группе) в пробах, содержащих физиологический раствор, ППД–туберкулин для птиц и КАМ составило при введении одной иммунной дозы БЦЖ 11,3·10 9 /л, трех доз – 11,6·10 9 /л, пяти доз – 12,1·10 9 /л, семи доз – 13,3 ·10 9 /л, десяти доз – 14,5·10 9 /л. И после 72 часов медленно начинало снижаться.
Таблица 2.
Количество лейкоцитов и показатели РСЛЛ в крови у крупного рогатого скота сенсибилизированных 1 дозой вакцины БЦЖ.
| Время после введения живых микобакте-рий БЦЖ (час.) | Кол-во лейкоцитов | Кол-во лейкоцитов | РСЛЛ% | ||||
| с физ. р-ром М ±m | с ППДмл. М ±m | с ППДпт. Μ±m | с КАМ Μ±m | с ППДмл. | с ППДпт. | с КАМ | |
| В момент сенсибилизации | 9,2±0,10 | 9,1±0,07 | 9,2±0,09 | 9,1±0,06 | 1 | 0 | 1 |
| 24 | 10,5±0,10 | 9,0±0,11 | 10,5±0,11 | 10,5±0,07 | 14 | 0 | 0 |
| 48 | 11,3±0,17 | 8,2±0,17 | 11,1±0,04 | 11,1±0,06 | 27 | 2 | 2 |
| 72 | 10,9±0,06 | 8,4±0,09 | 10,8±0,10 | 10,9±0,06 | 23 | 1 | 0 |
| 96 | 10,7±0,07 | 8,7±0,04 | 10,6±0,04 | 10,7±0,07 | 19 | 1 | 0 |
| 120 | 10,2±0,05 | 8,9±0,07 | 10,1±0,04 | 10,0±0,03 | 13 | 1 | 2 |
| 144 | 9,7±0,09 | 9,0±0,08 | 9,6±0,08 | 9,5±0,04 | 7 | 1 | 2 |
| 168 | 9,1±0,04 | 9,2±0,03 | 9,1±0,03 | 9,1±0,04 | -1 | 0 | 0 |
Μ ± m – среднее значение ± ошибка средней арифметической
С увеличением иммунной дозы БЦЖ количество сенсибилизированных лейкоцитов в пробах крови возрастает и при взаимодействии их in vitro с ППД–туберкулином для млекопитающих они разрушаются, в результате процент лизиса лейкоцитов увеличивается.
Через 48 часов in vitro в пробах крови с ППД–туберкулином для млекопитающих в результате лизиса происходило снижение количества лейкоцитов. При введении одной иммунной дозы БЦЖ животным число лейкоцитов при повторной встрече с аллергеном in vitro (в среднем по группе) составило 8,2·10 9 /л, трех доз – 8,0·10 9 /л, пяти доз – 7,9 ·10 9 /л, семи доз – 7,7·10 9 /л, десяти доз – 7,5·10 9 /л. Реакция специфического лизиса лейкоцитов in vitro определялась для одной иммунной дозы на животное - 27%, трех доз – 31%, пяти доз – 35%, семи доз – 42%, десяти доз – 48%. Через 72часа лизис лейкоцитов достигал при одной иммунной дозы на животное - 23%, трех доз – 28%, пяти доз – 31%, семи доз – 37%, десяти доз – 41%.
После 72 часов реакция специфического лизиса лейкоцитов снижалась во всех подопытных группах животных.
Количество лейкоцитов в крови крупного рогатого скота в последующие дни (3-7-й день) снижалось и приходило к первоначальной величине (отмеченной в день вакцинации вакциной БЦЖ) при введении одной, трех доз на 6-й день (144часа), пяти, семи доз – 7-й день (168часов) и десяти доз на 8-й день (192часа).
В пробах крови бычков, содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ показатели РСЛЛ во все дни опытов были отрицательными, лизис лейкоцитов отсутствовал. Результаты свидетельствуют о специфичности реакции.
Большой процент лизиса лейкоцитов наблюдается в пробах крови животных, содержащих ППД-туберкулин для млекопитающих, а процент лизиса лейкоцитов в пробах крови содержащих ППД-туберкулин для птиц и КАМ не превышал 3%, то есть был ниже учитываемого порога. Так как лейкоциты, сенсибилизированные микобактериями БЦЖ, in vitro под воздействием специфического родственного аллергена разрушаются.
Активность РСЛЛ характеризуется тем, что при повышении дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ от 0,05 мг до 0,50 мг на животное, увеличивается количество сенсибилизированных лейкоцитов и возрастает процент лизиса лейкоцитов.
С увеличением процента лизиса лейкоцитов в зависимости от введенной прививочной дозы вакцины БЦЖ наблюдается повышенная интенсивность и продолжительность реакции специфического лизиса лейкоцитов.
Выполненные исследования с введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ бычкам, позволили установить специфичность и активность реакции специфического лизиса лейкоцитов, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических реакций и к другому аллергену, реакция специфического лизиса лейкоцитов с ППД–туберкулином для млекопитающих, ППД–туберкулином для птиц и КАМ была отрицательной, так как количество лейкоцитов в опытных пробах крови с туберкулинами и КАМ, а также в контрольных пробах с физиологическим раствором было практически одинаковым.
Отсутствие реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных животных вакциной против бруцеллеза шт.82 с ППД–туберкулином для млекопитающих также указывает на специфичность реакции лизиса лейкоцитов, так как в пробах крови находятся лейкоциты, сенсибилизированные другим неродственным аллергеном.