Российская академия медицинских наук нии нормальной физиологии им. П. К. Анохина

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Научный консультант Валерий Викторович Шульговский Ольга Николаевна Серова Рита Ушеровна Островская Общая характеристика исследования Цель исследования Задачи исследования Научная новизна работы Теоретическая и практическая значимость работы Апробация диссертации Структура и объем диссертации Объекты и методы исследования Статистическая обработка данных. Результаты и обсуждение Эффекты белка S100b в дозе, вызывающей апоптоз. Участие червя мозжечка в консолидации долговременного привыкания АСР и условного обстановочного страха. Участие нейромедиаторных систем мозжечка в процессах угашения АСР и формирования условного обстановочного страха Сторожева З.И Сторожева З.И

Подобный материал:

• Психосоциальная проблема, направленная на восстановление физиче­ского и психосоциального, 348.21kb.
• Донозологический контроль соматического здоровья населения 03. 00. 13- физиология, 836.84kb.
• Сергиев Владимир Петрович Член-корреспондент рамн, доктор медицинских наук, профессор, 829.91kb.
• Спонсоры конференции: Фармацевтическая фирма «Санофи-Авентис», 74.5kb.
• Acta Neurobiologia Experimentalis», «Biological Theory», а также членом диссертационных, 19.24kb.
• Составители: В. В. Зинчук, 610.47kb.
• Основание Петербургской академии наук, 49.85kb.
• Котов Сергей Викторович доктор медицинских наук, профессор Савин Алексей Алексеевич, 547.92kb.
• Академия медицинских наук СССР научный совет по физиологии человека, 4592.08kb.
• Цель настоящей программы состоит в изучении строения здорового организма и жизнедеятельности, 472.25kb.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НИИ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ

им. П. К. АНОХИНА


На правах рукописи


СТОРОЖЕВА

Зинаида Ивановна

УЧАСТИЕ МЕДИАЛЬНОГО МОЗЖЕЧКА В МЕХАНИЗМАХ ПАМЯТИ И ОБУЧЕНИЯ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ОБОРОНИТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ


03.03.01 – физиология


Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва – 2010


Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина


Научный консультант:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Владимир Вячеславович Шерстнев


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Валерий Викторович Шульговский

кафедра высшей нервной деятельности

биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова


доктор биологических наук,

Ольга Николаевна Серова

институт нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН


доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Рита Ушеровна Островская

институт фармакологии им. В.В.Закусова РАМН


Ведущая организация:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН


Защита состоится 17 июня в 11.00 на заседании Диссертационного Ученого Совета Д 001.008.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН.

Адрес: 125009, Москва, ул. Моховая, д.11, стр.4.


С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке НИИ НФ РАМН.


Автореферат разослан


Ученый секретарь Диссертационного Совета

Кандидат медицинских наук

В.А. Гуменюк


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы.

Изучение функциональной роли и особенностей участия различных отделов мозга в интегративной деятельности ЦНС является одной из наиболее актуальных проблем нейробиологии. Наряду с важным теоретическим значением, разработка этой проблемы имеет неоспоримую ценность для выяснения механизмов патогенеза нервно-психических заболеваний, разработки методов их диагностики и терапии. В последнее время все возрастающее внимание в этом плане привлекает мозжечок. Накопленные в лабораторных и клинических исследованиях данные убедительно свидетельствуют, что наряду с регуляцией моторных функций этот отдел мозга вовлечен в обеспечение механизмов памяти и эмоциональных процессов (Schmahmann et al., 2007, Ito, 2005, Калашникова и др., 2000). Однако симптомы, наблюдаемые в клинике при поражениях мозжечка: нарушения абстрактного мышления, внимания, рабочей и зрительно-пространственной памяти, расторможенность и неадекватное поведение (Heath еt al., 1978, 1980, Malm, 1998, Зуева, 2003), достаточно полиморфны, а их систематизация находится на начальном этапе.

В экспериментальных исследованиях участие мозжечка в когнитивных процессах было показано в моделях оборонительного поведения, в то время как в экспериментах с использованием положительного подкрепления были получены отрицательные результаты. Наиболее подробно изучена роль данного отдела мозга в формировании, консолидации и хранении условного мигательного рефлекса (Krupa and Thompson, 1997, Medina et al., 2001). Обнаружено, что с функциями полушарий мозжечка связана инициация мигательной реакции на условный сигнал на стадии генерализации рефлекса, а также структурирование условного ответа во времени на этапе его специализации.

Значительно менее исследовано участие в когнитивных процессах медиального отдела мозжечка – червя, поражения которого наблюдаются при многих нервно-психических заболеваниях, манифестирующих в раннем возрасте (Калашникова и др., 2000, Lawyer G, et al., 2009). Имеются сведения, что с этим отделом мозжечка связано формирование долговременного угашения акустической стартл-реакции (АСР) (Leaton & Supple, 1986, Maschke. et al., 2000), а также консолидация условного обстановочного замирания (Saccetti et al., 2002, 2005) - генерализованных реакций организма, включающих оборонительную и ориентировочную составляющие, обеспечивающих формирование и выполнение более сложных и специфичных оборонительных форм поведения (Н.А. Бернштейн, 1966, Davis, 1984, Richardson and al., 1996).

Высказана гипотеза, что роль мозжечка в процессах обучения и памяти обусловлена существованием в этой структуре собственных внутренних моделей организма и окружающей среды, (Kawato M, Gomi H. 1992, Ito M., 2005). Показано, что механизмы формирования таких моделей связаны со специфичным изменением активности отдельных нейромедиаторных систем. Поступление информации через основные афферентные проекции в мозжечок - лиановидные и мшистые волокна, опосредуется возбуждающими аминокислотами. Кроме того, все большее количество данных указывает, что в формировании и функционировании внутренней модели важную роль играют т.н. «модуляторные», в частности, моноаминергические проекции (Schweighofer N., et al., 2001, 2004). С активностью ГАМК- и глицинэргических интернейронов связывают фильтрацию информации, поступающей по основным афферентным входам, а также изменение свойств внутренней модели под влиянием «модуляторных» проекций (Cavelier P. et al., 2005)

В ряде работ показано, что существенное значение в молекулярно-клеточных механизмах пластичности в мозжечке принадлежит факторам, регулирующим пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток, (Stansberg C., 2007, Bao et al., 1998, Willson ML et al., 2008). Нейродегенеративные изменения в различных отделах мозжечка выявлены при многих нервно-психических расстройствах (Steinlin M., 2008).

Таким образом, изучение роли мозжечка в процессах обучения и памяти вызывает активный исследовательский интерес. Вместе с тем, механизмы его участия в когнитивных процессах нуждаются в дальнейших исследованиях, а имеющиеся данные зачастую противоречивы. В частности, некоторые авторы (Supple et al., 1988, Fanselow, Poulous, 2005) ставят под сомнение значение медиального мозжечка для консолидации условного замирания, а изменения его активности при формировании угашения АСР, зарегистрированные в различных работах, носят противоположную направленность (Frings M., et al., 2006, Pissiota et al. 2002). Зависимость характера участия мозжечка в формировании следа памяти от интенсивности отрицательного подкрепления и уровня оборонительной мотивации была показана в модели условного замирания (Sacchetti et al., 2007).

В связи с этим, необходимым представляется одновременное изучение динамики АСР и поведения замирания при воздействии на активность червя мозжечка. Такое исследование позволяет оценить участие медиального мозжечка в механизмах пластичности и динамической интеграции ориентировочно-исследовательской, активно-оборонительной и пассивно-оборонительной реакций, а также привыкания и сенситизации, соотношение которых в значительной степени определяет характер и динамику более сложных когнитивных процессов. Однако работы, направленные на анализ формирования нескольких видов поведения при воздействии на функции медиального мозжечка в одних и тех же экспериментальных условиях, единичны, а одновременное изучение поведения замирания и АСР ранее не проводилось. Следует также отметить, что исследование нейрохимических механизмов пластичности в мозжечке в большинстве своем были выполнены in vitro. Оценка роли отдельных нейромедиаторных систем этого отдела мозга в механизмах обучения in vivo осуществлена лишь в немногочисленных экспериментах с использованием модели мигательного рефлекса (Jiménez-Díaz L et al., 2007, Paredes DA et al., 2008). Данные относительно влияния факторов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток мозжечка, на процессы обучения, в литературе отсутствуют.

Цель исследования

Целью работы явилось изучение нейрофизиологических и нейрохимических механизмов участия медиального мозжечка в регуляции процессов обучения

и памяти при формировании различных видов оборонительного поведения

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ участия медиального мозжечка и гиппокампа в реализациижечка и гиппокампа в реализацию безусловного (врожденного) поведения замирания, а также формировании кратковременного и долговременного привыкания АСР в условиях различного уровня обстановочного страха и тревоги.
   
2. Изучить функциональную роль медиального мозжечка в механизмах сенситизации и десенситизации АСР.
   
3. Исследовать временную динамику вовлечения медиального мозжечка в процессы консолидации долговременного угашения АСР и условного страха, вызванного воздействием обстановочных стимулов (обстановочного страха).
   
4. Исследовать изменения уровня нейромедиаторных аминокислот и моноаминов в медиальном мозжечке при кратковременном и долговременном угашении АСР, а также формировании условного обстановочного страха.
   
5. Изучить влияние экспериментально вызванных изменений активности отдельных нейромедиаторных систем червя мозжечка и модуляции процессов роста, развития и гибели клеток мозжечка на кратковременное и долговременное угашение АСР, а также формирование условного обстановочного страха.
   
6. Исследовать специфичность вовлечения отдельных нейромедиаторных систем червя мозжечка в механизмы консолидации долговременного угашения АСР и условного страха.
   

Положения, выносимые на защиту:

1. С активностью медиального отдела мозжечка (червя) связаны механизмы реализации врожденного поведения замирания при изменении обстановочной афферентации.
   
2. На различных этапах формирования приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации медиальный мозжечок принимает участие в процессах кратковременной и долговременной памяти, обеспечивающих выбор адекватной стратегии поведения на основе интеграции генерализованных пассивно-оборонительных, активно-оборонительных и ориентировочных реакций.
   
3. При отсутствии подкрепления медиальный мозжечок вовлечен в механизмы долговременной десенситизации, обеспечивающие достижение оптимального уровня активно-оборонительного поведения.
   
4. Специфичное вовлечение червя мозжечка в обеспечение отдельных форм оборонительного поведения обусловлено избирательными и разновременными изменениями активности нейромедиаторных систем различной эргичности в этом отделе мозга:
   

- с активностью глутаматэргических синаптических процессов, опосредующих сенсорную информацию, приходящую по мшистым волокнам, связано формирование долговременного угашения ориентировочно-исследовательской составляющей АСР;

- серотонинергические проекции в кору медиального мозжечка и ГАМК-глицинергические тормозные интернейроны участвуют в формировании долговременного угашения оборонительной составляющей АСР, а также в формировании обстановочного пассивно-оборонительного поведения замирания;

- механизмы консолидации долговременного привыкания оборонительной составляющей стартл-реакции связаны со снижением активности серотонинергической системы;

- активность тауринэргической системы сопряжена с механизмами кратковременной сенситизации и кратковременного привыкания, а также долговременной десенситизации и долговременного растормаживания стартл-реакции.

5. Участие медиального мозжечка в системных механизмах приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации связано с обеспечением процессов предпусковой интеграции возбуждений на стадии афферентного синтеза, а также с формированием и функционированием акцептора результата действия.

Научная новизна работы: Впервые получены доказательства участия медиального мозжечка в реализации врожденного пассивно-оборонительного поведения замирания при изменении обстановочной афферентации, а также в обеспечении кратковременного привыкания и кратковременной сенситизации генерализованной активно-оборонительной реакции - АСР. Получены ранее неизвестные результаты об особенностях участия червя мозжечка в механизмах сенситизации АСР обстановочными стимулами. Установлено, что вовлечение медиального мозжечка в обеспечение сенситизации АСР реализуется при более низком уровне обстановочного страха и более высокой активно-оборонительной мотивации в сравнении с участием гиппокампа в этом процессе.

Продемонстрировано участие медиального мозжечка в обеспечении процессов долговременной памяти при десенситизации и растормаживании ориентировочной составляющей генерализованной активно-оборонительной реакции - АСР.

Показано, что с функциями медиального мозжечка связаны процессы консолидации долговременного привыкания АСР. Документирована специфичность и временная динамика вовлечения мозжечка в консолидацию привыкания ориентировочной и оборонительной составляющих АСР: через 5 минут после обучения мозжечок участвует в консолидации долговременного угашения оборонительной составляющей АСР, обусловленного процессами десенситизации; спустя 2 часа - в консолидации долговременного привыкания ориентировочно-исследовательской составляющей АСР и условного обстановочного замирания.

Характеризованы особенности участия червя мозжечка в регуляции периодических колебаний амплитуды АСР.

Впервые изучена динамика содержания нейромедиаторов в коре медиального мозжечка на различных стадиях формирования долговременного привыкания АСР и поведения замирания, а также влияние на эти процессы апплицируемых на червь мозжечка агонистов и антагонистов, отдельных нейромедиаторов. Выявлено избирательное вовлечение серотонин- и ГАМК-эргических систем червя мозжечка в формирование условного обстановочного замирания и долговременного привыкания оборонительной составляющей АСР, а также участие глутамат- и таурин-эргических систем в механизмах долговременного угашения ориентировочной составляющей АСР.

Обнаружено нейропротекторное влияние пептида HLDF6 в условиях клеточной гипоксии червя мозжечка.

На основании полученных результатов выдвинуто положение об интегративной роли медиального мозжечка в обеспечении оптимального соотношения ориентировочных, пассивно-оборонительных и активно-оборонительных реакций на различных стадиях формирования приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации. Обосновано представление о том, что с функциями медиального мозжечка связаны механизмы афферентного синтеза и акцептора результата действия. Специфичное вовлечение червя мозжечка в обеспечение отдельных форм оборонительного поведения обусловлено избирательными и разновременными изменениями активности его нейромедиаторных систем.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют и углубляют имеющиеся теоретические представления об участии мозжечка в процессах памяти и обучения. Сформулированные и обоснованные в работе положения о функциональном значении, нейрофизиологических и нейрохимических механизмах вовлечения медиального мозжечка в системную организацию различных видов оборонительного поведения вносят вклад в дальнейшее развитие исследований закономерностей участия этой структуры в интегративной деятельности ЦНС в норме и при развитии психопатологических состояний. Результаты, полученные при изучении динамики АСР и поведения замирания, уточняют современные взгляды на структуру и механизмы кратковременной и долговременной памяти при формировании оборонительного поведения

Оригинальный комплекс методических приемов, использованный в работе, может найти применение в лабораторных и клинических исследованиях, особенностей участия различных отделов мозга в обеспечении когнитивных функций, а также эмоциональных состояний в норме и патологии.

Полученные научные факты могут быть использованы в лекционных курсах по физиологии, нейробиологии и нейрохимии в вузах биологического, медицинского и психологического профиля.

Данные о нейропротекторных эффектах пептида HLDF6 в условиях клеточной гипоксии явились основой для разработки нового лекарственного препарата, обладающего комбинированным нейропротекторным и ноотропным действием, находящегося на данный момент в стадии доклинических испытаний.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на 1 Европейском форуме по нейронаукам (1^st Forum of European Neurosciеnce) (Берлин, 1998 г.), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова, (Москва, 1999 г.), научных конференциях «Интеграция: НИИ – ВУЗ - клиника» ( Москва, 2000, 2001 гг.), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов. (Москва 2003 г.), 6-ом конгрессе IBRO (Прага, 2003 г.) Всероссийской конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» ( Москва, 2005), Международном симпозиуме «Гиппокамп и память»

(Пущино, 2006), Всероссийском съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (С.-Петербург-Колтуши, 2008 г.) итоговых сессиях НИИ НФ им. П. К. Анохина (Москва, 2004, 2005, 2006). Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании лаборатории функциональной нейрохимии и лаборатории мотивации НИИ НФ им. П.К. Анохина РАМН 03 июля 2009 г.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, из них 19 - статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации: Работа изложена на 263 страницах, включает разделы: введение, обзор литературы, характеристика методов исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 42 рисунками и 27 таблицами. Список цитируемой литературы включает 540 источников, 521 из них на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на крысах-самцах Вистар весом 250-300 г., содержавшихся по три в клетке при температуре 24 ^о С и световом цикле 12/12 в условиях свободного доступа к корму и воде. Время проведения опытов с 11.00 до 15.00 часов

Изучение кратковременного и долговременного привыкания АСР с одновременной регистрацией поведения замирания проводили в камере из плексигласа размером 15х10х17 см., которую устанавливали на платформу, оснащенную тензодатчиком, соединенным с компьютером для фиксации амплитуды АСР. Подача звуковых стимулов осуществлялась усилителем мощности 100Y-101 (Россия) через динамик. Параметры звукового сигнала (широкополосный шум длительностью 500 мс и громкостью 110ДБ) контролировались персональным компьютером. Регистрацию времени замирания - полного отсутствия движения животного, включая движение вибрисс, - осуществляли визуально. За 24 часа до начала обучения крыс адаптировали к экспериментальной камере в течение 5 мин. В ходе сеанса обучения животных помещали в камеру и в течение 5 мин регистрировали реакцию замирания, затем предъявляли 10 звуковых стимулов с интервалом 20 с. Через 24 часа для оценки долговременного угашения АСР и условного замирания проводили сеанс тестирования по той же схеме. В некоторых экспериментах был использован протокол, не включавший процедуры предварительной адаптации животных к экспериментальной камере.

Блокатор натриевых каналов тетродотоксин (ТТХ) в дозе 3 нг вводили за 1 час, через 5 минут и 2 часа после обучения. Азид натрия - блокатор митохондриального комплекса IV, вызывающий клеточную гипоксию, инъецировали в дозе 2 мкг за 5 суток до обучения. Пептид HLDF6 в дозе 5 мкг вводили через 5 минут после введения азида натрия. Белок S100b в дозе 500 нг вводили за 4 часа до начала обучения. Ингибитор синтеза белка циклогексимид инъецировали в дозе 50 мкг через 5 минут, а также через 2 часа после обучения. Ингибитор синтеза РНК актиномицин D вводили в дозе 50 мкг через 5 минут после обучения. Антитела к белку A3G7 в дозе 5 мкг вводили через 2 часа после обучения. Антагонист NMDA рецепторов глутамата APV (2-амино-5-фосфовалериановую кислоту) вводили дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист АМРА рецепторов глутамата CNQX (6-циано-7~нитрохиноксалин-2,3-дион) вводили в дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист ГАМК_A/ глициновых рецепторов бикукуллин вводили в дозе 0,5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист ГАМК_Б рецепторов факлофен вводили в дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист 5НТ2 серотониновых рецепторов ритансерин инъецировали в дозе 5 мкг за 1 час обучения или за 1 час до тестирования. Все использованные в работе вещества, кроме пептида HLDF6, синтезированного в Институте биоорганической химии РАН, и антител к белку A3G7, полученных из Института медицинской и биологической кибернетики СО РАН, были приобретены в фирме «Sigma» США.

Вещества вводили через канюли, предварительно вживленные под нембуталовым наркозом по стереотаксическим координатам AP – 11,8; L 0; H -3,5, при помощи инъекционной иглы с ограничителем, соединенной виниловым шлангом с микрошприцем. Объем вводимого раствора составлял 3 мкл. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Актиномицин D и CNQX в растворяли в 0.1% диметилсульфоксиде; контрольным крысам этих серий вводили 3 мкл 0,1% диметилсульфоксида в физиологическом растворе.

При изучении эффектов подавления активности мозжечка и гиппокампа использовали ТТХ в дозе 3 нг, который инъецировали в объеме 3мкл в дорзальный гиппокамп за 1 час до обучения через предварительно вживленные канюли (по стереотаксическим координатам АР-3,5 DL±2, H-3). Контрольным животным этих серий вводили 3 мкл физиологического раствора.

Определение внеклеточного содержания нейромедиаторных аминокислот проводили методом внутримозгового диализа на свободноподвижных крысах через микродиализный U-образный зонд (мембрана типа AN-69, проницаемость до 15000 Да, "Hospal", Италия), стереотаксически имплантированный в мозжечок по координатам AP – 11,8; DL 0; H -3,5.под нембуталовым наркозом за 6 часов до начала адаптации крыс к камере. Сбор образцов диализата проводили в течение 10 минут до, во время и после сеанса обучения, а также до, во время и после сеанса тестирования. После обучения собирали 3 пробы от каждого животного, а после тестирования – 1-2 пробы. Определение содержания нейромедиаторных аминокислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией. Для деривации аминокислот к 25 мкл диализата добавляли 10 мкл о-фтальальдегид-сульфитного реактива в 0,1М боратном буфере (рН 9,5). ГАМК, аспартат, глутамат, глицин и таурин в концентрации 0,001 мг/мл в 0,1 Н НClО4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки прибора. Через 15 мин после инкубации при комнатной температуре 20 мкл раствора наносили на колонку Agilent (США) размером 4,6х250 мм с сорбентом Hypersil ODS 5 mkM (США). Регистрацию продуктов разделения проводили на флуоресцентном детекторе Agilent 1100 (США) при волне возбуждения 230 нм и волне эмиссии 392 нм/ Мобильная фаза состояла из 0,05 М фосфатного буфера (рН 5,6) с 0,025 мМ ЭДТА и 5% метанола.

При исследовании содержания биогенных аминов в гомогенате червя мозжечка животных декапитировали через 5 минут, а также через 2, 4 и 24 часа после обучения, и извлекали червь мозжечка. Определение моноаминов и их метаболитов проводили в надосадочной жидкости после центрифугирования гомогената ткани (1:20 в 0,1Н HClO4 добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия) при 10000g, в течение 10 мин методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC - 304T (BAS, WESТ LAFAYETTЕ, США), снабженным инжектором RНEODYNE-7125 (США) с петлей на 20 мкл для нанесения образцов. Изучаемые вещества разделяли на обращeннофазной колонке (3х150 мм) с сорбентом С18, 5 мкм, (МНПП «Элсико», Москва) и определяли электрохимически, используя амперометрический детектор LC-4B с ячейкой TL-5. Маточные стандарты готовили в 0,1Н HClO4 в концентрации 100 мкг/мл с добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия в качестве консерванта. Рабочие стандарты приготовляли из маточных растворов ежедневно. Подвижную фазу (рН=3,9) приготовляли следующим образом: на 1 л деионизированной воды - 5,76 лимонной кислоты, 4,72г КH2PO4, 100мг ЭДТА, 425мг ионопарного реагента октилсульфита натрия и 9% ацетонитрила.

Для определения количества клеток Пуркинье с признаками темноклеточной гипоксической дегенерации при воздействии азида натрия после окончания процедуры тестирования животных декапитировали под тиопенталовым наркозом (50 мг/кг). Мозжечок фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином. Срезы толщиной 6 микрон депарафинизировали, окрашивали гематоксилин-эозином и оценивали количество нормальных и гиперхромных клеток Пуркинье визуально под световым микроскопом. От каждого животного исследовали не менее 15 срезов. В каждом срезе анализировали 100 и более клеток Пуркинье.

Регистрацию частоты сердечных сокращений (ЧСС) при формировании долговременного угашения АСР и условного замирания осуществляли при помощи полиграфа П84-01 (Россия). Во время сеанса адаптации и 5-минутного периода перед подачей звукового стимула ЧСС регистрировали в течение 5 с через каждые 20 с, отмечая при этом состояние подвижности или замирания животного. На фоне звуковой стимуляции регистрацию проводили в течение 5 с до и в течение 5 с после подачи сигнала.

Статистическая обработка данных.

При анализе долговременного привыкания АСР оценивали индекс спонтанного восстановления реакции (Iсв) - разность амплитуд последнего ответа в день обучения и первого ответа в день тестирования (Petrinovich, 1984). Достоверное отрицательное значение индекса в группе указывает на нарушение долговременного привыкания. Для характеристики динамики АСР в течение сеансов угашения и тестирования для экспериментальных групп и индивидуальных животных проводили вычисление коэффициентов регрессии амплитуды реакции Аn от номера стимула N в уравнении Аn=A₀-bxN при обучении (b1) и тестировании (b2). Кроме того, различия в динамике АСР между группами оценивали при помощи дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures ANOVA). Был использован также t-критерий Стьюдента, непараметрические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни и непараметрический корреляционный анализ Спирмена.