Вирусные болезни и современные методы оздоровления плодовых и ягодных культур специальность 06. 01. 07 защита растений
| Вид материала | Документы |
- Комплекс мероприятий по защите сада от вредителей. Литература, 648.1kb.
- Научное обоснование создания сырьевых садов на основе генетического потенциала плодовых, 1284.76kb.
- Общая характеристика работы Актуальность темы, 398.26kb.
- Примерная программа наименование дисциплины фитопатология и энтомология рекомендуется, 313.88kb.
- Реферат по дисциплине «Биотехнология в пищевой проышленности»: Особенности производства, 313.46kb.
- Тобольский архиерейский дом в XVII 60-е гг. XVIII в. Специальность 07. 00. 02 Отечественная, 448.98kb.
- Технологии закладки и выращивания плодовых и ягодных культур Технология закладки, 657.63kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 3299.35kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 5418.2kb.
- С. Х. Аль-Шукри, Д. Н. Солихов // нефрология. 2009. Т. 13, № С. 86-91. Библиогр.:, 347.38kb.
РАСТЕНИЙ IN VITRO
С целью ускоренного размножения оздоровленных растений in vitro оптимизированы состав питательной среды и физические факторы культивирования.
7.1. Совершенствование минерального состава питательной среды
Оптимизацию минерального состава среды осуществляли на примере ежевики сорта Торнфри. На начальном этапе оптимизации подбирали лучшие формы макроэлементов и варьировали концентрацию каждого из них (либо двух компонентов) при неизменных уровнях остальных солей. Затем с применением компьютерной программы получили уравнение регрессии, которое представляло собой полином следующего вида:
у = 13,1987 – 46,2156 · х1 + 104,1263 · х2 – 127,4976 · х3 – 103,3835 · х4 + 127,6737 · х5 + 36,5167 · х12 – 29,2496 · х22 + 62,7479 · х32 + 62,3021 · х42 – 29,1671 · х52 + 16,6505 · х1 · х2 + 11,6513 · х1· х3 – 12,9154 · х1· х4 – 21,6161· х1· х5 + 21,5301· х2 · х3 – 41,6136 · х2 · х4 – 114,875· х2 · х5 + 83,0083 · х3 · х4 – 35,0364 · х3 · х5 + 20,3532 · х4 · х5, где у – число почек и побегов, х1 – уровень аммония азотнокислого, х2 – уровень калия азотнокислого, х3 – уровень кальция азотнокислого, х4 – уровень калия фосфорнокислого, х5 – уровень магния сернокислого. Значения частных функций изображены на рисунке 9, представляющем собой поверхность и показывающем число почек и побегов, образованных эксплантами ежевики, в зависимости от уровня каждого компонента в составе питательной среды для размножения.
Рисунок 9 – Число почек и побегов у эксплантов ежевики сорта Торнфри в зависимости от компонента питательной среды и его концентрации
(Р 1 – Р 5 соответствуют уровням каждого компонента).
Разработан эффективный состав среды, увеличивающий коэффициент размножения многих культур (рисунок 10, патент № 2063682). Выявлено, что для оптимизации состава среды необходимо использовать комплексный подход, сочетающий анализ функциональных зависимостей по уравнению регрессии, таблице частных функций и точечным графикам.
Чередование сред разного минерального состава оказывало благоприятное влияние на рост и развитие эксплантов вследствие вероятного усиления ювенилизации, увеличения в тканях пула активно делящихся клеток, изменений биохимического и морфологического характера. Ростовые показатели у эксплантов зависели от месяца культивирования и времени года.
Р
исунок 10 – Число почек и побегов у разных культур на среде Мурасиге и Скуга и разработанной среде на фоне гомополисахарида и 6-БАП (1 мг/л).На основании листовой диагностики NPK и анализа корреляционных зависимостей оптимизирован минеральный состав среды, что способствовало увеличению укореняемости побегов ежевики в 1,9 раза и длины корней в 1,8 раза.
7.2. Совершенствование органического состава питательной среды
Заменители агар-агара. Около 53 % стоимости питательной среды приходится на агар-агар. Поэтому значительно снизить себестоимость получаемых растений позволяет замена агар-агара на более дешевые аналоги. Наиболее перспективны, на наш взгляд, в качестве заменителей агар-агара вещества, приводящие к желатинизации среды. Предложенный нами гомополисахарид (патент № 2039428) положительно влиял на накопление сахаров в побегах растений и улучшал ростовые процессы. Применение гомополисахарида в составе среды для размножения способствовало увеличению числа образуемых почек и побегов у груши в 1,3 раза, рябины – в 1,2-1,4 раза, малино-ежевичных гибридов в 1,5-2,0 раза, малины красной – в 1,2-1,3 раза, малины черной сорта Кумберленд – в 1,3 раза, ежевики сорта Торнфри – в 2,3 раза по сравнению с агаризованной средой. При этом на среде с заменителем существенно снижалась витрификация побегов.
Регуляторы роста. На этапе размножения высокую цитокининовую активность на груше, ирге, рябине, ежевике, малине черной, жимолости проявил тидиазурон, обеспечивший увеличение числа побегов в 1,3-3,1 раза по сравнению с 6-БАП.
В отличие от узкоспецифического действия ауксинов и цитокининов, этрел стимулировал и пролиферацию побегов, и ризогенез (патенты РФ № 2095972 и № 2099935).
Препарат рибав-экстра улучшал ризогенез у микропобегов груши, ирги, рябины, ежевики, малино-ежевичного гибрида, жимолости (повышение укореняемости в 1,3-2,5 раза, увеличение числа корней в 1,5-10, 4 раза) и обеспечивал высокую приживаемость в нестерильных условиях. Выявлена эффективность препарата амбиол в сочетании с ИМК при укоренении побегов рябины, ирги, ежевики и жимолости (повышение укореняемости в 1,2-1,5 раза, увеличение числа корней в 1,2-1,6 раза).
Эффект от применения фенольных соединений зависел от их структуры, направленности органогенеза, взаимодействия с регуляторами роста, генотипа растений. На этапе размножения фенолкарбоновые кислоты, содержащие в своей структуре одну гидроксильную группу (сиреневая, феруловая, п-кумаровая) положительно влияли на пролиферацию побегов у груши, рябины, ежевики, увеличивая коэффициент размножения в 1,5-2,6 раза. Фенолкарбоновые кислоты с несколькими ОН-группами (галловая, хлорогеновая), реже – с одной ОН-группой (салициловая кислота), стимулировали ризогенез у побегов, что связано с ингибированием ауксиноксидазы и усилением действия ауксинов на процесс корнеобразования. Показана высокая эффективность применения флоридзина на этапе укоренения микропобегов груши, рябины, жимолости, ежевики, малино-ежевичных гибридов.
7.3. Изучение действия физических факторов на ускорение
микроразмножения растений
Спектральный состав света. Увеличение выхода оздоровленных растений достигается и за счет оптимизации условий освещения, в том числе подбора спектрального состава света. На этапе размножения выявлено преимущество красного (640-660 нм) и зеленого (520-550 нм) света, на этапе укоренения – красного и белого света. При культивировании на красном свету у малины черной укореняемость побегов через 20 суток превысила 70 %, что сократило период укоренения по сравнению со стандартной технологией.
Магнитно-импульсное воздействие. Магнитное поле оказывает разнообразные физиологические эффекты на растения, влияет на активность ферментов и проницаемость клеточных мембран, что приводит к повышению регенерационной способности. На этапе размножения хороший эффект обеспечивала МИО с направлением вектора магнитной индукции вдоль оси экспланта и к его основанию. При этом происходила стимуляция базального доминирования и увеличение коэффициента размножения в 1,2-1,6 раза вследствие вероятного усиления накопления цитокининов в основании эксплантов. Сочетание магнитной обработки разнонаправленными импульсами с последующим культивированием побегов на свету с долями излучения 87,5 % в красной области и 12,5 % – в синей улучшало ризогенез у ежевики и некоторых сортов жимолости.
7.4. Повышение адаптационной способности микрорастений в
нестерильных условиях и получение стандартных саженцев
Нами разработан эффективный способ адаптации, включающий культивирование побегов на среде для укоренения, содержащей оксибензойную кислоту, с последующей обработкой растений борной кислотой (патент РФ № 2160002, таблица 23). При этом наряду с повышением приживаемости улучшались ростовые процессы, что подтверждает важную роль бора в процессах лигнификации клеточных стенок, увеличении засухоустойчивости растений, обмене ауксинов и фенольных соединений.
На ягодных культурах выход стандартных саженцев в год высадки микрорастений на адаптацию составил 36-88 %, тогда как для получения стандартных саженцев плодовых культур требовалось доращивание в течение двух лет.
Таблица 23 – Приживаемость микрорастений после высадки в нестерильные условия в зависимости от концентрации борной кислоты, в %
| Концентрация борной кислоты, М | Груша Лада | Ежевика Торнфри | Малина черная Кумберленд | Малино-ежевичный гибрид Логанберри | Жимолость Нимфа |
| 0 (контроль) | 14,5 а | 64,3 аб | 80,0 а | 33,3 аб | 90,0 а |
| 1,0 х 10-4 | 12,6 а | 61,5 а | 80,0 а | 28,5 а | 90,0 а |
| 1,5 х 10-4 | 40,4 б | 78,6 б | 93,3 б | 50,0 бв | 100 а |
| 7,5 х 10-4 | 63,5 в | 100 в | 100 б | 73,3 г | 100 а |
| 1,5 х 10-3 | 45,6 б | 100 в | 97,5 б | 65,4 вг | 100 а |
| 2,0 х 10-3 | 14,3 а | 60,6 а | 78,7 а | 30,6 а | 85,0 а |
В результате проведенных исследований разработана современная научно обоснованная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов, включающая в себя усовершенствованные методы диагностики, экологически безопасные вирусологические и биотехнологические приемы производства оздоровленного посадочного материала.
Первичным этапом технологии является диагностика вирусной инфекции, осуществляемая методами ИФА, ПЦР и тестами на индикаторах. Для повышения достоверности результатов диагностики вирусологического статуса растений необходимо использовать, как минимум, 2 метода, причем желательно высокочувствительные – ИФА и ПЦР.
При получении результатов комплексного тестирования, подтверждающих безвирусный статус растений, их переводят в категорию исходных растений, от которых путем вегетативного размножения получают базисные растения.
Глава 8. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННЫХ СПОСОБОВ
ТЕСТИРОВАНИЯ И ОЗДОРОВЛЕНИЯ САДОВЫХ РАСТЕНИЙ
В системе производства сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур наиболее затратным является процесс получения базисных растений. На вирусологическую диагностику растений приходится 55-70 % трудовых и 73-91 % общих материальных затрат, требующихся для получения здоровых растений.
Себестоимость одного тест-образца при тестировании методом ИФА на 1 вирус составила 546 руб., методом ОТ-ПЦР – 631-720 руб., ОТ-ПЦР в реальном времени – 656-750 руб., на древесных индикаторах – 968 руб.
При сочетании термотерапии и культуры тканей по разработанной технологии себестоимость одного базисного растения груши снизилась в 1,6 раза по сравнению с одной термотерапией (стандарт) и в 1,4 раза по сравнению с сочетанием термотерапии и культуры тканей по традиционной технологии (таблица 24).
Таблица 24 – Экономическая оценка получения базисных растений плодовых культур в зависимости от способа оздоровления (на примере груши)
| Показатель | Способ оздоровления | |||||
| Термо-терапия (стандарт) | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей + хемотерапия | Культура тканей + магнито-терапия (разрабо-танная) | |||
| Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | |||
| Выход растений после оздоровления, шт. | 20 | 35 | 131 | 35 | 131 | 94 |
| Выход здоровых растений, % | 55,6 | 66,7 | 88,9 | 77,5 | 100 | 100 |
| Выход здоровых растений, шт. | 11 | 23 | 117 | 27 | 131 | 94 |
| Всего затрат, тыс. руб. | 169,7 | 261,3 | 901,6 | 244,8 | 884,5 | 638,5 |
| Себестоимость 1 ба-зисного растения, руб. | 12355,2 | 11215,7 | 7739,1 | 9033,8 | 6751,6 | 6792,3 |
| Затраты труда, чел.-ч./1 растение | 12,6 | 11,0 | 6,2 | 8,9 | 5,4 | 5,7 |
С учетом выхода здоровых растений, который колебался от 80 % при стандартной технологии до 98-100 % по разработанным технологиям, себестоимость одного базисного растения ежевики, полученного по предложенным технологиям, оказалась на 28-31 % ниже, чем по стандартной технологии (таблица 25). При этом снизились на 28-30 % и трудовые затраты.
Таблица 25 – Экономическая оценка получения базисных растений ягодных культур в зависимости от способа оздоровления (на примере ежевики)
| Показатель | Способ оздоровления | |||||
| Культура тканей (стандарт) | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей + хемотерапия | Культура тканей + магнито-терапия (разрабо-танная) | |||
| Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | Тради-ционная техно-логия | Разрабо-танная техно-логия | |||
| Выход растений после оздоровления, шт. | 1121 | 1121 | 1905 | 1121 | 1905 | 1513 |
| Выход здоровых растений, % | 80,0 | 87,9 | 98,0 | 93,3 | 100 | 100 |
| Выход здоровых растений, шт. | 897 | 985 | 1867 | 1046 | 1905 | 1513 |
| Всего затрат, тыс. руб. | 3498,7 | 3502,6 | 5691,7 | 3498,7 | 5687,8 | 4514,2 |
| Себестоимость 1 ба-зисного растения, руб. | 3901,3 | 3554,5 | 3048,8 | 3345,2 | 2985,7 | 2983,6 |
| Затраты труда, чел.-ч./1 растение | 7,4 | 6,8 | 5,8 | 6,4 | 5,7 | 5,7 |
Наиболее эффективными технологиями оздоровления плодовых культур и ягодных кустарников являются предложенные технологии, сочетающие культуру апексов и хемотерапию, культуру апексов и магнитотерапию.
ВЫВОДЫ
1. В результате многолетних исследований впервые разработана современная научно обоснованная технология оздоровления ряда плодовых и ягодных культур от вредоносных вирусов, включающая эффективные методы диагностики, экологически безопасные вирусологические и биотехнологические приемы получения здорового посадочного материала.
2. На основании серомониторинга в Нечерноземной зоне России установлено широкое распространение вирусов различной этиологии: в насаждениях груши – высокая зараженность латентными вирусами (28-45 %); на рябине – вирусом PNRSV (51 %); на ежевике – вирусами ArMV (25 %) и TBRV (22 %); на малине черной и жимолости – вирусом TBRV (21 и 33 %); на малино-ежевичном гибриде – вирусами RpRSV (31 %), SLRSV (28 %) и TBRV (25 %); на актинидии и лимоннике – вирусом ArMV (43 и 40 %).
3. Распространенность вирусов зависела от местоположения и возраста насаждения, происхождения сорта, способа размножения растений и условий их выращивания. С возрастом растений увеличивались концентрация вирусов в растительных тканях и количество зараженных растений в насаждении. Коэффициенты вариации зараженности вирусами PNRSV, ASPV и ACLSV были более высокими по сравнению с вирусом ASGV.
4. Вредоносность вирусных болезней обусловливалась видом вирусного патогена и сортовыми особенностями. Латентные вирусы приводили к снижению генеративной продуктивности деревьев груши на 20 %, содержания хлорофилла на 14 % и увеличению активности пероксидазы на 58 %. Вредоносность вирусов ArMV, RpRSV и SLRSV на растениях рода Rubus выражалась в снижении урожая на 71 %, длины побегов – на 40 %. Доказано ингибирующее действие вирусов на процессы органогенеза при микроразмножении растений на этапах пролиферации и укоренения побегов, а также при размножении стеблевыми черенками.
5. Оптимизация современных методов диагностики обеспечила выявляемость вирусов до 90-100 %. Способ диагностики вирусов на травянистых индикаторах с включением фенольных соединений в состав буфера для заражения повышал накопление вирусов в тканях индикаторов и увеличивал число растений с симптомами (патент РФ № 2147173). Путем добавления в буфер гидроксипроизводного бензойной кислоты улучшена экстракция вирусной РНК и повышена эффективность выявления вирусов при выполнении ИФА, ПЦР и ПЦР в реальном времени (патент РФ № 2389795).
6. Эффективность оздоровления плодовых и ягодных культур зависит от вида вируса, биологических особенностей растений, способа оздоровления, величины инициального экспланта. Высокий выход оздоровленных растений (83 % на рябине, 80 % на жимолости, 60-100 % на ежевике) достигается при сочетании суховоздушной термотерапии и культуры апикальных и латеральных меристем. Установлена закономерность по снижению эффективности оздоровления интактных растений от вирусов при увеличении размера изолируемого апекса более 1 мм. На примере культур рода Rubus доказана перспективность использования метода оздоровления микрорастений от неповирусов и вируса SLRSV.
7. Применение гидроксибензойных кислот при хемотерапии обеспечивает получение 80-100 % здоровых регенерантов груши, рябины и ежевики (патент РФ № 2233579). Эффект хемотерапии определяется структурой фенольного соединения, его концентрацией, сортовыми и видовыми особенностями, видом вирусного патогена. Наибольшую антивирусную активность проявляли салициловая, галловая и сиреневая кислоты.
8. Впервые установлено антивирусное действие импульсного магнитного поля. Разработанный метод магнитотерапии вирусов позволил оздоровить 60 % регенерантов груши от вируса ApMV, 80-100 % – от вируса ACLSV и до 100 % растений малино-ежевичного гибрида от вирусов RBDV и TBRV (патенты РФ № 2277771, 2310318). Выход здоровых растений зависел от частоты импульсов и направления вектора магнитной индукции, этиологии вируса.
9. Повышению выхода оздоровленных растений при ускоренном размножении способствовали оптимизированные состав среды, физические факторы (свет и магнитная обработка) и разработанные способы адаптации. Чередование питательных сред разного минерального состава оказывало положительное влияние на пролиферативную способность эксплантов. Использование гомополисахарида в качестве заменителя агар-агара обеспечивало повышение коэффициента размножения в 1,2-2,3 раза и выхода пригодных для укоренения побегов – в 1,9-6,5 раза (патент РФ № 2039428).
10. Фенольные соединения повышали эффективность размножения растений на этапах пролиферации, укоренения и адаптации. Фенолкарбоновые кислоты с одной гидроксильной группой (сиреневая, феруловая, п-кумаровая) стимулировали побегообразование, кислоты с несколькими гидроксильными группами (галловая, хлорогеновая) и флоридзин – ризогенез (А. с. № 1706481, патент РФ № 2111653).
11. Выявлена специфичность действия спектрального состава света и магнитно-импульсной обработки на органогенез и ускорение микроразмножения оздоровленных растений. Магнитная обработка импульсами, направленными к основанию экспланта, способствует увеличению числа побегов и их длины (патент РФ № 2222933). Обработка импульсами с чередованием векторов в двух направлениях и культивированием эксплантов на свету с долями излучения 87,5 % в красной области и 12,5 % в синей обеспечивает улучшение развития побегов и корней (патенты РФ № 2253222, 2279209).
12. Себестоимость здорового посадочного материала зависит от способа оздоровления и выхода здоровых растений. Наиболее эффективными являются технологии, сочетающие культуру апексов и хемотерапию, культуру апексов и магнитотерапию: их применение обеспечивает снижение себестоимости базисного растения в 1,2-1,8 раза по сравнению с использованием суховоздушной термотерапии или её комплекса с культурой апексов.