Вирусные болезни и современные методы оздоровления плодовых и ягодных культур специальность 06. 01. 07 защита растений
| Вид материала | Документы |
- Комплекс мероприятий по защите сада от вредителей. Литература, 648.1kb.
- Научное обоснование создания сырьевых садов на основе генетического потенциала плодовых, 1284.76kb.
- Общая характеристика работы Актуальность темы, 398.26kb.
- Примерная программа наименование дисциплины фитопатология и энтомология рекомендуется, 313.88kb.
- Реферат по дисциплине «Биотехнология в пищевой проышленности»: Особенности производства, 313.46kb.
- Тобольский архиерейский дом в XVII 60-е гг. XVIII в. Специальность 07. 00. 02 Отечественная, 448.98kb.
- Технологии закладки и выращивания плодовых и ягодных культур Технология закладки, 657.63kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 3299.35kb.
- Министерство образования и науки Российской Федерации Учебно-методическое, 5418.2kb.
- С. Х. Аль-Шукри, Д. Н. Солихов // нефрология. 2009. Т. 13, № С. 86-91. Библиогр.:, 347.38kb.
На правах рукописи
УПАДЫШЕВ МИХАИЛ ТАРЬЕВИЧ
ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
ОЗДОРОВЛЕНИЯ ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР
Специальность 06.01.07 – защита растений
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
доктора сельскохозяйственных наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор
Белошапкина Ольга Олеговна
Российский Государственный Аграрный Университет – Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева;
доктор биологических наук
Балашова Ирина Тимофеевна
Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур РАСХН;
доктор биологических наук
Перевертин Кирилл Александрович
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН
Ведущая организация: Государственное научное учреждение
Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства
имени И.В. Мичурина Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится “ 09 ” июня 2011 года в 13 час. на заседании диссертационного совета Д 006.035.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии по адресу: 115598, Москва, ул. Загорьевская, 4, конференц-зал, факс 8 (495) 329 31 66, e-mail vstisp@vstisp.org.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии.
Автореферат разослан и выставлен на сайте ВАК РФ “___” __________ 2011 г.
Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.
Учёный секретарь диссертационного совета
кандидат сельскохозяйственных наук Л.А. Марченко
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В связи с необходимостью интенсификации садоводства все большее значение приобретает разработка высокоэффективных технологий производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур.
В настоящее время в условиях антропогенных систем распространенность и вредоносность вирусов вследствие появления новых штаммов и размножения неоздоровленного посадочного материала, как правило, существенно возрастают (Романенко, Перевертин и др., 2006). Наиболее вредоносные вирусы способны приводить к потерям 20-70 % урожая (Вердеревская, Маринеску, 1985; Clever, Stehr, 1996; Белошапкина, 2005; Лукьянова, 2007). Поэтому анализ распространенности вирусных болезней, прогноз их развития, уничтожение очагов карантинных объектов и создание безвирусного питомниководства плодовых и ягодных культур являются актуальными задачами защиты растений. Видовой состав и распространённость вирусов на груше, рябине, жимолости, ежевике, малине чёрной, малино-ежевичном гибриде, лимоннике, актинидии в условиях России изучены недостаточно, нуждаются в научном обобщении и анализе.
«Концепцией развития аграрной науки и научного обеспечения АПК России до 2025 г.», принятой МСХ в 2007 г., в качестве важной задачи в области защиты растений определено создание новых методов фитосанитарной диагностики. В настоящее время отечественными и зарубежными учеными широкое применение методов молекулярного анализа рассматривается как стратегическое направление эпидемиологии вирусов (Kummert et al., 2001; Балашова, Пивоваров, 2003; Jelkmann, 2004).
При оздоровлении растений от вирусов актуальным является совершенствование методов суховоздушной термотерапии, культуры меристем, хемотерапии, а также разработка новых высокоэффективных способов оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов.
Для успешного оздоровления и последующего микроразмножения растений необходимо совершенствование существующих биотехнологических методов и разработка новых технологических приемов, направленных на увеличение выхода здоровых растений.
Целью исследований является изучение распространенности и вредоносности основных вирусных болезней плодовых и ягодных культур и разработка современной научно обоснованной технологии оздоровления.
Задачи исследований:
1. Определить видовой состав и установить закономерности распространения вирусов на ряде плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне России.
2. Оценить вредоносность основных вирусов и обосновать необходимость оздоровления посадочного материала.
3. Усовершенствовать основные методы диагностики вирусов (индикаторный метод, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция).
4. Установить закономерности оздоровления садовых растений от вредоносных вирусов.
5. Изучить антивирусную активность фенольных соединений при хемотерапии.
6. Выявить влияние магнитного поля на некоторые вирусы растений.
7. Изучить действие различных факторов на регенерационные процессы при ускоренном размножении оздоровленных растений.
8. Оценить экономическую эффективность получения здорового посадочного материала с применением разработанной технологии.
Методология исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности вирусов, разработке оптимальных методов диагностики и комплекса оздоровительных мероприятий, позволяющих на основе использования современных вирусологических и биотехнологических приемов ускорить получение здорового посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Научная новизна результатов исследований. Разработана и научно обоснована современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов. Впервые предложена теория оздоровления растений от вирусов, в основе которой лежит постулат о взаимодействии вируса, растения-хозяина и окружающей среды.
Установлены закономерности распространения вирусов разной этиологии в различных насаждениях ряда плодовых и ягодных культур в зависимости от возраста и местоположения плантации, сортовых особенностей, способа размножения и условий выращивания. В результате серомониторинга в Нечерноземной зоне России выявлено широкое распространение вирусных болезней (в среднем от 21 до 51 %) с преобладанием комплекса из 2 (реже из 3-5) вирусов. Впервые дана оценка уровня изменчивости распространенности разных видов вирусных патогенов.
Показано отрицательное влияние латентных вирусов на генеративную продуктивность и биохимические показатели у груши; неповирусов и вируса SLRSV – на генеративную и вегетативную продуктивность ежевики и малино-ежевичного гибрида. Установлено, что некоторые вирусы способны ингибировать процессы органогенеза при микроразмножении и размножении стеблевыми черенками.
Впервые применительно к биологическим особенностям изученных культур усовершенствованы методы диагностики вирусов (индикаторный метод, ИФА, ПЦР) с применением гидроксипроизводного бензойной кислоты (патенты № 2147173, 2389795).
Предложена научно обоснованная концепция оздоровления растений. Определена зависимость эффективности оздоровления от вида вируса, генетических особенностей растений, способа оздоровления, типа и величины инициальных эксплантов. Впервые при использовании культуры тканей доказана возможность увеличения размера апекса до 1 мм без существенного снижения эффекта оздоровления от основных вредоносных вирусов.
Разработан эффективный способ хемотерапии in vitro зараженных вирусами растений с использованием экологически безопасных гидроксибензойных кислот (патент № 2233579).
Впервые предложена концепция магнитотерапии вирусов растений и установлено антивирусное действие импульсного магнитного поля в отношении латентных вирусов на груше, вирусов кустистой карликовости малины и черной кольцевой пятнистости томата – на малино-ежевичном гибриде (патенты № 2277771, 2310318).
Разработаны приемы ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур на основе концепции чередования питательных сред, оптимизации состава среды, использования экологически безопасных фенольных соединений и регуляторов роста нового поколения, магнитно-импульсной обработки и модификации спектрального состава света.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Специфичность видового состава и закономерности распространения вирусов в насаждениях ряда плодовых и ягодных культур.
2. Преимущества ИФА и ПЦР в современной системе диагностики вирусов.
3. Концепция оздоровления растений с применением биологических, физических и химических методов.
4. Принципы использования фенольных соединений в системе диагностики, оздоровления от вирусов и ускоренного размножения здоровых растений.
5. Научно обоснованные приемы ускоренного размножения плодовых и ягодных культур в системе производства здорового посадочного материала.
Предметом исследований являются закономерности распространения и локализации вирусов в растениях, диагностики вирусных патогенов и оздоровления растений.
Практическая значимость исследований. Разработана современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов, включающая инновационные методы диагностики и эффективные вирусологические и биотехнологические приемы получения здорового посадочного материала, что позволяет повысить достоверность диагностики и выявляемость вирусов до 90-100 %, увеличить выход здорового материала в 1,7-2,1 раза на ягодных культурах и в 3,5-10,5 раза на плодовых культурах, снизить себестоимость базисных растений в 1,2-1,8 раза.
Испытания предложенной технологии были проведены в НПЦ биотехнологии «Фитогенетика» (г. Тула) в условиях лаборатории биотехнологии и зимней теплицы, где получены положительные результаты от применения предложенного заменителя агар-агара на ряде ягодных и плодовых культур.
Изобретения «Питательная среда для выращивания растений in vitro» (патент № 2039428) и «Способ размножения садовых растений» (патент № 2183057) регулярно использовались в лаборатории вирусологии ВСТИСП при получении оздоровленного посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Разработанный способ диагностики внедрен и применяется в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, а также прошел успешные испытания в ООО «АгроДиагностика», где показано повышение эффективности выявления вирусов на 25 % при выполнении ОТ-ПЦР по предложенному способу в сравнении с известным.
Эффективность магнитно-импульсной обработки при ускоренном размножении здорового посадочного материала плодовых и ягодных культур подтверждена результатами испытаний, проведенных специалистами ФГНУ «Росинформагротех».
Показано положительное действие иммуностимуляторов на продуктивность деревьев груши в условиях промышленных насаждений ГНУ ВСТИСП (2006-2008 гг.).
Оздоровленным посадочным материалом плодовых и ягодных культур, полученным диссертантом, заложены маточные насаждения в 18 хозяйствах 15 областей. Всего за период с 1992 по 2010 гг. получено около 80 тысяч здоровых растений плодовых и ягодных культур.
Работа отмечена 1 золотой и 2 серебряными медалями ВВЦ, награждена дипломом за лучшую завершенную научную разработку 2006 года.
Результаты исследований были использованы при разработке национальных стандартов ГОСТ Р 53135-2008 «Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия» и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия», а также при составлении 6 методических указаний.
Личный вклад автора. Постановка проблемы, формулировка цели и задач исследований, разработка программы и методологии исследований, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично. Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75 %) с профессором В.А. Высоцким, в. н. с. В.И. Донецких, зав. ОНТИ Г.В. Бешновым, к. с.-х. н. А.А. Томилиным, в. н. с. Г.Ю. Упадышевой, зав. лабораторией вирусологии Н.Н. Мельниковой, с. н. с. О.Ю. Сурковой, аспирантами А.Д. Петровой, Е.А. Туть, П.А. Походенко, И.И. Сауниной (ГНУ ВСТИСП), зав. лабораторией биохимии А.В. Гуськовым (ИФР РАН).
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были представлены на международных конференциях: II и VIII конференциях «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993; Саратов, 2003), III, IV и V конференциях «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1995, 1997, 1999), «Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Москва, 2001), 9 конференции по садоводству «Fruit growing and viticulture II. Floriculture and medicinal plants and other general themes» (Ледница, 2001), «Современное плодоводство: состояние и перспективы развития» (Самохваловичи, 2005), «Мониторинг и методика исследований в садоводстве в нестабильных экологических условиях» (Москва, 2005), «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006), 2-ом «Форуме возрождения китайской северо-восточной старой промышленной базы: научно техническое сотрудничество Китая и СНГ» (Харбин, 2006), «Состояние и перспективы развития культуры жимолости в современных условиях» (Мичуринск, 2009), «Инновационные технологии в питомниководстве» (Самохваловичи, 2009), «Оценка состояния и резервы повышения эффективности производства продукции садоводства и пчеловодства» (Новосибирск, 2010), «Инновационные направления и проблемы в защите садовых культур от вредных организмов на современном этапе» (Москва, 2010); международных симпозиумах: IV, VI, VII и VIII симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001, 2005, 2009; Белгород, 2006), VI и VII симпозиумах по фенольным соединениям (Москва, 2004, 2009); Всероссийских конференциях и совещаниях: «Актуальные проблемы развития питомниководства и научное обеспечение отрасли» (Москва, 1993), Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 1995), «Актуальные вопросы теории и практики защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов в условиях многоукладности сельского хозяйства» (Москва, 1998), «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1999, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 170 печатных работ, в том числе 31 – в рецензируемых научных журналах списка ВАК, 3 монографии (2 – в соавторстве), 1 книга (в соавторстве), 6 методических указаний, получено 3 авторских свидетельства СССР на изобретения и 17 патентов РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 480 страницах (основной текст на 326 страницах), содержит 117 таблиц, 59 рисунков; состоит из введения, 8 глав, выводов и рекомендаций производству, 12 приложений, списка цитируемой литературы из 816 наименований, в том числе 513 – на иностранных языках.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Систематизированы сведения по современной классификации вирусов. На основе анализа мировой и отечественной литературы детально рассмотрены видовой состав, распространенность и вредоносность основных вирусов плодовых и ягодных культур. Отмечена широкая распространенность вирусов разной этиологии в насаждениях плодовых и ягодных культур, обоснована необходимость проведения комплекса защитных мероприятий в зависимости от вида вируса и биологических особенностей растения-хозяина.
Критически проанализированы современные методы диагностики вирусных болезней, дана оценка их преимуществ и недостатков, показана необходимость их дальнейшего развития и совершенствования.
Рассмотрены методы оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов, приведены сведения по их эффективности, доказана целесообразность поиска альтернативных и экологически безопасных методов оздоровления.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Основные исследования проводили с 1992 по 2010 гг. на базе лаборатории вирусологии и на вирусологическом участке отдела защиты растений ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.
Тест-образцы для изучения распространенности вирусных болезней отбирали в процессе маршрутных обследований насаждений плодовых и ягодных культур в 14 учреждениях Московской, Брянской, Тульской, Самарской, Свердловской, Вологодской областей.
Основными объектами исследований служили растения груши 11 сортов; рябины 9 сортов; ирги Ламарка; ежевики 4 сортов; малино-ежевичного гибрида 4 сортов; малины чёрной сорта Кумберленд; малины красной 2 сортов; жимолости 10 сортов; лимонника китайского 3 сортов; актинидии коломикта 7 сортов; актинидии полигама 3 сортов; актинидии аргута 1 сорта.
Изучали следующие вирусы: бороздчатости древесины яблони ( Apple stem grooving virus – ASGV), ямчатости древесины яблони (Apple stem pitting virus – ASPV), хлоротической пятнистости листьев яблони (Apple chlorotic leaf spot virus – ACLSV), мозаики яблони (Apple mosaic virus – ApMV), шарки сливы (Plum pox virus – PPV), некротической кольцевой пятнистости косточковых (Prunus necrotic ringspot virus – PNRSV), карликовости сливы (Prune dwarf virus – PDV), скручивания листьев черешни (Cherry leaf roll spot virus – CLRV), мозаики резухи (Arabis mosaic virus – ArMV), кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot virus – RpRSV), кустистой карликовости малины (Raspberry bushy dwarf virus – RBDV), латентной кольцевой пятнистости земляники (Strawberry latent ringspot virus – SLRSV), черной кольцевой пятнистости томата (Tomato black ring virus – TBRV), огуречной мозаики (Cucumber mosaic virus – CMV), табачной мозаики (Tobacco mosaic virus – TMV).
Диагностику вирусов проводили методами иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием тестов на травянистых и древесных индикаторах в соответствии с «Типовыми методиками диагностики вирусных болезней сельскохозяйственных культур, одобренными специалистами стран-членов СЭВ» (1970), «Технологией производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда» (1989), методическими указаниями «Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2001), «Методическими указаниями по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах» (2002), «Диагностикой вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР» (2008). Применяли сэндвич-вариант твердофазного ИФА в планшетном формате с использованием базовой методики (Clark, Adams, 1977) и диагностических наборов из НИИ садоводства Молдовы, фирм «Loewe» (Германия), «Savoir Faire» (INRA, Франция), «Bioreba» (Швейцария). Регистрацию результатов анализов выполняли на фотометре при длине волны 405 нм. Всего за годы исследований протестировано более 3 тысяч образцов (каждый образец – на 4-5 вирусов в 2-кратной повторности).
ПЦР-тесты проводили с праймерами, синтезированными в компании «СибЭнзим» и готовыми наборами для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанными в ООО «Агродиагностика» и компании «Биоком». Экстракцию РНК осуществляли методом сорбции на препарате силика (по Menzel et al., 2002; Uyemoto, Rwahnih, 2006), модифицированным нами. Амплификацию выполняли в программируемом термостате «Терцик». Для проведения ПЦР в реальном времени использовали систему «MiniOpticon» (США) с выводом графиков флуоресценции на монитор компьютера. Повторность в опытах – 5-кратная.
Тесты на древесных индикаторах осуществляли в условиях открытого грунта способом двойной окулировки (OEPP/EPPO Bulletin, 1991-1992) и в зимней теплице по методике P.R. Fridlund (1980) на плодовых культурах или прививкой на растениях рода Rubus (OEPP/EPPO Bulletin, 1994); на травянистых индикаторах – в условиях зимней теплицы. Повторность – 5-кратная.
Оздоровление растений от вирусов проводили с использованием методов суховоздушной термотерапии, культуры апексов, хемотерапии и магнитотерапии in vitro. Термотерапию осуществляли в соответствии с «Технологией производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда» (1989) в термокамерах «Универсал-1» в течение 30-82 суток с последующей прививкой верхушек на безвирусные сеянцы или высадкой апексов на питательные среды. В качестве антивирусных препаратов использовали следующие соединения: ДГТ (2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин), цианогуанидин, 2-тиоурацил, салициловую, галловую, сиреневую, п-кумаровую, кофейную и феруловую кислоты. Магнитотерапию микрочеренков груши и малино-ежевичного гибрида проводили с помощью прибора СИ-3, разработанного в отделе механизации ВСТИСП в. н. с. В.И. Донецких, импульсами с частотой 0,2-51,2 Гц. Каждый вариант в экспериментах по хемо- или магнитотерапии включал 15-20 эксплантов.
Оценку продуктивности здоровых и зараженных вирусами растений груши, ежевики и малино-ежевичного гибрида проводили в соответствии с «Программой и методикой сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (1999). Повторность в опытах – 10-кратная. Определяли количество хлорофилла (а + b) по методике Н.Н. Иванова (1946) с фотоколориметрическим завершением, активность растворимой формы пероксидазы – по модифицированной методике А.В. Гуськова и др. (1988) в 3-кратной повторности.
Клональное микроразмножение осуществляли в соответствии с «Методическими указаниями по клональному микроразмножению черной и красной смородины» (1986). Для культивирования эксплантов применяли питательные среды T. Murashige и F. Skoog в модификации В.А. Высоцкого и др. (1976), E.C.M. Lee и R.A. Fossard (1975) и W.C. Anderson (1980). В варианте – 20-25 эксплантов.
Оптимизацию минерального состава среды для размножения осуществляли по усеченной матрице 6-факторного эксперимента (по Малышеву, 1977) и с применением компьютерной программы. На этапе размножения в питательную среду добавляли 6-БАП, тидиазурон, этрел; салициловую, галловую, сиреневую, п-кумаровую, кофейную и феруловую кислоты. На этапе укоренения испытывали регуляторы роста: ИМК, ИУК, НУК, рибав-экстра, амбиол, этрел, флоридзин, фенолкарбоновые кислоты.
Статистическую обработку осуществляли методами дисперсионного, корреляционного и регрессионного анализа по Б.А. Доспехову (1985). Использовали компьютерные программы Excel и STRAZ.
Расчёт экономической эффективности выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве» (2005) и на основе технологических карт.