Методические указания к лабораторным работам по биологической химии для студентов 2 курса медицинского факультета Петрозаводск 2002

Вид материала

Содержание

1. Ознакомление с действием амилазы слюны
2. Ознакомление с действием липазы
3. Ознакомление с действием пепсина
4. Ознакомление с действием каталазы
5. Ознакомление с действием тирозиназы
1. Специфичность действия амилазы
2. Специфичность действия сахаразы дрожжей
3. Специфичность действия уреазы
1. Влияние температуры на активность амилазы слюны
2. Определение оптимума рН для амилазы слюны
Ход работы.
1. Реакции на витамин В
Ход работы.
Ход работы.
2. Реакция восстановления витамина В
Ход работы.
3. Реакции на витамин РР (никотиновую кислоту, никотинамид)
Ход работы.
Ход работы.
Ход работы.
...
Полное содержание

Подобный материал:

1 2 3 4

Петрозаводский государственный университет

О Б М Е Н В Е Щ Е С Т В

Методические указания

к лабораторным работам по биологической химии

для студентов 2 курса медицинского факультета

Петрозаводск 2002

Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и технологии «биология»

Печатаются по решению редакционно-издательского совета

Петрозаводского государственного университета

Составители

М. Н. Яковлева, канд. биол. наук;

В. В. Осташкова, канд. биол. наук

Предисловие

Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по разделу «Биохимия белков», выполняемые студентами 2-го курса медицинского факультета в процессе изучения биологической химии. На лабораторных занятиях студенты овладевают современными методами эксперимен-тальных исследований, закрепляют теоретические знания, полученные на лекциях, анализируют результаты. В каждой лабораторной работе излагаются принцип метода, ход эксперимента, советы по оформлению результатов и правила по технике безопасности.

Работа 1. Ознакомление с действием некоторых ферментов

Ферменты (энзимы) – простые и сложные белки, катализи-рующие определенные химические реакции в организме. Так, амилаза слюны катализирует гидролиз -1,4-глюкозидных связей крахмала и гликогена, что приводит к образованию декстринов, а затем мальтозы. Панкреатическая липаза превра-щает ацилглицерины в глицерол и жирные кислоты. Фермент желудочного сока пепсин ускоряет гидролитический распад белков до пептидов. Каталаза расщепляет пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Тирозиназа катализирует превращение тирозина в пигмент меланин.

При ознакомлении с действием фермента сравнивают результаты энзиматической реакции с контрольными пробами, полученными в отсутствие фермента.

1. Ознакомление с действием амилазы слюны

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны, а в другую (контроль) – 0,5 мл дистиллированной воды. Содер-жимое каждой пробирки перемешивают и пробы помещают в термостат при 37 ^оС на 15 минут. Затем в обе пробирки добав-ляют по 1-2 капли раствора Люголя (раствор йода в KJ). В контрольной пробирке появляется синее окрашивание, а в опытной (с амилазой слюны) такая окраска не развивается.

2. Ознакомление с действием липазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 4 мл дистил-лированной воды, 5 мл 1%-го раствора бикарбоната натрия и 1 мл растительного масла. Содержимое пробирок энергично встряхивают до образования эмульсии и в обе пробирки добавляют по 3 капли 0,5%-го спиртового раствора фенол-фталеина. Затем в одну пробирку приливают 1 мл раствора липазы, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Содержимое снова энергично встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37 ^оС на 15-20 минут. В пробирке с липазой раствор становится менее окрашенным или обесцвечивается, в контрольной – остается розовым.

3. Ознакомление с действием пепсина

Ход работы. В две пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора альбумина и денатурируют его нагреванием. Пробирки охлаждают до комнатной температуры, а затем в одну из них добавляют 1 мл раствора пепсина, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Обе пробы помещают в термостат при 37 ^оС на 15 минут. В пробирке с ферментом муть исчезает.

4. Ознакомление с действием каталазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл свежеприго-товленного 5%-го раствора перекиси водорода и в одну из них добавляют 1 каплю крови, в которой содержится фермент каталаза. В пробирке с каталазой наблюдается интенсивное выделение пузырьков кислорода.

5. Ознакомление с действием тирозиназы

Ход работы.

а) Приготовление препарата тирозиназы

10 г измельченного картофеля тщательно растирают в фарфоровой ступке, постепенно прибавляя 30 мл дистиллиро-ванной воды. Полученную гомогенную смесь отжимают через 3-4 слоя марли.

б) Исследование действия ферментов

В две пробирки (опыт и контроль) наливают по 2 мл свеже-приготовленного препарата тирозиназы. Содержимое контроль-ной пробирки кипятят в течение 3 минут и охлаждают. Затем в обе пробирки прибавляют по 1 мл насыщенного раствора тиро-зина. Содержимое каждой пробирки перемешивают, и пробы помещают в термостат при 37 ^оС на 60 минут. Через каждые 5 минут пробирки встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости с воздухом. В опытной пробирке смесь постепенно окрашивается в розовый, красно-бурый и затем черный цвет.

Оформление работы

Запишите результаты опытов. Объясните причину измене-ний в пробах, содержащих ферменты.

Техника безопасности

Соблюдайте правила техники безопасности при работе с электронагревательными приборами.
Будьте внимательны при пользовании спиртовкой.
Осторожно обращайтесь с 5%-м раствором перекиси водорода.

Работа 2. Специфичность действия ферментов

Одним из свойств ферментов является специфичность их действия. Ферменты специфичны по отношению к типу катализируемой реакции и к субстрату, на который они действуют. Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только строго определенные функциональные группы активного центра фермента участвуют в образовании фермент- субстратного комплекса.

1. Специфичность действия амилазы

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5 мл слюны и в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки перемешивают стеклянной палочкой, и пробы поме-щают в термостат при 37 ^оС на 20 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, по 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и после перемешивания нагревают до кипения. В пробирке, содержащей крахмал, выпадает красный или желтый осадок (положительная проба Троммера).

2. Специфичность действия сахаразы дрожжей

Ход работы

1. Для разрушения дрожжевых клеток 0,5 г пекарских дрожжей тщательно растирают в фарфоровой ступке, добавив немного стеклянного песка. Затем продолжают растирание, постепенно приливая 3-5 мл дистиллированной воды, при этом дрожжевая сахараза переходит в раствор. Смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, и полученный фильтрат используют как источник сахаразы.

2. В две пробирки наливают по 1 мл фильтрата, в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора крахмала. Содержимое каждой пробы перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки выдерживают в термостате при 37 ^оС в течение 15 минут. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и нагревают до кипения. В пробирке, содержавшей сахарозу, проба Троммера положительная.

3. Специфичность действия уреазы

Уреаза – фермент, обладающий абсолютной специфич-ностью действия, расщепляет мочевину на аммиак и углекислый газ:

NН₂ уреаза

С = О + Н₂О  2 NН₃ + СО₂.

NН₂

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл раствора уреазы и по 5 капель 1%-го спиртового раствора фенолфта-леина. В одну пробирку добавляют 1 мл 5%-го раствора моче-вины, а в другую – 1 мл 5%-го раствора тиомочевины. Содержимое пробирок перемешивают, и пробы оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Раствор в пробирке с моче-виной окрашивается в розовый цвет вследствие образования гидроксида аммония при выделении аммиака. Аммиак в этой пробирке можно обнаружить и по запаху. Тиомочевина под действием уреазы не расщепляется, поэтому раствор во второй пробирке не окрашивается.

Оформление работы

Запишите полученные результаты и выводы в форме таблицы.

Фермент	Субстрат	Проба Троммера	Вывод

Техника безопасности

Соблюдайте правила пользования электронагревательными приборами.
Будьте внимательны при нагревании растворов на спиртовке.
Осторожно обращайтесь с 10%-м раствором щелочи натрия.

Работа 3. Зависимость каталитической активности ферментов от температуры и реакции среды

Скорость ферментативных реакций зависит от температуры и концентраций водородных ионов в среде. Каждый фермент имеет свой оптимум рН и температуры, при которых активность фермента максимальна.

1. Влияние температуры на активность амилазы слюны

Ход работы. В четыре пробирки наливают по 0,5 мл 0,5%-го раствора крахмала, в другие четыре – по 0,5 мл слюны, разве-денной в 10 раз.

Берут первую пару пробирок (одна с крахмалом, а вторая со слюной, содержащей амилазу) и помещают их в раздробленный лед; вторую пару – оставляют при комнатной температуре, третью пару – помещают в термостат (37 ^оС), а четвертую – в кипящую водяную баню.

Через 10 минут содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 минут при прежних условиях.

Затем из пробирки, стоящей в термостате, отбирают на часовое стекло 3 капли жидкости и добавляют 1 каплю раствора Люголя. Если появляется синее окрашивание, то все пробы выдерживают в разных температурных условиях еще 10 минут, после чего во все четыре пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя и наблюдают за появляющейся окраской.

Если на часовом стекле появляется желто-коричневая окраска, то реакцию с раствором Люголя проводят во всех пробирках сразу же.

2. Определение оптимума рН для амилазы слюны

Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы. Для этого смешивают 1 мл 1%-го раствора крахмала и 0,5 мл слюны, разбавленной в 10 раз. Через каждые 2 минуты отбирают на предметное стекло по 1 капле этой смеси и добавляют к ней 1 каплю раствора Люголя. Крахмал должен полностью расщепиться за 10 минут (желтая окраска пробы с йодом). Если расщепление крахмала происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2-4 раза; если медленнее – уменьшить начальное разведение.

В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буфера соответственно с рН: 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1%-м растворе NаС1) и по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки помещают в термостат при 37 ^оС. Через каждые 3 минуты 1 каплю жидкости, взятой из пятой пробирки, смешивают на предметном стекле с 1 каплей раствора Люголя. Вначале при смешивании образуется синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное. Как только проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание, все пробирки извлекают из термостата, охлаж-дают под струей холодной воды и добавляют по 2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и сравнивают окрашивание.

Оформление работы

Результаты изучения влияния температуры на активность фермента записать в таблицу и отметить температурный оптимум:

№ пробы	Температура инкубации (^оС)	Окраска	Температурный оптимум

Результаты изучения влияния реакции среды на активность амилазы слюны занести в таблицу и отметить оптимальное значение рН для действия амилазы:

№ пробы
РН
Окрашивание с йодом

Техника безопасности

Будьте внимательны и осторожны, работая с кипящей водяной баней.
Соблюдайте правила работы с электронагревательными приборами.

Работа 4. Количественное определение активности каталазы в крови по методу Баха и Зубковой

Фермент каталаза – гемсодержащий хромопротеид, катали-зирующий реакцию разложения перекиси водорода:

каталаза

2Н₂О₂  О₂ + 2Н₂О.

Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в обезвре-живании перекиси водорода – ядовитого конечного продукта некоторых окислительно-восстановительных процессов.

При количественном определении активности каталазы обычно устанавливают количество перекиси водорода, расщеп-ленного ферментом. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество миллиграммов перекиси водорода, кото-рое разлагается каталазой, содержащейся в 1 мкл крови. Показа-тель каталазы – это отношение каталазного числа к количеству эритроцитов (в миллионах) в 1 мкл исследуемой крови.

Метод количественного определения активности каталазы, предложенный А. Н. Бахом и В. С. Зубковой, основан на титро-вании перекиси водорода, оставшейся нерасщепленной после действия фермента, перманганатом калия в кислой среде:

5Н₂О₂ + 2КмпО₄ + 4Н₂SО₄  2КНSО₄ + 2МпSО₄ + 8Н₂О +5О₂.

Ход работы. Свежую кровь разбавляют дистиллированной водой в 1000 раз. Для этого в мерную колбу на 100 мл наливают 20-30 мл дистиллированной Н₂О и осторожно вносят в воду 0,1 мл крови, набранной микропипеткой. Микропипетку несколько раз промывают верхним слоем воды, набирая и выпуская ее в колбу. Затем в мерную колбу доливают дистиллированную воду до метки и содержимое перемешивают. В 1 мл полученного раствора содержится 1 мкл крови.

В две конические колбы (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора крови. В контрольную колбу для инактивации каталазы добав-ляют 3 мл 10%-го раствора серной кислоты. Затем в обе колбы приливают по 10 мл 0,1%-го раствора перекиси водорода, приготовленного на фосфатном буфере (рН=7,0), перемешивают и колбы оставляют на 30 минут при комнатной температуре, после чего прекращают действие фермента в опытной колбе добавлением в нее 3 мл 10%-го раствора Н₂SО_4. Содержимое колб титруют из бюретки 0,01 н раствором перманганата калия до появления не исчезающего розового окрашивания.

Оформление работы

Запишите результаты титрования опытной и контрольной колб и рассчитайте каталазное число по формуле:

КЧ = (В – А)  0,17  f ,

где КЧ – каталазное число;

А – количество 0,01 н раствора перманганата калия (мл), пошедшее на титрование опытной колбы;

В – количество 0,01 н раствора КMnО₄ (мл), пошедшее на титрование контрольной колбы;

f – коэффициент нормальности (поправочный коэффициент) используемого раствора перманганата калия;

0,17 – количество миллиграммов перекиси водорода, соот-ветствующего 1 мл 0,01 н раствора перманганата калия. Это количество легко рассчитать, учитывая, что 1 мл 0,01 н КMnО₄ эквивалентен 1 мл 0,01 н Н₂О₂; 1 грамм-эквивалент Н₂О₂ равен 17 г, поэтому 1 мл 0,01 н Н₂О₂ содержит 0,17 мг Н₂О_2.

Сравните полученный результат с нормой.

Каталазное число крови здорового человека колеблется в пределах 10 – 15. Содержание каталазы в крови снижается при анемии, туберкулезе, злокачественных опухолях.

Техника безопасности

Осторожно обращаться с 10%-м раствором серной кислоты.
Избегать попадания в глаза раствора перманганата калия.

Работа 5. Качественные реакции на витамины

Витамины  низкомолекулярные органические вещества, имеющие разнообразную химическую структуру. Почти все витамины не синтезируются в организме человека и относятся к незаменимым пищевым факторам.

Витамины отличаются от всех других органических веществ пищи двумя признаками: они не входят в состав структуры органов и тканей и не используются организмом в качестве источника энергии. Отсутствие или недостаточное содержание витаминов в пище приводит к развитию тяжелых заболеваний. Нарушение обмена веществ при авитаминозах и гиповита-минозах является следствием снижения активности ферментов, поскольку многие витамины входят в состав простетических групп энзимов. Для обнаружения витаминов в пищевых продуктах, тканях и жидкостях организма и для определения их количества используются качественные реакции, основанные на образовании характерных окрашенных продуктов реакции витамина с каким-либо химическим реагентом.

А. Качественные реакции на водорастворимые витамины

1. Реакции на витамин В₁ (тиамин)

а) Диазореакция на тиамин

При добавлении к раствору тиамина в щелочной среде диазо-реактива образуется сложное соединение этого витамина с диазобензолсульфокислотой, окрашенное в оранжевый или красный цвет. Диазобензолсульфокислота образуется в резуль-тате реакции диазотирования при взаимодействии сульфани-ловой кислоты с нитратом натрия (или калия):

SO₃H SO₃^

 



NaNO₂H₂O + Na⁺

 

NH₂ ⁺ N  N

сульфаниловая диазобензолсульфоновая кислота кислота

Затем диазобензолсульфоновая кислота реагирует в щелочной среде с тиамином с образованием окрашенного азосоединения:

SO₃^



+  Na₂CO₃ NaHCO₃

+ +

 H₂O NaOH

⁺ N  N

тиамин диазобензол-

сульфоновая кислота



азосоединение оранжево-красного цвета

Ход работы. К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1%-го раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 1%-го раствора нитрата натрия, прибавляют 1-2 капли 5%-го раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5-7 капель 10%-го раствора карбоната натрия. На границе двух жидкостей образуется оранжево-красное кольцо.

б) Реакция окисления тиамина

В щелочной среде тиамины окисляются железосинеродистым калием (феррицианидом калия) с образованием окрашенного в желтый цвет тиохрома. Тиохром обладает синей флюорес-ценцией при ультрафиолетовом облучении раствора в флюо-роскопе, и это свойство используется при количественном определении тиамина.

+ 2K₃Fe(CN)₆ + 3KOH 

феррицианид

калия

тиаминхлорид

 + 2 K₄Fe(CN)₆ + KCl + 3 H₂O

ферроцианид

калия

тиохром

Ход работы. 1 каплю 5%-го раствора тиамина смешивают в пробирке с 5-10 каплями 10%-го раствора гидроксида натрия и затем добавляют 1-2 капли раствора железосинеродистого калия. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет вследствие окисления тиамина в тиохром.

2. Реакция восстановления витамина В₂ (рибофлавина)

Окисленная форма рибофлавина  вещество желтого цвета, флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах. Витамин В₂ легко восста-навливается через промежуточные соединения красного цвета (родо-флавин) в бесцветный лейкофлавин. Реакция обусловлена восстановлением рибофлавина водородом, образующимся при добавлении металлического цинка к соляной кислоте. При этом желтая окраска раствора переходит в розовую, затем раствор обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкосоединение вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.



Zn +2HCl ZnCl₂

рибофлавин лейкофлавин

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель 0,025%-й взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентри-рованной соляной кислоты и небольшой кусочек металличес-кого цинка. Наблюдают бурное выделение пузырьков водорода и изменение окраски жидкости.

3. Реакции на витамин РР (никотиновую кислоту, никотинамид)

а) Реакция с ацетатом меди

При нагревании никотиновой кислоты с раствором уксуснокислой меди образуется плохо растворимый синий осадок медной соли витамина РР.

O

– COOH CH₃  C O

2 +  Cu 

N CH₃  C O

O

никотиновая кислота ацетат меди

O O

  

 C  O  Cu  O  C 

 + 2CH₃COOH

N N

никотинат меди

Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5%-го раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок никотината меди.

б) Реакция обнаружения аминогруппы в никотинамиде

При нагревании в присутствии гидроксида натрия амидная связь в никотинамиде разрывается с выделением аммиака.

 CONH₂  COONa



N NaOH NH₃ N

никотинамид никотинат натрия

Ход работы. В пробирку помещают 5-10 мг порошка витамина РР, прибавляют 2 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения. Ощущают запах образующегося аммиака.

в) Реакция с гидросульфитом натрия

Витамин РР восстанавливается гидросульфитом натрия с образованием соединения желтого цвета.

Ход работы. В пробирку вносят 5-10 мг витамина РР, добавляют 1,5 мл 10%-го раствора бикарбоната натрия, перемешивают и прибавляют 1,5 мл свежеприготовленного 5%-го раствора гидросульфата натрия. Жидкость окрашивается в желтый цвет.

4. Реакции на витамин В₆ (пиридоксин)

Активностью витамина В₆ обладают три соединения, объединенных под названием “пиридоксин”:

CH₂OH O = C  H CH₂NH₂

  

пиридоксол пиридоксаль пиридоксамин

а) Феррохлоридная проба на витамин В₆.

При взаимодействии пиридоксина с хлорным железом образуется комплексная соль типа фенолята железа, окрашенная в красный цвет.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл 1%-го раствора витамина В₆, добавляют 2 капли 1%-го раствора хлорида железа и содержимое встряхивают. Жидкость окрашивается в красный цвет.

б) Реакция осаждения витамина В₆.

Пиридоксин, являясь производным пиридина, осаждается фосфорномолибденовой, пикриновой, фосфорновольфрамовой кислотами и другими реактивами на алкалоиды.

Ход работы. К 2-3 каплям 1%-го раствора витамина В₆ добавляют 2-3 капли 1%-го раствора фосфорномолибденовой кислоты и наблюдают появление осадка.

5. Качественные реакции на витамин В₁₂ (кобаламин)

В состав витамина В₁₂ входит кобальт. В результате взаимо-действия ионов кобальта с тиомочевиной при нагревании образуется роданид кобальта зеленого цвета.

Ход работы

1. Содержимое одной ампулы с кобаламином переносят в пробирку, добавляют 3-5 капель концентрированной серной кислоты и нагревают до обесцвечивания в пламени спиртовки, установленной в вытяжном шкафу с включенной тягой. По окончании минерализации в пробирку осторожно, медленно, при постоянном перемешивании добавляют 1 мл дистилли-рованной воды.

2. На беззольный фильтр наносят 2-3 капли 10%-го раствора тиомочевины, осторожно высушивают над пламенем спиртовки. Затем наносят 1-2 капли минерализата В₁₂ и осторожно нагре-вают фильтр над пламенем спиртовки. На фильтре, чаще ближе к краю, появляется зеленое окрашивание.

6. Качественные реакции на витамины группы Р (биофлавоноиды)

Витамины группы Р  производные флавона: рутин, эрио-диктиол, геспередин, кверцетин, эпикахетин и другие. Одним из наиболее активных биофлавоноидов является рутин  глико-зид кверцетина и дисахарида рутинозы:

Рутин

а) Реакция с хлоридом железа

Биофлавоноиды образуют с хлоридом железа комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. Координа-ционные связи возникают между ионом железа и атомами кислорода фенольных гидроксильных групп молекулы витамина.

Ход работы. К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют 3-5 капель 1%-го раствора хлорида железа (FeCl₃). Появляется зеленое окрашивание.

б) Реакция с концентрированной серной кислотой

Концентрированная серная кислота образует с биофлаво-ноидами оксониевые (флавилиевые) соли, растворы которых характеризуются ярко-желтой окраской.

Ход работы. К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки добавляют 0,5-1 мл концентри-рованной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо.

в) Реакция Фелинга на рутин

При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула дисахарида рутинозы, которая затем распадается на глюкозу и рамнозу, обладающих восстанавливающими свойствами.

Ход работы. К 0,5 г порошка рутина приливают 5 мл 0,5%-го раствора соляной кислоты, нагревают при периодическом перемешивании до кипения и кипятят в течение 1 минуты. Пробирку охлаждают, и раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 3 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга (1,5 мл раствора Фелинга  и 1,5 мл раствора Фелинга ). Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, нагревают до кипения и наблюдают образование красного осадка оксида меди ().

7. Реакции на витамин С (аскорбиновую кислоту)

Все качественные реакции на аскорбиновую кислоту основаны на ее способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции. Окисляясь, аскорбиновая кислота превращается в дегидроаскорбиновую, восстанавливая различ-ные соединения:

окисление

 CHOHCH₂ OH  CHOHCH₂OH

восстановление

аскорбиновая кислота дегидроаскорбиновая

кислота

а) Реакция восстановления феррицианида калия

витамином С

Аскорбиновая кислота в щелочной среде восстанавливает феррицианид калия (железосинеродистый калий) до ферроциа-нида калия (железистосинеродистого калия), который при взаимодействии с хлорным железом в кислой среде образует плохо растворимую в воде соль трехвалентного железа  берлинскую лазурь, выпадающую в осадок темно-синего цвета:

1. аскорбиновая + 2К₃Fе(СN)₆ + 2КОН  дегидро- + 2К₄Fе(СN)₆ + 2Н₂О. кислота феррицианид аскорбиновая ферроцианид

калия кислота калия

2. 3К₄Fе(СN)₆ + 4FеС1₃  Fе₄Fе(СN)₆₃ + 12КСl.

ферроцианид берлинская

калия лазурь

Ход работы. В одну пробирку (опыт) вносят 5 капель 1%-го раствора витамина С, а в другую (контроль)  5 капель дистил-лированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 капле 10%-го раствора гидроксида калия и 1 капле 5%-го раствора железо-инеродистого калия, перемешивают, после чего добавляют по 3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и 1 капле 1%-го раствора хлорида железа. В опытной пробирке выпадает темно-синий осадок берлинской лазури, который при осторожном наслаивании воды становится более отчетливым.

б) Реакция восстановления метиленовой сини витамином С

Витамин С обесцвечивает раствор метиленовой сини, восста-навливая ее в лейкосоединение:

аскорбиновая + 

кислота

метиленовая синяя

 дегидроаскорбиновая + +HCl

кислота

лейкометиленовая

синяя

Ход работы. В двух пробирках (опыт и контроль) смешивают по 1 капле 0,01%-го раствора метиленовой сини и 1 капле 10% раствора бикарбоната натрия. В опытную пробирку добавляют 5 капель 1%-го раствора витамина С, а в контроль-ную  столько же дистиллированной воды. Нагревание раство-ров в пробирках приводит к обесцвечиванию жидкости в опытной пробе.

в) Йодная проба на витамин С

Раствор Люголя (раствор йода в йодиде калия) при добавлении к нему витамина С обесцвечивается вследствие восстановления молекулярного йода с образованием йодисто-водородной кислоты.

аскорбиновая  дегидроаскорбиновая

кислота J₂ 2HJ кислота

Ход работы. В две пробирки (опыт и контроль) наливают по 10 капель дистиллированной воды и 2 капли раствора Люголя. В опытную пробирку добавляют 5-10 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты, в контрольную – столько же дистилли-рованной воды. В опытной пробирке раствор обесцвечивается.

г) Серебряная проба на витамин С

При добавлении витамина С к нитрату серебра выпадает в осадок в виде металлического серебра:

аскорбиновая + 2АgNО₃  2Аg + 2НNО₃+ дегидроаскорбиновая

кислота кислота

Ход работы. В две пробирки (опыт и контроль) вносят по 5 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты; затем в опытную пробирку добавляют 1-2 капли 1%-го раствора азотно-кислого серебра, а в контрольную  1-2 капли дистиллирован-ной воды. В опытной пробе наблюдается появление темного осадка металлического серебра.

Б. Качественные реакции на жирорастворимые витамины

1. Реакции на витамин А

H₃C CH₃ CH₃



 (CH = CH  C = CH)₂  CH₂OH

 CH₃

витамин А₁ (ретинол)

Качественные реакции на витамин А основаны на образовании окрашенных соединений сложной структуры.

а) Реакция Друммонда

В присутствии концентрированной серной кислоты ретинол обезвоживается с образованием цветных продуктов реакции.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира и 4-5 капель хлороформа. Смесь хорошо перемешивают встряхиванием и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, быстро переходящее в красно-бурое.

б) Реакция витамина А с сульфатом железа ()

При взаимодействии ретинола с FeSО₄ в кислой среде образуется соединение розово-красного цвета. Каротины дают в этой реакции зеленоватое окрашивание.

Ход работы. К 1-2 каплям рыбьего жира осторожно (работают под тягой) прибавляют 5-10 капель насыщенного раствора сульфата железа (FeSO₄, приготовленного на ледяной уксусной кислоте, и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное.

в) Реакция витамина А с треххлористой сурьмой

В результате водоотнимающего действия хлорида сурьмы (SbCl₃ витамин А превращается в соединение синего цвета. Эта цветная реакция используется для количественного определения витамина А колориметрическим методом.

Ход работы. В совершенно сухую пробирку помещают 1 каплю рыбьего жира и 4-5 капель насыщенного (33%-го) раствора хлорида сурьмы (III) в безводном хлороформе. Появляется синее окрашивание, которое постепенно переходит в розово-фиолетовое.

Внимание! Пробирка должна быть сухой, так как в присутствии воды реакция не идет из-за способности хлорида сурьмы (III превращаться в таких условиях в хлороксид сурьмы, который не может реагировать с ретинолом, вызывая помутнение раствора. Для устранения следов влаги в пробу можно добавить 1-2 капли уксусного ангидрида.

2. Реакция на витамин D

Среди витаминов группы D наиболее распространены эргокальциферол и холекальциферол.

эргокальциферол холекальциферол

(витамин D₂) (витамин D₃)

а) Анилиновая проба на витамин D

При нагревании рыбьего жира, содержащего витамин D, с анилиновым реактивом раствор приобретает красную окраску.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира, 5 капель хлороформа и тщательно встряхивают. Затем добавляют 1 каплю анилинового реактива, содержащего 15 частей анилина и 1 часть концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно при помешивании нагревают до кипения и кипятят примерно 30 секунд. При наличии витамина D желтая эмульсия сначала становится зеленой, а затем красной. При стоянии эмульсия через 1-2 минуты расслаивается, при этом нижний слой окрашен в интенсивно красный цвет.

б) Бромхлороформенная проба на витамин D

При смешивании рыбьего жира, содержащего витамин D, с раствором брома в хлороформе смесь окрашивается в зеленовато-голубой цвет.

Ход работы. В сухой пробирке смешивают 2 капли рыбьего жира и 4 капли раствора брома в хлороформе (1:60). Смесь постепенно приобретает зеленовато-голубую окраску.

в) Реакция витамина D с хлоридом сурьмы (V)

При прибавлении к витамину D насыщенного раствора SbCl₅ смесь окрашивается в желтый цвет.

Ход работы. В сухой пробирке смешивают 6-10 капель витамина D и 1,5 мл хлороформа, добавляют 0,2 мл насыщен-ного раствора хлорида сурьмы (V) и тщательно перемешивают. Наблюдают появление желтого окрашивания.

3. Реакция на витамин Е

Витамины группы Е (токоферолы) являются производными токола, самый активный из них  -токоферол. Качественные реакции на -токоферол обусловлены окислением его в -токо-ферилхинон, окрашенный в красный цвет.



-токоферол



-токоферилхинон

а) Реакция -токоферола с концентрированной азотной кислотой

При прибавлении к -токоферолу концентрированной азотной кислоты раствор окрашивается в оранжевый или красный цвет.

-токоферол  -токоферилхинон

НNО₃ НNО₂ (красного цвета)

Ход работы. В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1%-го спиртового раствора -токоферола и 10 капель концентриро-ванной азотной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают, появляется красное окрашивание. Если образовавшуюся окра-шенную эмульсию поместить в водяную баню при 70 ^оС, она расслаивается, при этом верхний масляный слой имеет красный цвет.

б) Реакция -токоферола с хлоридом железа (III

Добавление к -токоферолу хлорида железа (FeCl₃) вызывает появление красной окраски .

-токоферол  -токоферилхинон

FеС1₃ + Н₂О FеС1₂ + HCl (красного цвета)

Ход работы. 4-5 капель 0,1%-го спиртового раствора -токоферола смешивают с 0,5 мл 1%-го раствора хлорного железа. Смесь тщательно перемешивают и наблюдают появле-ние красного окрашивания.

4. Реакция на витамин К

Витамины группы К являются производными метилнафто-хинона. Высокой витаминной активностью обладает искус-ственно синтезированный аналог витамина К₁ викасол.

2-метилнафтохинон викасол

(менадион)

а) Реакция с цистеином

Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в желтый цвет.

Ход работы. В пробирку вносят 10 капель 0,1%-го спиртового раствора викасола, 5 капель 0,025%-го раствора цистеина и 2 капли 10%-го раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки перемешивают и наблюдают появление желтого окрашивания.

б) Реакция с анилином

При взаимодействии витамина К с анилином образуется соединение, окрашенной в красный цвет. Например:

2 + H₂N – 

анилин

2-метил-1,4,-нафтохинон

(меладион)

 +

2-метил-3-фенил- 2-метил-1,4-дигидрокси-

амино-1,4-нафтохинон нафталин

(красный цвет)

Ход работы. В пробирку вносят 5 капель 0,2%-го спиртового раствора менадиона (приготовленного на этаноле), 2 капли анилина и перемешивают. Смесь окрашивается в красный цвет.

в) Реакция с диэтилмалоновым эфиром

Спиртовой раствор витамина К в щелочной среде с диэтил-малоновым эфиром дает красно-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл 0,1%-го спиртового раствора викасола, 0,5 мл 1%-го раствора диэтилмалонового эфира и 0,1 мл (2 капли) 1%-го раствора гидроксида калия. Развивается красно-фиолетовое окрашивание.

г) Реакция с диэтилдитиокарбаматом

Спиртовой раствор витамина К в щелочной среде в присут-ствии диэтилдитиокарбамата образует соединение, окрашенное в голубой цвет.

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл 0,2%-го спиртового раствора менадиона, 2 мл 5%-го раствора диэтилдитиокарбамата и 0,5 мл 4%-го спиртового раствора гидроксида натрия. Содер-жимое пробирки перемешивают. Раствор приобретает голубое окрашивание.

Оформление работы

Результаты работы оформите в виде таблицы:

№ п/п	Название витамина	Химическая формула витамина	Используемые реактивы	Наблюдаемое окрашивание	Чем обуслов-лена реакция

Техника безопасности

Категорически запрещается отмеривать концентрирован-ные кислоты и щелочи градуированными пипетками.
Будьте внимательны и осторожны при использовании концентрированных кислот (НСl, Н₂SО₄, НNО₃, СН₃СООН) и щелочей (КОН, NаОН).
Осторожно обращайтесь с солями сурьмы и анилином.
В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.
Работу с легкоиспаряющимися растворителями и веществами с резким запахом проводите в вытяжном шкафу при включенной тяге.
Соблюдайте правила пожарной безопасности.

Работа 6. Количественное определение аскорбиновой кислоты методом Тильманса

Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:

O Cl

  

HO

HO + O= = N   ONa 

 HCl NaCl

HOCH 

 Cl

CH₂OH 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия

аскорбиновая кислота (синего цвета)

O Cl

  

O=

  O + HO N OH

O= 

  H

HOCH Cl



CH₂OH

дегидроаскорбиновая 2,6-дихлорфенолиндофенол

кислота (восстановленная бесцветная

форма)

2,6-дихлорфенолиндофенол (краска Тильманса) используется в данном методе не только как окислитель, но и как индикатор, по которому можно установить завершение титрования. В зависи-мости от рН среды 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет разную окраску: в щелочной среде – синюю, в кислой – красную, а его лейкоформа – бесцветна:

Cl



1) O = = N – – ONa – синий



Cl

Cl



2) O = = N– – OH – красный



Cl

Cl



3) HO – – N– –OH – бесцветный



 H

Cl

При определении количества витамина С исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой, титруют 2,6-дихлор-фенолиндофенолятом натрия. Как только все количество вита-мина С, имеющееся в исследуемом растворе, окислится, раствор приобретает розовую окраску, характерную для 2,6-дихлор-фенолиндофенола в кислой среде.

1. Определение количества витамина С в пищевых продуктах и хвое

Аскорбиновая кислота не синтезируется в организме человека. Главным источником этого витамина являются свежие овощи и фрукты. В различных пищевых продуктах содержится следующее количество витамина С (в мг%):

Черная смородина – 100-400

Укроп – 120-135

Лимон – 40-55

Капуста (свежая и квашенная) – 30-40

Томаты – 20-40

Лук зеленый – 16-33

Яблоки северные – 20-40

Яблоки южные – 5-17

Смородина красная – 5-15

Картофель – 7-10

Бананы – 7-10

Печень – 20-50

Селезенка – 20-50

Кумыс – 20-25

Источником витамина С может быть хвоя ели и сосны, содержащая 150-250 мг% (иногда до 400 мг%) аскорбиновой кислоты.

Ход работы

а) гомогенизация биоматериала и экстракция витамина C

Взвешивают определенное количество исследуемого материала:

картофеля, банана - по 5 гр;

капусты, томата, яблока, лимона, укропа, лука – по 2 гр;

хвои – 1 гр.

Навеску измельчают ножом или ножницами, помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают, добавив 2 мл дистиллированной воды. Смесь количественно переносят в мерную колбочку на 25 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки, содержимое перемешивают и через 10 минут фильтруют через бумажный фильтр.

б) количественное определение витамина С в экстракте

В две конические колбочки наливают по 10 мл фильтрата, добавляют 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и пробы титруют при постоянном помешивании из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

2. Определение количества витамина С в шиповнике

Шиповник занимает первое место среди источников витамина С. Количество аскорбиновой кислоты в шиповнике  500-1500 мг%. Плоды некоторых сортов культурного шипов-ника содержат до 2-4,5% витамина С.

Ход работы

а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С

Взвешивают 1 г околоплодника свежих ягод шиповника и далее получают фильтрат, как изложено в разделе 1.

Если анализируют сухие ягоды шиповника, то кусочки околоплодника растирают в порошок в сухой ступке. Навеску пересыпают в мерную колбочку на 25 мл, а пестик и ступку 2-3 раза обливают небольшими порциями дистиллированной воды, сливая воду в ту же колбочку. Затем объем колбочки доводят дистиллированной водой до метки, колбочку закрывают пробкой, содержимое энергично встряхивают в течение 2-3 минут и после 10-минутного стояния фильтруют через бумажный фильтр.

б) Количественное определение витамина С в экстракте шиповника

В две конические колбочки наливают по 2 мл полученного фильтрата шиповника. Добавляют по 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и по 2 мл дистиллированной воды. Пробы титруют при постоянном помешивании 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

3. Определение количества витамина С в моче

Определение количества аскорбиновой кислоты в моче дает представление о запасах этого витамина в организме.

В суточной моче здорового человека содержится 20-30 мг витамина С (или 113,55-170,33 мк моль/ сутки). Это количество снижается при острых и хронических инфекционных заболе-ваниях, особенно у детей.

Однако при гиповитаминозе С содержание витамина в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на недостачу аскорбиновой кислоты в тканях и органах. Поэтому для обнаружения гиповитаминоза С более достоверным являет-ся определение его количества в моче после витаминной нагрузки. У здоровых людей введение per os 100 мг витамина С приводит к быстрому повышению его количества в моче. При гиповитаминозе С ткани, испытывающие недостаток в вита-мине, задерживают аскорбиновую кислоту, и ее концентрация в моче не повышается.

Ход работы. В две конические колбочки отмеривают по 10 мл мочи, 10 мл дистиллированной воды и 1 мл (20 капель) 10%-го раствора соляной кислоты. Содержимое каждой колбочки перемешивают и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

Оформление работы

Рассчитайте количество витамина С в пищевых продуктах, хвое и шиповнике по формуле:

0,088  А  25  100

Х =  ,

Б  В

где Х – содержание аскорбиновой кислоты в мг%;

0,088 – количество аскорбиновой кислоты (в мг%), эквива-лентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (молекулярная масса аскорбиновой кислоты равна 176, а грамм-эквивалент – 88 г);

А – количество 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофе-нолята натрия, пошедшее на титрование (средняя арифмети-ческая двух проб в мл);

25 – общее количество вытяжки в мерной колбочке (в мл);

100 – пересчет на 100 г исследуемого материала;

Б – количество фильтрата, взятое для титрования (в мл);

В – количество исследуемого материала, взятое для анализа (в г);

Сравните полученные результаты с литературными данными.

2. Рассчитайте количество витамина С в моче по формуле:

0,088  А  В

Х = ,

Б

где Х – содержание аскорбиновой кислоты в моче (в мг/сутки);

0,088 – количество аскорбиновой кислоты, эквивалентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (в мг);

А – средняя арифметическая результатов титрования 0,001 н раствором краски Тильманса двух проб мочи (в мл);

В – среднее суточное количество мочи (для мужчин – 1500 мл, для женщин – 1200 мл);

Б – объем мочи, взятый для титрования (в мл).

Техника безопасности

Осторожно обращайтесь с 10%-м раствором соляной кислоты.
Избегайте раздражения кожи рук семенами шиповника.

Работа 7. Определение количества глюкозы

в крови ортотолуидиновым методом

Количество глюкозы в крови является одним из основных показателей углеводного обмена. Нормальное содержание глюкозы в крови у взрослого человека довольно постоянно и колеблется от 3,33 до 5,55 ммоль/л (60-100 мг%), а в плазме крови – 3,88-6,105 ммоль/л (70-110 мг%). Количественное определение глюкозы в крови очень важно для диагностики ряда заболеваний: сахарного диабета, нарушений функций печени, почек, надпочечников, наследственных энзимопатий.

Принцип метода. Определение содержания сахара в крови по цветной реакции с ортотолуидином предложено Hulmann^ом. Метод основан на способности глюкозы реагировать при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты с образованием соединения окрашенного в сине-зеленый цвет:

O CH₃

CH 

CH₃ HCOH N=CH

 HOCH HCOH

NH₂ + HCOH  HOCH

HCOH Н₂О HCOH

CH₂OH HCOH

CH₂OH

о-толуидин глюкоза соединение сине-

зеленого цвета

Интенсивность окраски прямо пропорциональна концент-рации глюкозы и может быть определена колориметрически.

С ортотолуидиновым реактивом реагируют и другие альдо-гексозы, но содержание их в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.

Ход работы

а) Осаждение белков крови трихлоруксусной кислотой

В две центрифужные пробирки (опытную и контрольную) наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты. В опытную пробирку добавляют микропипеткой 0,1 мл крови (или сыворотки крови), а в контрольную – 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (100 мг%). Содержимое пробирок перемеши-вают и пробы центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об./мин.

Во избежание взмучивания осадка на следующем этапе анализа центрифугат из опытной пробирки можно осторожно переливают в сухую чистую пробирку.

б) Цветная реакция с ортотолуидином

В две сухие обыкновенные пробирки переносят по 0,5 мл центрифугата из опытной и контрольной пробы. Затем очень осторожно добавляют мерной пробиркой по 4,5 мл ортотолуи-динового реактива (работу выполняют в вытяжном шкафу с включенной тягой!). Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают стеклянной палочкой, пробирки закрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню точно на 8 минут. После этого пробирки охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры.

в) Определение оптической плотности

Оптическую плотность опытной и стандартной проб измеряют на фотоэлектроколориметре с красным светофильт-ром (длина волны 670 нм) в кюветах на 10 мм против дистиллированной воды.

Оформление работы.

1. Рассчитайте количество глюкозы в исследуемой крови по формуле:

С_ст х Е_оп

С_оп =  ,

Е_ст

где С_оп – концентрация глюкозы в крови (в мг%);

С_ст – концентрация стандартного раствора глюкозы (100 мг%);

Е_оп – оптическая плотность опытной пробы;

Е_ст – оптическая плотность стандартной пробы.

2. Сделайте перерасчет полученного результата в единицах СИ, используя коэффициент 0,0555, так как 1 мг% концентра-ции глюкозы соответствует 0,0555 ммоль/л.

Сравните полученные результаты с нормальными показателями сахара в крови.

Техника безопасности

Соблюдайте особую осторожность при работе с ортотолуи-диновым реактивом, который является раствором о-толуи-дина на ледяной уксусной кислоте и вызывает сильные ожоги кожи и раздражение слизистой оболочки полости рта и носа. При работе с ортотолуидиновым реактивом необходимо использовать вытяжной шкаф с включенной тягой.
Соблюдайте правила работы с электронагревательными приборами.
Остерегайтесь ожогов паром при использовании кипящей водяной бани.
Соблюдайте правила работы на фотоэлектроколориметре.

Работа 8. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы

в биологических жидкостях

Принцип метода. При окислении -D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы (GOD) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (POD) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсив-ность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Исследуемым материалом может быть свежая сыворотка или плазма крови и моча. Если глюкозу определяют в моче, следует предварительно провести качественную реакцию, и только при обнаружении положительной реакции – провести количест-венный анализ.

Blog

Методические указания к лабораторным работам по биологической химии для студентов 2 курса медицинского факультета Петрозаводск 2002

Содержание