Вирусные болезни и современные методы оздоровления плодовых и ягодных культур специальность 06. 01. 07 защита растений
| Вид материала | Документы |
- Комплекс мероприятий по защите сада от вредителей. Литература, 648.1kb.
- Научное обоснование создания сырьевых садов на основе генетического потенциала плодовых, 1284.76kb.
- Общая характеристика работы Актуальность темы, 398.26kb.
- Примерная программа наименование дисциплины фитопатология и энтомология рекомендуется, 313.88kb.
- Реферат по дисциплине «Биотехнология в пищевой проышленности»: Особенности производства, 313.46kb.
- Тобольский архиерейский дом в XVII 60-е гг. XVIII в. Специальность 07. 00. 02 Отечественная, 448.98kb.
- Технологии закладки и выращивания плодовых и ягодных культур Технология закладки, 657.63kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 3299.35kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 5418.2kb.
- С. Х. Аль-Шукри, Д. Н. Солихов // нефрология. 2009. Т. 13, № С. 86-91. Библиогр.:, 347.38kb.
САДОВЫХ РАСТЕНИЙ ОТ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
В ходе многолетних исследований нами изучены и усовершенствованы различные методы оздоровления садовых растений от вирусов: суховоздушная термотерапия, культура меристем, хемотерапия и магнитотерапия.
6.1. Особенности сортовой устойчивости при проведении
суховоздушной термотерапии
Суховоздушная термотерапия на груше была малоэффективной: после термообработки в течение 82 дней удалось оздоровить от двух вирусов (ACLSV и ASGV) 56 % растений, а с учетом вероятно зараженных растений – всего 11 %. Некоторые прививки сортов Память Жегалова, Кафедральная и Москвичка оказались свободными от вирусов, а некоторые – зараженными. Недостаточно высокий выход здоровых растений связан с термостабильностью данных вирусов.
В наших опытах показано, что можно успешно проводить суховоздушную термотерапию заокулированных подвоев груши. В условиях термокамеры из окулировки развивается побег длиной 30-40 см, с которого берут верхушки для введения в культуру тканей.
При проведении суховоздушной термотерапии устойчивость растений к высоким температурам определялась видовыми и сортовыми особенностями.
Изученные сорта рябины по устойчивости к высокой температуре мы разделили на 2 группы: 1) с низкой устойчивостью, которые почти не дают приростов и погибают через 2-3 недели после начала термообработки (сорта и формы Невежинской рябины, Бусинка, Сорбинка); 2) со средней устойчивостью, которые формируют небольшие приросты, позволяющие изолировать меристематические верхушки с последующей высадкой на питательные среды (Титан, Гранатная, Рубиновая, Ликерная).
Из сортов ежевики лучше всего переносил термотерапию сорт Новаго, у которого отсутствовали некрозы, а приросты побегов достигали 10 – 20 см. У ежевики сорта Торнфри и гибрида Тэйберри имелись местные некрозы листьев, а приросты составляли 5–8 см.
Жимолость оказалась чувствительной к высоким температурам: через 2 месяца термотерапии все растения сорта Роксана погибли, у сорта Избранница гибель составила 33 %.
Рисунок 7 – Усовершенствованные методы диагностики вирусов на плодовых и ягодных культурах.
6.2. Зависимость эффективности оздоровления методом культуры
меристем от величины экспланта
Оздоровление интактных растений. Выход здоровых растений зависит от величины и расположения на побеге инициального экспланта, вида вируса, наличия одного или комплекса вирусов, степени заражения исходного материала, биологических особенностей культуры.
Эффективность оздоровления растений рябины от вирусов на 3 изученных сортах варьировала от 55 % до 64 %. Наряду с меристемами величиной 0,4–0,8 мм хорошие результаты по оздоровлению от иларвируса PDV обеспечивали и экспланты величиной 1,0–1,5 мм (таблица 15). Однако при увеличении размера инициального экспланта до 2–5 мм имелась тенденция к уменьшению числа оздоровленных растений рябины.
Таблица 15 – Эффективность оздоровления (%) растений рябины от вируса PDV в зависимости от размера меристематических верхушек
| Величина меристемы, мм | Сорт | Среднее | ||
| Титан | Рубиновая | Невежинская | ||
| 0,4-0,8 | 25,0 а | 75,0 б | 100 в | 66,7 б |
| 1,0-1,5 | 100 в | 100 в | 66,7 б | 88,9 б |
| 2,0-5,0 | 33,3 аб | 16,8 а | 0,0 а | 16,7 а |
Эффективность оздоровления растений рябины от иларвируса PDV была одинаковой как при использовании апикальных, так и латеральных меристем.
При оздоровлении малины Rubus idaeus L. от вируса ArMV показано, что освобождение от него происходило при использовании как меристем, так и почек. Выход здоровых растений составил 20–40 % и не зависел от размера экспланта. Экспланты одного и того же размера оказывались как инфицированными, так и здоровыми. Вероятно, данный феномен может быть связан с неравномерным распределением вирусов по растению и с возможным подавлением их репликации под влиянием условий культивирования.
Процесс оздоровления от вирусов имеет сложный характер, и его эффективность определяется тесным взаимодействием случайности и закономерности. При этом под случайностью понимается вероятностный характер освобождения от вирусной инфекции, а под закономерностью – увеличение выхода оздоровленных клонов по мере уменьшения размера инициальных эксплантов.
С увеличением возраста растений в условиях зимней теплицы выход здоровых растений снижался на 10 – 27 % по сравнению с микрорастениями вследствие постепенного накопления вирусов. Тестирование ежевики на вирусы показало наличие четырехкратной разницы в индексах зараженности однолетних и двухлетних растений. Поэтому окончательное заключение о безвирусности растений, прошедших оздоровление, следует делать на основании результатов ИФА, проведенного не менее чем через 2 года после адаптации.
Оздоровление микрорастений. Нами предложен приём оздоровления микрорастений, инфицированных вирусами. Меристемы, вычлененные из микрорастений, уже адаптированы к условиям культивирования, поэтому хорошо приживаются и развиваются на питательной среде.
При оздоровлении микрорастений ежевики сорта Торнфри от вируса ArMV количество растений, свободных от этого вируса, при использовании меристем размером 0,12-0,62 мм было несколько больше (71 %), чем микрочеренков 1-5 мм (63 %). Однако эти различия несущественны, что свидетельствует о возможности использования при оздоровлении растений ежевики от данного вируса достаточно крупных по размеру эксплантов. Это заметно облегчает работу по их изоляции и снижает затраты. Кроме того, при относительно высоком проценте оздоровления отпадает необходимость в термотерапии.
В экспериментах с микрорастениями других видов и сортов рода Rubus прослеживалась четкая тенденция снижения эффективности оздоровления от неповирусов и вируса SLRSV при увеличении размера экспланта более 1 мм (таблица 16).
Таблица 16 – Эффективность оздоровления (%) от неповирусов и вируса SLRSV микрорастений рода Rubus в зависимости от размера экспланта (в среднем за 1994-1997 гг.)
| Величина экспланта, мм | Малина черная, Кумберленд | Малино-ежевичный гибрид, Тэйберри | Ежевика, Новаго |
| 0,2-0,8 | 50,0 б | 83,3 б | 76,7 аб |
| 1,0 | 58,4 б | 83,3 б | 91,7 б |
| 2,0-5,0 | 31,5 а | 33,3 а | 55,6 а |
На малине черной сорта Кумберленд изоляция эксплантов величиной 2-5 мм приводила к снижению выхода здоровых растений в 1,6-1,9 раза в сравнении с эксплантами размером 0,2-1,0 мм. Наряду с эксплантами малого размера (0,2-0,8 мм) устойчиво высокие показатели оздоровления обеспечивали экспланты величиной 1 мм.
6.3. Повышение эффективности оздоровления от вирусов при
сочетании термотерапии и культуры меристем
Наибольший эффект по оздоровлению растений достигался при сочетании суховоздушной термотерапии и культуры меристем, причем эффект зависел от величины меристемы.
При оздоровлении рябины сорта Титан от вируса PPV выход оздоровленных растений при использовании апексов 0,5-1,0 мм составил 83 %. Однако при увеличении размера экспланта более 1 мм все растения рябины оказались зараженными данным вирусом.
Эффективность оздоровления ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов зависела как от способа терапии, так и величины экспланта (таблица 17).
Таблица 17 – Эффективность оздоровления растений ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов в зависимости от метода терапии и величины экспланта, в % (в среднем за 1994-1997 гг.)
| Величина экспланта, мм | Гибрид Тэйберри | Ежевика Новаго | Среднее | |||
| Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | Культура тканей | Термотерапия + культура тканей | |
| 0,2-0,8 | 83,3 б | 85,8 б | 76,7 аб | 90,0 б | 80,0 б | 87,9 б |
| 1,0 | 83,3 б | 95,9 б | 91,7 б | 100 б | 87,5 б | 98,0 б |
| 2,0-5,0 | 33,3 а | 70,8 а | 55,6 а | 50,0 а | 44,5 а | 60,4 а |
Применение комплексной терапии способствовало увеличению выхода здоровых растений в среднем на 11 % по сравнению с культурой тканей. Изоляция эксплантов величиной до 1 мм обеспечивала высокий выход безвирусных растений независимо от культуры и метода терапии. Высадка на среду эксплантов 2-5 мм приводила к снижению выхода безвирусных растений в 1,5-2 раза по сравнению с эксплантами не более 1 мм.
Зависимость оздоровления от расположения на побеге инициальных эксплантов не носила четко выраженный характер: для сортов Торнфри и Тэйберри различия между апикальными и латеральными меристемами в среднем за 1996–1998 гг. отсутствовали, для сорта Новаго в 1996 г. предпочтительней оказалось использовать верхушечные меристемы.
На жимолости сочетание термотерапии и культуры in vitro обеспечивало оздоровление от неповирусов около 80 % эксплантов.
6.4. Использование экологически безопасных препаратов при
оздоровлении методом хемотерапии
Особый интерес для практического применения представляют экологически чистые ингибиторы фитопатогенных вирусов со стимулирующим ростовым действием. К таким препаратам относятся и некоторые фенольные соединения, способные индуцировать неспецифическую устойчивость.
При введении в состав среды фенолкарбоновых кислот выход здоровых растений зависел от видовых особенностей культуры, вида вируса и фенольного соединения.
Экспланты рябины сорта Невежинская удалось успешно оздоровить от вирусов PNRSV и PDV, включив в состав среды салициловую и сиреневую кислоты. Высокое ингибиторное действие по отношению к вирусу PDV проявляли феруловая кислота и тиоурацил.
На рябине сортов Гранатная и Титан салициловая кислота в концентрации 6х10-4 М способствовала получению 100 % регенерантов, свободных от иларвирусов PNRSV и PDV (таблица 18). Более низкие концентрации салициловой кислоты были менее эффективными в отношении вируса PDV у обоих сортов рябины и вируса PNRSV на сорте Гранатная. У сорта Титан высокая антивирусная активность в отношении вируса PNRSV достигнута и при более низких концентрациях салициловой кислоты – 1х10-4 – 3х10-4 М.
Таблица 18 – Эффективность оздоровления (%) растений рябины разных сортов от иларвирусов в зависимости от концентрации салициловой кислоты в питательной среде
| Салициловая кислота, М | PDV | PNRSV | ||||
| Гранатная | Титан | Среднее | Гранатная | Титан | Среднее | |
| 0 (контроль) | 0,0 | 20,0 | 10,0 аб | 0,0 | 50,0 | 25,0 а |
| 1 х 10-5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 а | 50,0 | 0,0 | 25,0 а |
| 1 х 10-4 | 40,0 | 66,7 | 53,4 в | 60,0 | 100 | 80,0 бв |
| 3 х 10-4 | 0,0 | 60,0 | 30,0 б | 50,0 | 100 | 75,0 б |
| 6 х 10-4 | 100 | 100 | 100 г | 100 | 100 | 100 в |
В целом в процессе хемотерапии плодовых культур от иларвирусов вирус PDV подавлялся в более сильной степени, чем PNRSV. Наибольшая антивирусная активность на плодовых культурах отмечена у салициловой кислоты.
Все испытанные соединения в той или иной степени ингибировали вирусы SLRSV, ArMV и TBRV у растений ежевики сортов Смутстем и Торнфри и малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри (таблица 19).
Таблица 19 – Эффективность оздоровления (%) микрорастений ежевики и малино-ежевичного гибрида от неповирусов и вируса SLRSV в процессе хемотерапии in vitro в зависимости от вида фенолкарбоновой кислоты
| Препарат | Смутстем | Торнфри | Логанберри | |||
| ArMV | TBRV | TBRV | SLRSV | TBRV | SLRSV | |
| Без препарата (контроль) | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а | 0,0 а |
| Тиоурацил (эталон) | 100 в | 100 г | 90,0 г | 100 б | 75,0 бв | 100 в |
| Салициловая кислота | 100 в | 25,0 б | 100 г | 100 б | 75,0 бв | 100 в |
| Галловая кислота | 100 в | 100 г | 60,0 в | 100 б | 50,0 б | 100 в |
| Сиреневая кислота | 100 в | 100 г | 60,0 в | 100 б | 66,7 б | 66,7 б |
| п-Кумаровая кислота | 100 в | 75,0 в | 20,0 аб | 100 б | 50,0 б | 100 в |
| Кофейная кислота | 100 в | 75,0 в | 40,0 бв | 100 б | 100 в | 100 в |
| Феруловая кислота | 75,0 б | 100 г | 40,0 бв | 100 б | 100 в | 100 в |
Способ оздоровления растений от вирусов с использованием салициловой, галловой или сиреневой кислот позволяет повысить эффективность оздоровления растений от вирусов в среднем на 28-30 % и снизить стоимость процесса оздоровления. С учётом оптимальных концентраций фенольных соединений их использование обходится примерно в 25 раз дешевле, чем 2-тиоурацила.
Высокая эффективность салициловой кислоты установлена при оздоровлении малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри от вируса кустистой карликовости малины (RBDV) (таблица 20). Выход оздоровленных от вирусов TBRV и SLRSV растений Логанберри варьировал в пределах 50-100 % и 50-67 % соответственно.
Таблица 20 – Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Логанберри от вирусов на среде с салициловой кислотой*
| Салициловая кислота, М | RBDV | SLRSV | TBRV | |||
| Ао/Ак | Оздоров- ление, % | Ао/Ак | Оздоров-ление, % | Ао/Ак | Оздоров- ление, % | |
| 0 (контроль) | 7,4 в | 0 а | 1,8 а | 33,3 а | 2,4 в | 0 а |
| 1 х 10-5 | 2,0 б | 75,0 б | 1,8 а | 50,0 аб | 1,2 а | 100 г |
| 4 х 10-5 | 2,5 б | 66,7 б | 1,8 а | 66,7 б | 1,6 аб | 75,0 в |
| 6 х 10-5 | 1,1 а | 100 в | 2,1 а | 50,0 аб | 1,8 б | 50,0 б |
*Тестирование растений осуществляли через 2 года после высадки в нестерильные условия.
На ежевике сорта Торнфри при оздоровлении от вируса SLRSV на среде с салициловой кислотой удалось получить до 100 % свободных от данного вируса регенерантов, на ежевике сорта Агавам – до 75 %. При этом имела место тенденция повышения эффективности оздоровления при увеличении концентрации салициловой кислоты, а также улучшения развития эксплантов на среде с данным соединением. Салициловая кислота в концентрациях 1х10-4 М и 3х10-4 М обеспечивала надёжную элиминацию неповируса TBRV у малино-ежевичного гибрида сорта Санберри – 100 % безвирусных эксплантов.
6.5. Разработка метода магнитотерапии in vitro для оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов
Как перспективный метод оздоровления зараженных вирусами растений нами предложена магнитотерапия. В основе метода – способность магнитного поля модифицировать метаболизм растений и влиять на их иммунные реакции. К преимуществам применения магнитно-импульсной обработки (МИО) относятся высокая технологичность, возможность автоматизации процесса, низкая энергоемкость, безопасность для человека.
Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская зависела от частоты импульсов магнитной индукции (ИМИ) и вида вируса (таблица 21).
Таблица 21 – Эффективность оздоровления малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская от вирусов в зависимости от частоты импульсов магнитной индукции и этапа культивирования, в % к числу тестированных растений
| Частота импульсов, Гц | Вирус RBDV | Вирус TBRV | ||
| Микро- растения | Растения через 1 год после адаптации | Микро- растения | Растения через 1 год после адаптации | |
| Без обработки | 0,0 а | 28,6 а | 0,0 а | 50,0 аб |
| 0,2 | 66,7 в | 75,0 б-д | 0,0 а | 33,3 а |
| 0,4 | 0,0 а | 50,0 аб | 0,0 а | 66,7 бв |
| 1,6 | 0,0 а | 75,0 б-д | 33,3 б | 66,7 бв |
| 3,2 | 0,0 а | 58,3 бв | 66,7 в | 83,3 вг |
| 6,4 | 100 г | 91,7 гд | 100 г | 100 г |
| 12,8 | 66,7 в | 66,7 б-г | 66,7 в | 83,3 вг |
| 25,6 | 33,3 б | 83,3 в-д | 100 г | 100 г |
| 51,2 | 33,3 б | 100 д | 100 г | 83,3 вг |
Наиболее перспективным режимом в отношении ингибирования вируса RBDV оказалась обработка магнитным полем с частотой 6,4 Гц, позволившая оздоровить все растения. При этой же частоте отмечали и минимальный индекс зараженности – 1,1, тогда как в контроле он составил 4,0.
Для вируса TBRV установлен широкий диапазон частот ИМИ, обеспечивающих хорошие результаты по оздоровлению: от 3,2 до 51,2 Гц. При этих частотах индекс зараженности был низким (1,2-1,5).
МИО стимулировала у микрорастений сорта Краснодарская увеличение длины побегов на 30-50 %, числа почек и побегов – на 15-30 %, укореняемости побегов – на 11-30 % по сравнению с контролем. Наилучшим развитием характеризовались адаптированные растения после обработки импульсами с частотой 6,4 Гц: длина побегов возросла в 2,9 раза, их число – в 1,2 раза. Слабое развитие растений в контроле связано с тем, что вирус RBDV существенно угнетает фотосинтетическую продуктивность и ростовые процессы у растений.
Эффективность оздоровления эксплантов груши сорта Лада, зараженных латентными вирусами, зависела от частоты и направления импульсов магнитной индукции (таблица 22).
Таблица 22 – Эффективность оздоровления микрорастений груши сорта Лада от вирусов в зависимости от частоты и направления вектора магнитной индукции, в % к числу тестированных растений
| Частота импульсов, Гц | Вирус ApMV | Вирус ACLSV | ||
| Направление вектора магнитной индукции | ||||
| Параллельное | Перпендикулярное | Параллельное | Перпендикулярное | |
| Без обработки | 20,0 б | 20,0 а | 40,0 а | 40,0 а |
| 0,8 | 60,0 г | 40,0 б | 60,0 б | 40,0 а |
| 1,6 | 0,0 а | 20,0 а | 33,3 а | 80,0 б |
| 3,2 | 0,0 а | 20,0 а | 40,0 а | 100 в |
| 6,4 | 40,0 в | 20,0 а | 80,0 в | 40,0 а |
| 12,8 | 20,0 б | 40,0 б | 40,0 а | 100 в |
Наиболее высокий процент оздоровленных от вируса ApMV растений получен после обработки параллельными импульсами с частотой 0,8 Гц. При оздоровлении эксплантов груши от вируса ACLSV предпочтительней оказалось перпендикулярное к оси экспланта направление вектора магнитной индукции: при трех частотах (1,6; 3,2; 12,8 Гц) было получено 80-100 % оздоровленных от указанного вируса растений. Параллельные импульсы значительно ингибировали вирус ACLSV при частоте 6,4 Гц.
Длина побегов у эксплантов груши, обработанных перпендикулярно направленными к оси побега импульсами магнитной индукции, увеличивалась в 2,4 раза, а в случае обработки параллельными импульсами – в 1,8 раза. Число побегов соответственно возрастало в 2,4 и 2,1 раза. Побеги наибольшей длины формировались после обработки перпендикулярно направленными импульсами с частотой 6,4-12,8 Гц (патент РФ № 2277771).
Ценность магнитотерапии как нового способа оздоровления растений от вирусов in vitro заключается в отсутствии фитотоксического эффекта в организме хозяина в отличие от применения многих химических препаратов. К тому же использование МИО приводит к активизации ростовых процессов и повышению коэффициента размножения.
Таким образом, в качестве основных высокоэффективных технологий оздоровления применяют хемотерапию или магнитотерапию in vitro (рисунок 8). Для хемотерапии как экологически безопасные антивирусные препараты используют салициловую, галловую или сиреневую кислоты в концентрации 3х10-4– 6х10-4 М, что обеспечивает получение от 80 до 100 % здоровых растений. Магнитно-импульсная обработка с частотой импульсов 3,2-12,8 Гц способствует освобождению от вирусов 60-100 % эксплантов.
Возможно использование для целей оздоровления комплекса суховоздушной термотерапии и культуры апексов размером 0,3-1 мм. Однако при относительно высоком выходе оздоровленных растений (от 60 до 100 %) данная технология требует большего количества затрат труда и материальных средств по сравнению с хемотерапией или магнитотерапией.
На этапе микроразмножения осуществляют предварительное тестирование эксплантов методами ИФА и ПЦР, после которого растения с положительной реакцией выбраковывают, а растения с отрицательной реакцией продолжают культивировать на среде и помещают на хранение или укореняют и адаптируют к нестерильным условиям с использованием разработанных приемов. Адаптированные растения подвергают комплексному тестированию методами ИФА, ПЦР и на древесных индикаторах. Растения без вирусов проверяют на соответствие сортотипу и в случае отсутствия отклонений переводят в категорию исходных растений. От исходных растений получают базисные, от базисных – сертифицированные растения.
Теория оздоровления от вирусов. На основе анализа известных научных достижений и собственных результатов предложена теория оздоровления растений от вирусов, в которой рассмотрены обусловливающие вирусный патогенез факторы окружающей среды и основные принципы защиты плодовых и ягодных культур от вирусов, дано подразделение методов оздоровления, показан сложный характер процесса оздоровления. В основе теории лежит постулат о тесном взаимодействии вируса, растения-хозяина и окружающей среды. Факторы окружающей среды могут оказывать ингибирующее или стимулирующее действие на вирусный патогенез. Теория оздоровления базируется на существовании в условиях объективной реальности различных механизмов оздоровления. Оздоровление растений от вирусов происходит в результате действия комплекса факторов и одновременного или последовательного запуска нескольких механизмов оздоровления. Методы оздоровления подразделяются на 3 основные группы: биологические (культура меристем), физические (суховоздушная термотерапия, криотерапия, магнитотерапия, СВЧ, УФ-излучение) и химические (хемотерапия). Эффективность оздоровительных мероприятий обусловливается выбором метода оздоровления (комплекса методов), его параметрами (длительность обработки, физические и химические параметры), видовыми и сортовыми особенностями растений и их реакцией на процесс оздоровления, видом вирусного патогена.
Рисунок 8 – Технологическая схема оздоровления плодовых и
ягодных культур от вирусов.