Номинация: «Перспективный проект»
| Вид материала | Документы |
- Рабочая тетрадь по разработке курсового проекта на тему: «Перспективный план хозяйства», 2938.38kb.
- Конкурс на лучший молодёжный проект по здоровьеформирующей и здоровьесберегающей деятельности, 79.1kb.
- Диплом лауреата, номинация «Художественное слово», 15.19kb.
- Мдоу «Центр развития ребенка – детский сад №394» г. Перми Летние Олимпийские игры, 130.35kb.
- Проект Внедрение в систему работы общеобразовательной школы инструментальных средств, 173.96kb.
- Областной конкурс «Лучший элективный курс для профильного обучения» Номинация, 476.94kb.
- Перспективный план работы по предупреждению детского дорожно-транспортного травматизма, 300.51kb.
- Плотко Елена Константиновна, психолог, социальный педагог, моу «Гимназия №42» г. Кемерово, 145.58kb.
- Конкурс «На лучшую организацию питания в 2012 г.» Номинация «Лучший ученический проект», 217.01kb.
- Перспективный план к экологическому пространству «Фитобар» в старшем дошкольном возрасте., 44.19kb.
Номинация: «Перспективный проект»
«Биочипы для иммуноморфологического исследования клеток крови»
Руководитель проекта:
Шишкин Александр Валентинович
кандидат медицинских наук, заведующий учебно-экспериментальной лаборатории ГОУ ВПО Ижевской государственной медицинской академии (г. Ижевск).
Аннотация.
Область применения.
Областью применения разработки (иммунологических биочипов, позволяющих определять поверхностные антигены клеток и методик (способов) проведения исследования с их помощью) является медицина. Имеющиеся экспериментальные образцы биочипов предназначены для использования в области гематологии для исследования клеток многих опухолей лимфатической системы (острых и хронических лимфатических лейкозов, а также лимфом, сопровождающихся опухолевым лимфоцитозом в периферической крови). Путем простого расширения панели до 65-70 антител могут быть получены биочипы для исследования клеток не только лимфоидных, но и миелоидных опухолей. Кроме того, существующие образцы биочипов могут быть применены для диагностических исследований в области клинической иммунологии. Возможно также использование разработки в области военной медицины для определения степени тяжести и прогноза течения лучевой болезни. При нанесении на подложку других панелей антител по точно такой же технологии могут быть получены биочипы, предназначенные для использования в области онкологии (для определения поверхностных антигенов клеток опухолей), трансплантологии (для определения антигенов I класса системы HLA), микробиологии (для определения поверхностных антигенов бактерий), клеточной биологии (например, для определения поверхностных антигенов стволовых клеток) и других областях медицины и биологии.
Актуальность. Определение иммунофенотипа клеток является одним из важнейших условий постановки диагноза в гематологии. Большую роль иммунофенотипирование играет также в диагностике заболеваний, связанных с нарушением клеточного звена иммунитета. Для определения иммунофенотипа клеток используются иммунофлюоресцентные (реже иммуноцитохимические) методы, а также проточная цитофлюориметрия. Данные методы непригодны для одновременного определения большого числа поверхностных антигенов и требуют высокого расхода антител. Иммунофлюоресцентные методы и проточная цитофлюориметрия требуют использования дорогостоящего оборудования. Это обусловливает высокую стоимость проведения анализа и позволяет использовать их только в весьма ограниченном числе медицинских учреждений. Во многих медицинских учреждениях, имеющих специализированные гематологические отделения, отсутствует возможность определения иммунофенотипа опухолевых клеток. Это ведет к ошибкам при установлении окончательного диагноза и во многих случаях не позволяет выбирать оптимальную схему химиотерпаии. Результатом этого является большое число случаев развития полирезистентности клеток опухоли к действию химиотерапевтических препаратов (эффекта предлеченности) и гибель больных. Отсутствие методов, пригодных для скрининга, приводит к неудовлетворительному положению дел в области первичной диагностики данных заболеваний. Возможным путем решения данных проблем может стать использование разработанных нами диагностических тест-систем на базе иммунологических биочипов. Их использование в наиболее простых вариантах методики не требует сложного лабораторного оборудования. Проведение анализа имеет низкую себестоимость за счет малого расхода антител (в 100- 50000 раз меньшего по сравнению с существующими методами). Разработаны различные методики проведения анализа, позволяющие использовать одни и те же биочипы для проведения исследований различного уровня сложности и пригодные для решения широкого круга диагностических и научно- исследовательских задач.
Краткое описание разработки.
Биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенных участках иммобилизованы антитела, способные специфически взаимодействовать с поверхностными антигенами исследуемых клеток.
Методика проведения анализа построена по модульному принципу и включает базовую методику (позволяющую установить содержание в исследуемом образце клеток, имеющих определяемые антигены), которая может дополняться этапами, при которых осуществляются различные дополнительные исследования связанных клеток: морфологическое исследование, цитохимические исследования, определение двух и более антигенов на каждой отдельно взятой клетке и другие. Это намного повышает информативность анализа. Также разработана новая технология проведения анализа, позволяющая резко повысить чувствительность метода и определять антигены, присутствующие на поверхности клеток в очень малых количествах.
Преимущества использования биочипов (по сравнению с существующими способами иммунофенотипирования клеток) 1)Возможность одновременного определения десятков или сотен различных клеточных поверхностных антигенов. 2) Возможность установления содержания в исследуемом образце клеток, экспрессирующих определяемые антигены. 3)Возможность проведения дополнительных исследований клеток (например, морфологического) параллельно с определением их поверхностных антигенов. 4) При установлении коэкспрессии антигенов путем дополнительной обработки меченными антителами на каждой отдельно взятой клетке определяется на 1 антиген больше за счет ее связывания с антителами, иммобилизованными на поверхности биочипа.
Экономические показатели 1) Низкая себестоимость биочипов. (При массовом производстве себестоимость изготовления одного биочипа должна составлять от 10 до 50 рублей). 2) В несколько раз меньшая стоимость проведения анализа. 3) Крайне низкий расход дорогостоящих антител. 3) Возможность широкого внедрения
Общественная значимость. 1) Доступность иммунного анализа для населения. 2) Возможность значительно улучшить диагностику опухолей системы крови и сократить смертность от гематологических заболеваний. 3) Возможность проведения скрининговых исследований, позволяющих выявлять не только опухоли системы крови, но и целый ряд других заболеваний.
Коммерциализация. Предполагается, что коммерциализация разработки будет осуществляться в четыре этапа. 1) Организация опытного производства и проведение испытаний и сертификации. 2) Расширение производства и выход на отечественный рынок; 3) Реорганизация предприятия, дальнейшее расширение производства и занятие российского рынка 4) Выход на международный рынок. Вопросы, связанные с коммерциализацией проекта, более подробно изложены далее.
Информация о заявителе.
(Заявка подана от частного лица)
Руководитель проекта (заявитель и основной исполнитель):
Шишкин Александр Валентинович; кандидат медицинских наук.
Домашний адрес: 426008 г Ижевск, ул. Карла Маркса д. 278 кв. 75.
тел.: моб 8(951)200-75-87, 8(905)783-59-94; e-mail Shishkinlab@yandex.ru Shishkin_lab@mail.ru
В настоящее время являюсь заведующим учебно-экспериментальной лаборатории Ижевской государственной медицинской академии (ГОУ ВПО ИГМА), г. Ижевск. В 2003-2008г. проходил обучение в аспирантуре, а затем работал научным сотрудником в лаборатории физической биохимии системы крови Гематологического научного центра РАМН (ГУ ГНЦ РАМН), г. Москва. Защитил кандидатскую диссертацию на тему «Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов» (03.00.04 биохимия). Научные руководители: профессор Ф.И. Атауллаханов и академик РАМН и РАН А.И. Воробьев.
Опыт научной работы в области создания иммунологических биочипов: 6 лет.
Соисполнитель проекта:
Овчинина Наталья Геннадьевна. В настоящее время проходит обучение в аспирантуре в Ижевской государственной медицинской академии (г. Ижевск). Ранее обучалась в клинической ординатуре по специальности «клиническая лабораторная диагностика» в ГУ ГНЦ РАМН (г. Москва). Опыт научной работы в области данного проекта 1,5 года.
Важнейшие публикации по теме проекта.
- A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, N.G. Ovchinina, S.A. Kuznecova, A.A. Butylin, F.I. Ataullahanov and A.I. Vorob’ev/ Immunological biochips for parallel detection of surface antigens and morphological analysis of cells Biochemistry (Moscow) Supliment Series A: Membrane and Cell Biology.-2008.-Vol..2 -№3-p. 225-230.
- A.V. Shishkin, I.I. Shmyrev, N.G. Ovchinina, S.A. Kuznecova, A.A. Butylin F.I. Ataullahanov Immunological biochips for studies of human erythrocytes/Biochemistry (Moscow) Supliment Series A: Membrane and Cell Biology.-2008.-Vol..2 -№3-p. 217-224.
- N Ovchinina, A Shishkin, Yu Lednev Methods for increasing the biochip immunological sensitivity/ J. Tissue Antigens.- 2008.-Vol.71.- p.395
Инновационный потенциал заявителя (перечень наиболее значимых инновационных проектов, грантов и побед в конкурсах научных работ):
1) Участие в различных мероприятиях в составе творческого коллектива ГУ ГНЦ РАМН.
- НИОКР по теме «Разработка и апробация новых методов и подходов к диагностике и лечению онкогематологических и сопутствующих заболеваний», пункт программы №1: «Разработка новых методов диагностики лимфом на основе экспрессии антигенов с использованием биочипов». 2006-2008г. Заказчик: Государственное унитарное предприятие г. Москвы "Международный научный и клинический центр "Интермедбиофизхим".
- НИОКР «Белковые микрочипы на основе иммуноглобулинов для одновременного определения иммунофенотипа нормальных и опухолевых клеток крови и проведения их морфологических исследований». 2005 г. Заказчик: Департамент Фундаментальных и поисковых исследований в области естественных и гуманитарных наук Минпромнауки России.
- НИР в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» (2004-2006г.) Заказчик: Государственное унитарное предприятие г. Москвы "Международный научный и клинический центр "Интермедбиофизхим".
- НИОКР по теме «Биочипы для определения возбудителей социально значимых инфекций» Заказчик: Фонд содействия развитию малых форм предпринимательства.
- Диплом Конкурса русских инноваций 2004г. Проект «Биологические чипы на основе иммуноглобулинов- медицинские диагностические технологии XXI века».
2) Участие в наиболее значимых мероприятиях в индивидуальном порядке или в качестве представителя других организаций.
- Победа в конкурсе «УМНИК», проводившемся Фондом содействия развитию малых форм предпринимательства в рамках XI Международной школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века» (г. Пущино) 2007г.
- Победа в конкурсе по поддержке научно- исследовательских и опытно конструкторских работ инновационно- активных физических лиц, субъектов малого и среднего предпринимательства, проводившемся Министерством экономики Удмуртской Республики. (г. Ижевск 2008г.)
- Победы в конкурсах научных работ молодых ученых, проводившихся в рамках конференций различного уровня (международные, всероссийские, межрегиональные и др.)
- Участие в Международном форуме по нанотехнологиям, проводившемся корпорацией РОСНАНО (Москва 2008г.) (участие в выставке и стендовый доклад)
- Участие в многочисленных научных конференциях различного уровня.
Современное состояние исследований и разработок в области реализации проекта. Новизна предлагаемого подхода.
Российские разработки.
В России экспериментальные работы в данном направлении, хотя и в значительно меньшем объеме, проводятся в лаборатории физической биохимии системы крови ГУ ГНЦ РАМН (мое прежнее место работы). Усилия сосредоточены главным образом на дальнейшем развитии ранее созданной технологии концентрирования клеток в области пятен биочипа с использованием проточной камеры (см. А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека /Биологические мембраны.- 2008.- №4-С.267-276). Разрабатываемая технология предназначена в первую очередь для научно-исследовательских целей. Работа находится на стадии выполнения НИОКР. Данная разработка решает иные задачи и упоминается здесь в силу использования близких по своей сути технических и научных решений. Фактически работа должна привести к созданию весьма недорогого клеточного сортировщика на базе биочипов, позволяющего выделять небольшие количества клеток, имеющих нужные антигены. Основными потребителями разработки могут стать научно- исследовательские лаборатории. Разработка также может быть использована в медицине для диагностических и иных целей.
Зарубежные разработки.
Основными конкурентами можно считать исследовательские группы из Австралии (Belov L., Huang P., Barber N., Mulligan S.P., Christopherson R.I. и др.), Японии (Ko I.K., Kato K., Iwata H.), Великобритании (Campbell C.J., O'Looney N., ChongKwan M., Robb J.S., Ross A.J., Beattie J.S., Petrik J., Ghazal P. и др.) .
Наиболее существенные результаты, достигнутые этими и некоторыми другими исследователями, описаны в следующих публикациях.
1. Liu A.Y. Differential Expression of Cell Surface Molecules in Prostate Cancer Cells// Cancer Research.-2000.-Vol.60.-P.3429-3434.
2. Belov L, de la Vega O, dos Remedios C.G., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Immunophenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray//Cancer research.- 2001.-Vol.61.-P.483-4489.
3. Belov L., Huang P., Barber N., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Identification of repertoires of surface antigens on leukemias using an antibody microarray //Proteomics.-2003.-Vol.3.-P.2147-2154.
4. Belov L., Huang P., Chrisp J.S., Mulligan S.P., Christopherson R.I. Screening microarrays of novel monoclonal antibodies for binding to T-, B- and myeloid leukaemia cells B// Journal of Immunological Methods.-2005.-Vol.305-P.10-19.
5. Ellmark P., Belov L., Huang P., С Soon Lee, Solomon M. J., Morgan D. K., Christopherson R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers// Proteomics.- 2006.-Vol.6.-P.1791-1802.
6. White S.L., Belov L., Barber N., Hodgkin P.D., Christopherson R. I., Immunophenotypic changes induced on human HL60 leukaemia cells by la,25-dihydroxyvitamin D3 and 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate//Leukemia Research.- 2005.-Vol.29.- P.1141-1151.
7. Woolfson A., Stebbing J., Tom B., Stoner D. M., Gilks W.R., Kreil D.P., Mulligan S.P., Belov L., Chrisp J. S., Errington W., Wildfire A., W.N. Erber, Bower M, Gazzard B., Christopherson R. I., Scott M.A. Conservation of unique cell-surface CD antigen mosaics in HIV-1-infected individuals// Blood.- 2005.-Vol.106. 3.- P.1003-1007.
8. Ko I.K., Kato K. & Iwata H. Antibody microarray for correlating cell phenotype with surface marker //Biomaterials.- 2005.- Vol.26.- P.687-696.
9. Berkeley Researchers Lay Groundwork for Cell Version of
DNA Chip: New Technique Developed for Attaching Biological Cells to Non-Biological Surfaces// .gov (February 6, 2006)
В зарубежных разработках успешно решена проблема автоматизации считывания результата, которое осуществляется с помощью ридеров (считывателей) и конфокальных сканеров. Недостатком является весьма высокая рыночная стоимость такого оборудования. При этом особенности биочипов, созданных за рубежом, не позволяют осуществлять неавтоматизированное считывание результата без использования такого оборудования. В условиях Российского рынка это является весьма серьезным недостатком, не позволяющим использовать данные биочипы в слабо оснащенных лабораториях с низким уровнем финансирования, не способных закупить данные считыватели. В отличие от этого разработанные нами биочипы позволяют проводить считывание результата практически любым возможным способом, как с использованием автоматизации процесса, так и без нее. Это делает возможным проводить анализ в лабораториях с самым различным уровнем оснащенности. При этом изменяется только уровень точности установления содержания в исследуемой суспензии клеток, экспрессирующих определяемые антигены (даже в простейшем варианте точность исследования остается достаточной для диагностических целей). В простейшем случае может осуществляться качественная оценка, вполне достаточная для скрининга и предварительной диагностики на уровне поликлиники или полуколичественная оценка достаточная для постановки окончательного диагноза. При необходимости получения более точного результата те же самые биочипы могут быть повторно исследованы в лаборатории, имеющей ридер. При этом будет количественно и с высокой точностью определено процентное содержание клеток, экспрессирующих каждый антиген.
Кроме того, биочипы большинства зарубежных исследователей в силу особенностей подложки даже в принципе не позволяют осуществлять какие-либо дополнительные исследования связавшихся клеток с помощью методов, использующих микроскопию в проходящем свете. Это значительно снижает информативность анализа. В представленной нами разработке эта проблема успешно решена за счет использования прозрачных и оптически однородных подложек. Например, может быть проведено морфологическое исследование клеток, связавшихся в любом из пятен биочипа. Это позволяет определить, какие именно клетки имеют тот или иной поверхностный антиген. Благодаря этому резко повышается информативность анализа и снимаются противоречия между результатами иммунофенотипирования и морфологического исследования, достаточно часто возникающие в тех случаях, когда эти исследования осуществляются на разных клетках независимо друг от друга.
В работах зарубежных исследователей не решена проблема чувствительности анализа. Используемый способ отмывки биочипов от клеток, не связавшихся с антителами, является слишком грубым. Это искажает результаты анализа, поскольку приводит к отрыву клеток, недостаточно прочно связавшихся с антителами вследствие низкой экспрессии определяемых поверхностных антигенов. В нашей разработке предусмотрена возможность отмывки биочипов в проточной установке оригинальной конструкции, позволяющей создавать поток жидкости с заданной скоростью, достаточной для устранения не связавшихся с антителами клеток, но не приводящей к отрыву клеток, связавшихся с антителами недостаточно прочно.
Во всех конкурирующих разработках не решена проблема предохранения поверхности биочипов от повреждения после выполнения анализа. Это не позволяет в сложных или спорных случаях осуществлять повторное исследование связанных с биочипом клеток через продолжительное время после завершения анализа. В нашей разработке данная проблема успешно решена. Биочипы со связавшимися и окрашенными клетками могут после проведения несложной дополнительной процедуры храниться неограниченно долгое время. При этом может многократно проводиться их микроскопическое исследование с использованием иммерсионных объективов без загрязнения последних, и без какого- либо повреждения поверхности со связанными клетками.
В целом, можно сделать заключение, что зарубежные авторы стараются максимально автоматизировать процесс анализа. При этом они избегают проведения дополнительных исследований клеток, что снижает информативность и диагностическую ценность результатов анализа, а также может в ряде случаев приводить к ошибкам. Основными причинами этого являются 1) исходно не совсем удачный выбор подложек; 2) еще большее повышение стоимости оборудования при полной автоматизации выполнения этих процессов. Следует заметить, что для работы с данными биочипами требуется дорогостоящее оборудование даже при проведении исследований, позволяющих получать те же результаты, что и предлагаемая нами простейшая базовая методика.
Научная и технологическая новизна.
В данной разработке впервые реализован ряд новых подходов.
1) В методику проведения анализа заложен модульный принцип, позволяющий использовать совершенно одинаковые биочипы для решения самых разнообразных диагностических или исследовательских задач и проводить исследования в лабораториях с самым различным уровнем оснащенности оборудованием.
2) Реализована возможность проведения различных дополнительных исследований связанных с биочипом клеток с помощью методов, использующих световую микроскопию. Это позволяет проводить сочетанные исследований клеток, включающие определение поверхностных антигенов с помощью биочипа и проведение одного или нескольких дополнительных исследований. Благодаря этому значительно повышается информативность исследования. Данное нововведение стало возможным благодаря изготовлению биочипов на прозрачных подложках и адаптации соответствующих методик для их использования при анализе клеток на биочипах.
3) Разработан способ проведения анализа на биочипах с использованием весьма недорогой и простой по конструкции проточной установки, позволяющий значительно повысить чувствительность метода.
4) Достигнута возможность неограниченно длительного сохранения биочипа после проведения анализа. При этом возможно многократное микроскопическое исследование биочипа с использованием иммерсионных объективов без какого-либо повреждения поверхности препарата и загрязнения объективов.
Сущность предлагаемой разработки.
Биочип
Биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенных участках иммобилизованы антитела, способные специфически взаимодействовать с поверхностными антигенами исследуемых клеток. Биочипы изготовлены на прозрачных пластиковых подложках, обеспечивающих иммобилизацию антител за счет адсорбции. В имеющихся лабораторных образцах биочипов на подложках в строго определенных участках («пятнах») иммобилизованы мышиные моноклональные антитела (IgG) специфичные к антигенам: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, СD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM. Размеры каждого биочипа составляют 1,1х 2,2 см. В перспективе, панель наносимых на подложку антител может быть увеличена до нескольких сотен. По той же технологии могут быть изготовлены биочипы для определения любых других поверхностных антигенов различных клеток. Они должны найти применение во многих других областях. Биочипы могут храниться без потери свойств не менее 12 месяцев при -26ºC в герметичных контейнерах. Время проведения анализа составляет 4 часа. Имеется принципиальная возможность его сокращения до 1-2 часов.
Методика проведения анализа построена по модульному принципу и включает базовую методику, которая может дополняться вспомогательными методиками (этапами) при необходимости получения дополнительной информации. При этом используются совершенно одинаковые биочипы.
Сущность базовой методики. Базовая методика проведения анализа позволяет установить содержание в исследуемом образце клеток, имеющих определяемые антигены. При инкубации с клеточной суспензией* происходит оседание клеток на поверхность биочипа. Клетки, имеющие на своей поверхности определяемые антигены, связываются с антителами, иммобилизованными в том или ином участке («пятне») биочипа. Не связавшиеся с антителами клетки устраняют путем отмывки биочипа изотоническим раствором. После этого осуществляют фикасцию (например, метанолом) клеток, оставшихся связанными с биочипом. Далее проводят считывание результата, при котором получают изображение пятен биочипа. Далее определяют плотность заполнения связавшимися клетками пятен с различными антителами. Если инкубация биочипа с клетками осуществлялась без перемешивания, плотность заполнения пятен связавшимися клетками (плотность связывания) пропорциональна содержанию в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие антигены. Исходя из значений плотности связывания, может быть определено содержание клеток, экспрессирующих каждый из антигенов.
* Клеточную суспензию получают путем предварительной очистки исследуемого образца от примеси тех типов клеток, которые не имеют антигенов, определяемых с помощью биочипа. Например, для исследования лейкоцитов с помощью имеющихся лабораторных образцов биочипов необходимо выделить их из крови путем центрифугирования в градиенте плотности, либо удалить мешающие проведению анализа эритроциты путем лизиса, вызываемого с помощью специального раствора.
Модификации базовой методики.
Варианты проведения отмывки биочипа.
1) Отмывка биочипа может осуществляться путем его ополаскивания промывочным раствором. Данный способ является наиболее простым, и не требует использования каких-либо дополнительных приспособлений или устройств. Но он является достаточно грубым, поскольку не регулируется скорость потока жидкости. Это затрудняет стандартизацию условий отмывки. Может происходить отрыв клеток слабо связавшихся с иммобилизованными на биочипе антителами. 2) Отмывка биочипа может быть выполнена с использованием проточной установки, состоящей из проточной камеры и насоса. В проточной камере может быть создана такая скорость потока, при которой происходит отрыв только тех клеток, которые были неспецифически связаны с поверхностью биочипа. Клетки связавшиечся с антителами при этом остаются на поверхности биочипа. Использование данного подхода резко повышает чувствительность анализа и позволяет определять даже те антигены, молекулы которых присутствуют на поверхности биочипа в малых количествах. Недостатком является усложнение методики и необходимость использования проточной установки.
Варианты считывания результата и определения плотности связывания клеток.
1) Просмотр пятен биочипа под микроскопом с одновременной оценкой плотности связывания клеток.
2) Получение изображений пятен биочипа (например, путем фотографирования) с последующей качественной, количественной или полуколичественной оценкой плотности связывания клеток, которая может осуществляться с использованием автоматизации (например, с помощью компьютерных программ распознающих изображение) или без нее.
3) Мечение связанных с биочипом клеток с последующим определением плотности связывания клеток по накоплению метки в области каждого пятна. Наиболее простым является флюоресцентное мечение клеток.
4) Окрашивание связанных с биочипом клеток с последующим определением плотности связывания клеток по интенсивности окраски каждого пятна.
Таким образом, базовая методика имеет несколько вариантов различающихся по сложности и набору необходимого оборудования. Наиболее простым является вариант базовой методики, при котором отмывка биочипа осуществляется путем его ополаскивания, а плотность связывания оценивается при просмотре пятен под микроскопом (дается качественная или полуколичественная ее оценка). Минимальный набор необходимого для этого оборудования включает центрифугу с горизонтальным ротором (например, отечественную ОПН-3), автоматическую пипетку и световой микроскоп. Такое оборудование имеется в каждой клинической лаборатории. Поэтому подобный анализ может быть выполнен даже в клинических лабораториях ЦРБ и сельских поликлиник.
Дополнительные методики исследования клеток, связавшихся с биочипом.
Разработано (а часть еще находится в стадии разработки) значительное число различных вариантов методик проведения анализа, при которых осуществляются различные дополнительные исследования связанных клеток: морфологическое исследование, цитохимические исследования, определение двух и более антигенов на каждой отдельно взятой клетке и многие другие. Такой подход позволяет использовать биочипы как для клинических исследований, так и для решения сложных научно-исследовательских задач. При этом резко повышается информативность анализа и появляется возможность одновременного определения нескольких признаков на одних и тех же клетках, что невозможно при использовании других методов.
Схема проведения исследования клеток с помощью биочипа представлена на рис. 1.
Рис. 1 Схема проведения исследования клеток с помощью биочипа.
Наиболее востребованным в рутинной практике должен оказаться вариант исследования, при котором базовая методика дополняется проведением окрашивания клеток и выполнением морфологического исследования. Это позволит определить, какие именно типы клеток имеют каждый из определяемых с помощью биочипа антигенов. При использовании такого подхода для исследования клеток гематологических больных снимаются противоречия между результатами морфологического исследования и иммунофенотипирования встречающиеся в процессе постановки диагноза и способные приводить к ошибкам (которые иногда оказываются фатальными для больных).
Представляется очень перспективным использование для исследования клеток больного не одного, а нескольких биочипов, на которых связавшиеся клетки будут подвергаться различным вариантам дополнительных исследований. Это не только качественно повысит информативность исследования, но и приведет к значительному повышению уровня производства и реализации биочипов.
Предпосылки для создания новой продукции и улучшения функциональных, потребительских и стоимостных показателей.
1) Модульный принцип методики проведения анализа. 2) Изготовление биочипов на прозрачных подложках. 3) Использование подложек из недорогого но, обладающего всеми необходимыми свойствами материала. 4) Возможность проведения считывания и обработки результата, как с использованием автоматизации, так и без нее. 5) Разработка более эффективного способа отмывки биочипов.
Права на интеллектуальную собственность.
В настоящее время поданы заявки на изобретения, которые проходят патентную экспертизу. Патенты еще не получены. Возможна подача еще нескольких заявок на изобретения и полезные модели для патентной защиты новых способов и устройств, разработанных в рамках данного проекта в течение последних нескольких месяцев. Проводится патентный поиск. В случае предполагаемого выхода на зарубежный рынок потребуется оформление патентов в соответствующих странах.
Конкурентные преимущества.
1. Прямые аналоги.
Российские конкуренты.
Экспериментальные работы в близком направлении проводятся в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН (мое прежнее место работы). В данном случае речь идет скорее о сотрудничестве, чем о конкуренции. Разрабатываемая технология сортировки клеток на биочипе предназначена в первую очередь для научно-исследовательских целей. Для завершения НИОКР и начала вывода разработки на рынок потребуется еще не менее 1,5- 2 лет. В принципе, возможно использование этой разработки в диагностических целях в области медицины. Для этого потребуется проведение клинических испытаний и сертификации, прохождение технических испытаний разрабатываемых приспособлений и решение многих других организационных вопросов.
Конкурентные преимущества перед этой разработкой (в случае использования ее для решения тех же задач, которые решает моя разработка) заключаются в модульном принципе проведения анализа, пригодности для использования в лабораториях с самым различным уровнем оснащения и решении значительно более широкого круга задач.
Зарубежные конкуренты.
Зарубежные разработки (см. выше) также еще не вышли на рынок, либо могут находиться на начальных этапах данного процесса. Для их выхода на отечественный рынок необходимо преодоление тех же этапов испытаний и сертификации.
Конкурентные преимущества перед зарубежными разработками.
Конкурентные преимущества биочипов.
- Низкая стоимость биочипов, обусловленная оптимальным выбором материала подложки (низкая стоимость подложки при наличии всех необходимых физических и химических свойств).
- Использование прозрачных подложек, позволяющее проводить исследования клеток с помощью любых методов, использующих световую микроскопию.
- Химическая стойкость подложек, позволяющая осуществлять в процессе анализа многие химические процессы без повреждения биочипа.
Конкурентные преимущества методик проведения анализа.
- Модульный принцип проведения анализа, включающий базовую методику определения содержания клеток имеющих определяемые антигены и разнообразные дополнительные исследования связавшихся клеток (морфологическое, цитохимическое, определение коэкспрессии антигенов и другие). При этом разработаны различные варианты методик выполнения анализа, позволяющие использовать биочипы данного типа, как для клинических скрининговых исследований, так и для решения научно-исследовательских задач различного уровня сложности.
- Возможность проведения анализа с использованием минимального набора наиболее доступного общелабораторного оборудования и считывания результата без использования ридера (в базовом варианте методики, предназначенном для использования в лабораториях ЦРБ и сельских поликлиник).
- Возможность проведения морфологического исследования связавшихся с биочипом клеток. (Это позволяет идентифицировать связавшиеся клетки на основании морфологических признаков, что снижает вероятность ошибки при интерпретации полученных результатов).
- Возможность длительного хранения биочипов после выполнения анализа для проведения повторного или отсроченного морфологического исследования связавшихся клеток.
- Возможность многократного микроскопического исследования (в том числе с использованием иммерсионных объективов) связавшихся клеток без их повреждения и без повреждения поверхности биочипа.
- Возможность использования различных вариантов считывания результата позволяет применять биочипы в лабораториях с различным уровнем подготовки персонала и различной оснащенностью оборудованием.
- Возможность проведения цитохимических исследований связавшихся клеток и оценки их результата путем проведении морфологического исследования.
- Одна из дополнительных методик предусматривает возможность определения коэкспрессии антигенов на связавшихся клетках. Благодаря свойствам подложки биочипа его осуществление возможно не только путем использования иммунофлюоресцентного метода, но и путем проведения иммуноцитохимического исследования, что позволяет отказаться от использования дорогостоящих люминесцентных микроскопов или конфокальных сканеров. При этом возможно сохранение препарата в течение длительного времени.
- Разработан новый способ выполнения отмывки биочипа, позволяющий резко повысить чувствительность анализа и дающий возможность определения слабо экспрессированных антигенов.
Непрямые аналоги (устройства и технологии, решающие те же задачи другими способами).
В настоящее время определение иммунофенотипа клеток осуществляется главным образом путем использования: 1) проточной цитофлюориметрии; 2) иммунофлюоресцентных методов; 3) имммуноцитохимических методов.
Данные методы достаточно широко используются в медицинской практике. Оборудование, необходимое для их осуществления, сертифицировано. Основными производителями реактивов (в том числе, антител), оборудования и расходных материалов являются зарубежные компании. Каждый из «конкурирующих» методов имеет свои достоинства и недостатки.
Имммуноцитохимические (иммуноферментные) методы
Существует большое число модификаций иммуноферментных методов, которые могут быть использованы для установления экспрессии, а также для определения локализации клеточных антигенов. Проведение исследований с использованием данных методов (особенно непрямых) является достаточно трудоемким и длительным. Достоинством иммуноцитохимических методов является то, что для проведения анализа требуется только общелабораторное оборудование. Кроме того, параллельно с определением антигенов возможно проведение оценки ряда морфологических признаков клеток. К недостаткам относится большой расход дорогостоящих антител (в 100-50000 раз больше, чем при проведении анализа на биочипах) и других реагентов. Кроме того, при использовании некомбинированных методов окрашивания возможно одновременное определение только 1 антигена. Рыночная стоимость определения 1 антигена при анализе находится в пределах 500- 1000 рублей в зависимости от использования конкретного иммуноцитохимического метода. При этом выполнение диагностического исследования, обычно требует установления наличия нескольких антигенов, которые определяют независимо друг от друга (в некомбинированных методах).
Иммунофлюоресцентные методы
В целом эти методы, аналогичны иммуноцитохимическим методам, но вместо ферментных меток используются флюорохромные. При использовании прямого метода с применением окраски клеток несколькими антителами, меченными разными флюорохромами возможно одновременное определение нескольких антигенов (обычно не более четырех из-за возможного наложения спектров эмиссии меток). Такой подход более удобен для определения коэкспрессии антигенов. К недостаткам метода можно отнести необходимость использования дорогостоящих люминесцентных микроскопов. Это ограничивает широкое использование данного метода. Кроме того, проведение исследования требует большого расхода антител (в 100-10000 раз больше, чем при анализе на разработанных нами биочипах). При этом цена за определение 1 антигена непрямым методом находится в пределах 700- 1000 рублей. К недостаткам метода можно отнести невозможность длительного сохранения препаратов и невозможность их многократного исследования из-за разрушения («выцветания») метки под действием света. Кроме того, невозможно проведение морфологического исследования клеток, что снижает информативность диагностического исследования и в ряде случаев служит причиной противоречий между результатами иммунофенотипирования и морфологического исследования. Это, в свою очередь, может приводить к диагностическим ошибкам.
Флюоресцентно- меченые антитела производятся рядом биотехнологических компаний. Наименьшую стоимость имеют антитела отечественного производства (например, меченные антитела произведенные ООО «Сорбент», продаются по цене 2600 руб. за количество, достаточное для выполнения 50 тестов). Антитела зарубежного производства стоят значительно дороже- в пределах 1000- 2000 долларов. Люминесцентные микроскопы производятся многими фирмами ЛОМО (Россия, СПб), Leica, Karl Zeis, Opton, Olympus и др. Их цена находится в пределах от 10000 до 30000 долларов.
Проточная цитофлюориметрия
Является наиболее точным из существующих в настоящее время методов. Принцип действия используемых установок широко описан в литературе. Проточные цитофлюориметры обеспечивают полностью автоматизированный анализ всех клеток, присутствующих в образце. При этом определяется экспрессия антигенов (по флюоресценции метки, конъюгированной с антителами, которыми обрабатывается исследуемый образец), осуществляется подсчет клеток и определение их субпопуляций на основании признаков, определяемых физическими методами. К недостаткам можно отнести высокую стоимость оборудования (от 50.000 до 2.500.000$) и высокий расход антител (в 100-50000 раз больше, чем при анализе на разработанных нами биочипах). Одновременно может определяться от 1 до 9 антигенов (на практике обычно 3-4 антигена), что требует выполнения каждого исследования в несколько этапов. Рыночная стоимость выполнения 1 диагностического исследования с определением 15-25 антигенов находится в пределах 4000- 6000 рублей. Производство проточных цитофлюориметров осуществляют компании Beacton Deakcinson и Daco (США).
Конкурентные преимущества разработанных биочипов по сравнению с непрямыми аналогами.
По сравнению со всеми рассмотренными выше непрямыми аналогами использование для иммунофенотипирования клеток созданных нами биочипов представляется весьма привлекательным, поскольку имеет следующие преимущества:
1) возможность одновременного определения на неограниченно большого числа поверхностных антигенов (на разных клетках);
2) возможность определения иммунофенотипа клеток параллельно с проведением их дополнительных исследований (например, морфологического исследования);
3) отсутствие необходимости в использовании дорогостоящих реактивов и оборудования (при использовании базовых методик проведения анализа, предназначенных для скрининга и рутинных клинических лабораторных исследований);
4) крайне низкий расход антител (в 100- 50000 раз меньше)
5) пригодность для массовых, в том числе скрининговых исследований
6) низкая себестоимость проведения исследования.
Для внедрения разработанных нами биочипов в практику необходима организация серийного производства, прохождение клинических испытаний и сертификация. Кроме того, необходимо проведение сертификации разработанных мной дополнительных приспособлений, используемых при проведении анализа с помощью биочипов.