Методические указания к лабораторным работам по биологической химии для студентов 2 курса медицинского факультета Петрозаводск 2002
| Вид материала | Методические указания |
- Методические указания к электронным лабораторным работам по курсу физической химии, 2388.82kb.
- Методические указания к лабораторным работам по курсу "Математическое моделирование, 921.14kb.
- Методические указания к лабораторным работам и вопросы для самостоятельной подготовки, 1216.83kb.
- Методические указания к лабораторным работам для студентов специальности 210100 "Автоматика, 536.56kb.
- Методические указания к лабораторным работам №1-5 для студентов специальности 210100, 363.6kb.
- Методические указания по лабораторным работам Факультет: электроэнергетический, 554.73kb.
- Календарно-тематический план лекций по биологической химии для студентов II курса лечебного, 38.26kb.
- Методические указания к лабораторным работам по курсу, 438.32kb.
- Методические указания к лабораторным работам по физике по практикуму «Вычислительная, 138.12kb.
- Методические указания к лабораторным работам для студентов технических специальностей, 621.74kb.
Ход работы
а) подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность
Содержимое флакона № 2, аккуратно перемешивая, раство-ряют во флаконе № 3. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать полученный рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 20-30 минут. Полученный реагент стабилен не менее 6 месяцев при температере хранения 2-4 оС. Необходимо плотно закрывать флакон сразу же после использования. Появляющееся при хранении рабочего реагента розовое окрашивание, если его оптическая плотность против воды не превышает 0,200 при измерении в кюветах на 10 мм (между рабочими гранями), не влияет на правильность результатов анализа. Невскрытые реагенты № 1-3 стабильны в течение года: № 1 и 3 – при хранении при комнатной температуре, № 2 – при 2-4 оС.
б) Анализ
Качественная реакция для выявления глюкозы в моче
К 0,5 мл рабочего реагента добавляют 0,01 мл мочи. Если через 15 минут развивается розовое окрашивание – проба положительна, и можно проводить количественый анализ.
Количественный анализ
В три обычные химические пробирки приливают реактивы в количествах, указанных в таблице:
| Реагент | Опытная проба | Калибровочная проба | Контрольная проба |
| Сыворотка крови (плазма крови или моча) | 0,01 мл | - | - |
| Рабочий реагент | 2,0 мл | 2,0 мл | 2,0 мл |
| Раствор глюкозы | - | 0,01 мл | - |
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 минут при 37 оС или 15 минут при комнатной температуре (20-25 оС). После окончания инкубации оптичес-кую плотность опытной и калибровочной проб измеряют против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 510 нм (ФЭК-490 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при условии отсутст-вия воздействия прямых солнечных лучей.
Расчет. Расчет концентрации глюкозы проводят по формуле:
С = Е0/ Ест. 10,
где Е0 и Ест. – экстинкции образца и стандарта, измеренные относительно контрольной пробы.
В норме содержание глюкозы в сыворотке или плазме крови человека составляет 4,2-6,1 ммоль/л, в моче – 0,8 ммоль/л.
Примечание.
1. Гемолиз (до 0,124 ммоль/л гемоглобина и до 324 мкмоль/л билирубина) не влияет на правильность определения глюкозы.
2. При мытье посуды для анализа и кювет нельзя использовать моющие растворы, содержащие перекись водорода, а также серный, диэтиловый эфир (например, смесь Никифорова)
Работа 9. Влияние физической нагрузки
на содержание глюкозы в крови
Концентрация глюкозы в крови контролируется центральной нервной системой и железами внутренней секреции. Поэтому в здоровом организме возможны лишь кратковременные колеба-ния уровня глюкозы в крови. Так, гипергликемия наблюдается при сильном эмоциональном возбуждении (испуг, радость, страх, плач и т.д.), стрессовых реакциях, болевых приступах. Умереная гиперглюкоземия возникает после физической нагрузки. В этих случаях повышение концентрации сахара в крови связано с выбросом в кровь значительных количеств адреналина, который усиливает распад гликогена в печени.
Ход работы. У испытуемого (добровольца) берут из пальца 0,1 мл крови. Определяют количество глюкозы в крови ортотолуидиновым методом (см. работу 7), затем он выполняет физические упражнения (например, 50-60 приседаний), и через 15-20 минут у него снова берут 0,1 мл крови из пальца для анализа.
Оформление работы
Рассчитайте количество глюкозы в крови до и после физической нагрузки (расчет смотрите в работе 7).
Сравните полученные результаты и объясните причину гипергликемии после физической нагрузки.
Техника безопасности
- Соблюдайте правила взятия крови у испытуемого, используя стерильные материалы и микропипетки.
- Не нарушайте правила техники безопасности при определении количества глюкозы ортотолуидиновым методом (см. работу 7).
Работа 10. Влияние сахарной нагрузки
на содержание глюкозы в крови
Изучение реакции организма на однократную нагрузку глюкозой представляет большой клинический интерес. У здорового человека одноразовый прием 50-100 г глюкозы вызывает временное повышение сахара в крови – пищевую, или алиментарную, гипергликемию.
Однократная проба с сахарной нагрузкой заключается в следующем. Утром натощак у обследуемого определяют содержание сахара в крови, после чего ему дают per os глюкозу (1 г на 1 кг веса) или сахарозу (1,5 г на 1 кг веса) с небольшим количеством воды. Повторно исследуют глюкозу крови через каждые 15 минут в течение первого часа после приема сахара и через каждые 30 минут – последующие три часа. Полученные результаты отражают графически и получают сахарную кривую. При анализе сахарной кривой обращают внимание на начальное содержание сахара, быстроту и высоту подъема, продолжитель-ность гиперглюкоземии и характер ее снижения.
У здоровых людей уже через 15 минут после приема глюкозы концентрация ее в крови повышается и достигает максимума между 30 и 60 минутами. Этот максимум обычно не превышает почечный порог и не приводит к глюкозурии. Затем уровень глюкозы в крови снижается и к 120-й минуте возвра-щается к исходному, а иногда бывает ниже его вследствие избыточного выделения инсулина поджелудочной железой. Через три часа содержание глюкозы в крови возвращается к исходному уровню.
Гликемические кривые отличаются от нормы при сахарном диабете, повреждении паренхимы печени (при гипатитах, циррозе), гипо- и гипертиреозе, болезни Аддисона, тяжелых анемиях, заболеваниях центральной нервной системы, инфек-ционных болезнях, токсических состояниях.
Ход работы. У испытуемого (добровольца) натощак берут из пальца 0,1 мл крови и определяют в ней количество глюкозы ортотолуидиновым методом (см. работу 7).
После взятия крови испытуемому дают съесть сахарозу (из расчета 1,5 г на 1 кг массы) в течение не более 5 минут. Сахар можно запивать небольшим количеством воды.
Затем у испытуемого берут кровь из пальца через 30, 60, 90 и 120 минут после приема сахара и определяют в ней содержание глюкозы ортотолуидиновым методом (см. работу 7)
Оформление работы.
1. Рассчитайте количество глюкозы (в ммоль/л) и полученные данные внесите в таблицу:
| Концентрация глюкозы в крови (ммоль/л) | ||||
| До нагрузки глюкозой | После приема глюкозы, мин | |||
| 30 | 60 | 90 | 120 | |
| | | | | |
2. Постройте сахарную кривую, откладывая на оси абсцис время взятия крови (в минутах), а на оси ординат содержание сахара (в ммоль/л).
3. Проанализируйте полученные данные.
Техника безопасности:
- Соблюдайте правила техники безопасности, указанные в работе 7 и 8.
Работа 11. Влияние инсулина на содержание сахара в крови
Инсулин – гормон поджелудочной железы, вызывающий снижение уровня сахара крови. Гипогликемическое действие инсулина обусловлено тем, что этот гормон усиливает прони-цаемость клеточных мембран для глюкозы и ее утилизацию в качестве энергетического материала тканями, стимулирует синтез гликогена из глюкозы в печени и мышцах, способствует образованию жиров и белков из глюкозы, тормозит глюко-неогенез и распад гликогена в печени.
Ход работы
1. Взятие крови у кролика
Кролика, предварительно голодавшего 24 часа, взвешивают и выстригают шерсть с поверхности уха. Находят краевую ушную вену, ухо слегка массируют, вену зажимают пальцем со стороны, направляют к основанию уха, чтобы она наполнилась кровью. Стерильную иглу вводят в вену на несколько милли-метров, а затем вынимают. Вытекающую по каплям кровь собирают в небольшой стаканчик (бюксик или тигилек), на дно которого заранее помещают несколько кристалликов цитрата натрия (из расчета 1 мг соли на 1 мл крови). Во избежание свертывания кровь в стаканчике постоянно перемешивают с цитратом натрия. После взятия нужного количества крови ранку зажимают ватным тампоном, а затем смазывают иодом.
2. Введение инсулина
Инсулин вводят из расчета 1,5 международные единицы на 1 кг массы кролика. Международная единица (МЕ) инсулина – это такое количество инсулина, которое в течение 4 часов снижает содержание сахара в крови кролика весом 2 кг, предварительно голодавшего 24 часа, до 45 мг% и вызывает у него наступление судорог. Поступающий в продажу препарат инсулина обычно содержит 40 МЕ гормона в 1 мл, что обозначено на этикетке флакона. Для удобства введения этот препарат разводят физиологическим раствором (0,9% раствором хлорида натрия) и рассчитывают, какой объем разведенного раствора необходимо ввести подопытному кролику. Например, при смешивании 2,8 мл физиологического раствора и 0,2 мл препарата инсулина получают 3 мл раствора, содержащего 8 МЕ гормона. Если масса кролика 3 кг, то ему следует ввести 4,5 МЕ инсулина (1,5 МЕ 3 = 4,5 МЕ), которые содержатся в 1,7 мл разведенного раствора.
Разведение препарата инсулина и введение гормона кролику проводят в стерильных условиях. Протирают снаружи рези-новую пробку флакона с инсулином ватой, смоченной спиртом. Иглой стерильного шприца вместимостью 1 мл прокалывают резиновый колпачок флакона, набирают в шприц нужное количество инсулина и переносят в стерильную бутылочку, в которую другим стерильным шприцем (вместимостью 5 мл) добавляют рассчитанный объем физиологического раствора. После перемешивания набирают шприцем требуемое количество разведенного раствора инсулина, вытесняя пузырьки воздуха.
У кролика выстригают шерсть на боку (ближе к животу) и протирают это место спиртом. Левой рукой захватывают кожу и оттягивают ее. Иглу вводят в основание образовавшейся складки кожи, проверяют пальцем, хорошо ли вошла игла (подвижна ли она под кожей), и, нажимая на поршень, медленно вводят инсулин. После введения на место укола кладут вату со спиртом. Отмечают время введения инсулина.
После введения инсулина следует все время наблюдать за кроликом, так как большая доза может вызвать резкое снижение сахара в крови. Особенно чувствительна к снижению уровня глюкозы в крови центральная нервная система, для которой глюкоза – основной источник энергии. Поэтому резкое падение уровня сахара в крови (гипогликемия ниже 45-50 мг%) может вызвать наступление судорог и привести к смертельному исходу. Если у кролика начинаются озноб и судороги, следует немедленно ввести ему подкожно 1 мл 0,1%-го стерильного раствора адреналина или 10 мл 40%-го стерильного раствора глюкозы.
3.Определение сахара в крови
Кролика оставляют в клетке на 60 минут и за это время определяют ортотолуидиновым методом содержание сахара в крови, взятой до введения инсулина (см. работу 7).
Через 1 час после введения инсулина у кролика повторно берут кровь из краевой ушной вены и определяют в ней коли-чество сахара ортотолуидиновым методом.
После окончания опыта кролику обязательно вводят подкожно 10 мл 40%-го стерильного раствора глюкозы.
Оформление работы
Рассчитайте количество глюкозы в крови кролика до и после введения инсулина в ммоль/л (расчет см. в работе 7).
Результаты опыта оформите в виде таблицы:
| Масса кролика (кг) | Доза введенного инсулина (МЕ) | Количество сахара в крови (ммоль/л) | Выводы | |
| до введения гормона | после введения гормона | |||
| | | | | |
Техника безопасности
- Соблюдайте стерильность условий взятия крови, разведения препарата инсулина и введения его подопытному кролику.
- Не нарушайте правил техники безопасности, которые необходимо соблюдать при определении сахара в крови ортотолуидиновым методом (см. работу 7).
Работа 12. Влияние адреналина на содержание сахара в крови
Адреналин – гормон, секре- тируемый клетками мозгового вещества надпочечников. Его физиологическое действие про-является в ничтожно малых количествах (0,0001 мг на 1 кг массы), в высоких концентра-циях является сильным ядом.
Адреналин
Адреналин увеличивает минутный объем сердца, так как повышает силу и частоту сердечных сокращений. Этот гормон стимулирует гликогенолиз в скелетных мышцах и печени и повышает липолиз в жировых депо. Введение адреналина вызы-вает гипергликемию, которая часто сопровождается глюко-зурией.
Адреналин быстро разрушается в кишечно-желудочном тракте, поэтому его вводят подкожно или внутримышечно.
Ход работы
- Кролика взвешивают. Из ушной краевой вены кролика в стерильных условиях берут кровь и определяют в ней коли-чество сахара ортотолуидиновым методом (см. работы 11 и 7).
- Кролику подкожно вводят 0,1%-й раствор адреналина из расчета 0,35 мл на 1 кг массы тела (методика введения – в работе 11).
- Через 30 минут после введения адреналина у кролика повторно берут кровь из краевой ушной вены и определяют в ней количество сахара ортотолуидиновым методом.
Оформление работы
1. Рассчитайте количество глюкозы в крови кролика в ммоль/л до и после введения адреналина (расчет см. в работе 7).
2. Результаты опыта оформите в виде таблицы (см. стр. 47).
Техника безопасности
- Не нарушайте правил техники безопасности, которые необходимо соблюдать при определении сахара в крови ортотолуидиновым методом (см. работу 7).
- Соблюдайте стерильность условий взятия крови и введения адреналина подопытному кролику.
Работа 13. Количественное определение пировиноградной кислоты в крови модифицированным методом Умбрайта
Пировиноградная кислота (ПВК) является одним из промежуточных продуктов обмена углеводов. В анаэробных условиях (при гипоксии) она восстанавливается в молочную кислоту, а в аэробных – подвергается окислительному декарбок-силированию и превращается в ацетил-КоА. ПВК – один из основных источников глюконеогенеза. Она является связующим звеном между углеводным, липидным и белковым обменами.
Вследствие большой скорости реакции превращения пиро-виноградная кислота присутствует в тканях и биологических жидкостях в небольшом количестве. В крови ее содержание составляет 0,3-0,9 мг% (34,07-102,2 мкмоль/л).
Принцип метода. В результате взаимодействия пирови-ноградной кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином образуется гидразон, который в щелочной среде окрашивается в коричнево-красный цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию пировиноградной кислоты в растворе:
H2NNH CH3
CH3
NO2 C = N N H
C=O +
Н2О COOH NO2
COOH
NO2
NO2
ПВК 2,4-динитро- 2,4-динитрофенил-
фенилгидразин гидразон
1. Построение калибровочной кривой
Ход работы. Готовят пять рабочих стандартных растворов пировиноградной кислоты разведением основного стандартного раствора, содержащего 10 мкг ПВК в 1 мл (см. таблицу):
| № пробы | Количество основного стандартного раствора ПВК (мл) | Дистиллированной Н2О (мл) | Содержание ПВК в пробе (мкг) |
| 1 | 0,2 | 0,8 | 2 |
| 2 | 0,4 | 0,6 | 4 |
| 3 | 0,6 | 0,4 | 6 |
| 4 | 0,8 | 0,2 | 8 |
| 5 | 1,0 | - | 10 |
В шестую пробирку (контроль) наливают 1 мл дистилли-рованной воды.
Во все пробирки добавляют по 1 мл 10%-го раствора три-хлоруксусной кислоты, 0,4 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофе-нилгидразина и после перемешивания пробы помещают в темное место на 20 минут при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл 12%-го раствора гидроксида натрия, перемешивают и через 5 минут пробы колориметри-руют против контроля в кюветах на 5 мм с синим светофильт-ром (длина волны 440 нм). Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.
2. Количественное определение пировиноградной кислоты
в крови
Ход работы. В центрифужную пробирку (опыт) вносят 0,7 мл дистиллированной воды, 0,3 мл свежей крови и 1 мл 10%-го раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое перемешивают и через 2-3 минуты центрифугируют при 1500 об./мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость полностью сливают в сухую обыкновенную пробирку, добавляют к ней 0,4 мл 0,1%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина, перемеши-вают и пробу помещают в темное место на 20 минут при ком-натной температуре. Затем в пробирку приливают 1 мл 12%-го раствора гидроксида натрия, перемешивают и через 5 минут колориметрируют, как описано выше. Контрольную пробу готовят так же, как и опытную, но вместо крови берут 0,3 мл дистиллированной воды, но не центрифугируя.
Оформление работы
1. Запишите значение оптической плотности рабочих стандартных растворов пировиноградной кислоты в виде таблицы:
| № пробы | Содержание ПВК в пробе (мкг) | Е1 | Е2 | Е3 | Есред. |
| | | | | | |
Е1, Е2, Е3, - значения оптической плотности одного рабочего стандартного раствора, полученные разными студентами.
2. Постройте калибровочную кривую.
3. Рассчитайте содержание пировиноградной кислоты в исследуемой крови по формуле:
А 100
Х = ,
0,3 1000
где Х – содержание ПВК в крови (в мг%);
А – концентрация ПВК в пробе, найденная по калибровочной кривой (в мкг);
0,3 – объем крови, взятой для анализа;
1000 – коэффициент перевода мкг в мг;
100 – коэффициент пересчета на 100 мл крови.
Техника безопасности
- Соблюдайте правила работы на фотоэлектроколориметре и центрифуге.
- Растворы трихлоруксусной кислоты и гидроксида натрия наливайте осторожно.
Работа 14. Количественное определение общих липидов в сыворотке крови
Общие липиды крови представлены ацилглицеринами, фосфолипидами, холестерином, липопротеидами и свободными жирными кислотами. Содержание общих липидов в сыворотке крови здоровых людей колеблется от 400 до 800 мг%.
Через 1-2 часа после приема пищи наступает алиментарная гиперлипемия с пиком через 4-6 часов, которая исчезает через 10-12 часов. Патологическая гиперлипемия наблюдается при ожирении, диабете, циррозе печени, гепатитах, паренхиматоз-ных желтухах, липоидном нефрозе, гипотиреозе, панкреатите, атеросклерозе. Известны наследственные гиперлипемии (гипер-липопротеинемии).
Принцип метода. Липиды экстрагируют из сыворотки крови смесью Блюра (смесь этанола и диэтилового эфира в соотно-шении 3:1). При взаимодействии липидного экстракта с серной кислотой образуется эмульсия, степень мутности и оптическая плотность которой пропорциональны концентрации липидов.
1. Построение калибровочной кривой
Ход работы. Готовят пять рабочих стандартных растворов и один контрольный, приливая в обыкновенные пробирки реактивы в количестве и последовательности, указанных в таблице:
| № пробы | Количество стандартного раствора липидов (мл) | Количество смеси Блюра (мл) | Количество 1%-го раствора Н2SО4 (мл) | Количество липидов в пробе (мкг) |
| 1 | 0,2 | 1,8 | 10,0 | 200 |
| 2 | 0,5 | 1,5 | 10,0 | 500 |
| 3 | 1,0 | 1,0 | 10,0 | 1000 |
| 4 | 1,5 | 0,5 | 10,0 | 1500 |
| 5 | 2,0 | - | 10,0 | 2000 |
| 6 (Контроль) | - | 2,0 | 10,0 | - |
Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Пробирки закрывают пробками или кусочками фольги и оставляют на 60 минут при комнатной температуре. Затем определяют оптическую плотность рабочих стандартных растворов в кюветах на 10 мм против контроля при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр). Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой.
2. Определение количества общих липидов в сыворотке крови
Ход работы. В пробирку вносят 0,2 мл сыворотки крови и 3,8 мл смеси Блюра. Пробирку закрывают пробкой, встряхивают в течение двух минут, и пробу помещают в водяную баню при температуре 50-60 оС до начала закипания смеси. После охлаж-дения пробирки под струей холодной воды содержимое фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку. Объем полученного экстракта доводят смесью Блюра до 4 мл и переме-шивают. Быстро отмеривают 2 мл полученного экстракта в чистую сухую пробирку, добавляют 10 мл 1%-го раствора серной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, пробирку закрывают пробкой (или кусочком фольги) и оставляют на 60 минут при комнатной температуре. Затем измеряют оптическую плотность раствора при условиях, описанных выше.
Оформление работы
1. Запишите величины оптической плотности стандартных растворов в виде таблицы:
| № пробы | Содержание общих липидов в пробе (мкг) | Е1 | Е2 | Е3 | Есред. |
| | | | | | |
Е1, Е2, Е3 – значения оптической плотности одного стандартного раствора, полученные разными студентами.
2. Постройте калибровочную кривую.
3. Рассчитайте содержание общих липидов в сыворотке крови по формуле:
А х 100
Х = ,
0,1 х 1000
где Х – количество общих липидов в сыворотке крови (мг%);
А – количество общих липидов в пробе, найденное по калибровочной кривой (мкг);
0,1 – количество сыворотки, взятой для анализа (мл);
100 – коэффициент пересчета на 100 мл крови;
1000 – коэффициент перевода мкг в мг.
4. Сделайте выводы.
Техника безопасности
- Приливание и фильтрование смеси Блюра проводят в вытяжном шкафу в связи с наркотическим (снотворным) действием диэтилового эфира.
- Для регулирования необходимого температурного режима водяной бани нельзя включать ее в электросеть (из-за опасности воспламенения используемых реактивов). Для поддержания нужной температуры (50–60 оС) используйте горячую воду (температура кипения диэтилового эфира +36 оС, а этанола +78 оС.).
- Соблюдайте правила техники безопасности при работе на фотоэлектроколориметре.
Работа 15. Определение количества общего холестерола в сыворотке крови методом Илька
Холестерол – основной стерин организма человека. Он выполняет структурную функцию и участвует в синтезе корти-костероидов, половых гормонов, желчных кислот, витамина D3.
Общий холестерол крови состоит из свободного холестерола (30-40%) и его эфиров с высокомолекулярными жирными кислотами – холестеридов (60-70%).
Содержание общего холестерола в сыворотке крови с возрастом увеличивается: у новорожденных – 30-50 мг%, у детей до года – 100-180 мг%, у подростков – 120-200 мг%, у здоровых взрослых людей – 150-250 мг% (3,9-6,5 ммоль/л).
Гиперхолестеринемия наблюдается при атеросклерозе, гипертонии, диабете, нефрите, липоидном нефрозе, микседеме, некоторых заболеваниях печени. Известны наследственные гиперхолестеринемии.
Гипохолестеринемия выявляется при голодании, туберку-лезе, гипертериозе, острых инфекционных заболеваниях, лихо-радочных состояниях, анемиях, остром панкреатите.
Принцип метода. Метод основан на реакции Либермана–Бурхарда. В присутствии концентрированной серной кислоты происходят дегидратация и окисление холестерола. В резуль-тате этой реакции две молекулы холестерола соединяются с образованием непредельных углеводородов, образующих с серной кислотой и уксусным ангидридом производные, окра-шенные в разные цвета (красный, фиолетовый, синий, зеленый). При небольшой концентрации холестерола в растворе сразу появляется зеленая окраска, интенсивность которой опреде-ляется колориметрически.
2
2Н2О 2Н+, 2ē
холестерол
бихолестадиен
(синего цвета)
1. Построение калибровочной кривой
Ход работы. Осторожно (под тягой!) готовят пять рабочих стандартных растворов холестерола, наливая в сухие пробирки 0,1%-й раствор холестерола и реактив Илька в количестве и последовательности, указанных в таблице:
| № пробы | Стандартный 0,1% -й раствор холестерола (мл) | Реактив Илька (мл) | Количество холестерола в пробе (мкг) |
| 1 | 0,05 | 2,05 | 50 |
| 2 | 0,10 | 2,00 | 100 |
| 3 | 0,15 | 1,95 | 150 |
| 4 | 0,20 | 1,90 | 200 |
| 5 | 0,25 | 1,85 | 250 |
Пробирки сразу закрывают пробками и встряхивают корот-кими энергичными движениями 10-12 раз; затем пробы поме-щают в темное место и выдерживают 20 минут при комнатной температуре.
После этого стандартные растворы колориметрируют в закрытых крышками кюветах на 5 мм при длине волны 650-660 нм (красный светофильтр) против контроля, которым является реактив Илька. Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.
2. Определение количества холестерола в сыворотке крови
Ход работы. В сухую пробирку вносят микропипеткой 0,1 мл сыворотки крови и осторожно (под тягой!) добавляют 2 мл реактива Илька. Пробирку немедленно закрывают пробкой, быстро встряхивают 10-12 раз и помещают в темноту при комнатной температуре на 20 минут. Затем измеряют оптичес-кую плотность окрашенного в зеленый цвет раствора при условиях, описанных выше. Количество холестерола в пробе находят по калибровочной кривой.
Оформление работы
- Запиiшите величины оптической плотности стандартных растворов в виде таблицы:
| № пробы | Содержание холестерола в пробе (мкг) | Е1 | Е2 | Е3 | Е сред. |
| | | | | | |
Е1, Е2, Е3 - значения оптической плотности одного рабочего стандартного раствора, полученные разными студентами.
2. Постройте калибровочную кривую.
3. Рассчитайте содержание холестерола в сыворотке крови по формуле:
А х 100
Х = ,
0,1 х 1000
где Х – количество холестерола в исследуемой сыворотке (мг%);
А – количество холестерола в пробе по калибровочной кривой (мкг);
0,1 – количество сыворотки крови, взятое для анализа (в мл);
100 – коэффициент пересчета на 100 мл крови;
1000 – коэффициент пересчета мкг в мг.
4. Пересчитайте полученные результаты в единицах СИ (ммоль/л), используя коэффициент 0,0258.
5. Сделайте выводы.
Техника безопасности
- Во избежание химических ожогов будьте предельно осто-рожны при наливании реактива Илька и стандартного раст-вора холестерола. Реактив Илька является смесью трех кон-центрированных веществ: ледяной уксусной кислоты, уксус-ного ангидрида и серной кислоты, взятых в соотношении 1:5:1. Основной стандартный раствор (0,1%-й раствор холес-терола) приготовлен на ледяной уксусной кислоте.
- Категорически запрещается набирать реактив Илька и стандартный раствор холестерола стеклянными пипетками (насасывая их ртом). Для отмеривания этих растворов необ-ходимо пользоваться автоматическими пипетками или мер-ными пробирками (или стеклянными градуированными пипетками с длинной резиновой трубкой и стеклянным наконечником).
- В работе используйте только сухую чистую посуду.
- Всю работу с реактивом Илька и стандартным раствором холестерола проводите с использованием вытяжного шкафа при включенной тяге, так как уксусная кислота и уксусный ангидрид обладают резким неприятным запахом и вызывают раздражение слизистых глаз и носоглотки.
- После заполнения кювет растворами сразу закрывайте их специальными крышками.
- По окончании колориметрирования растворы из кювет выливайте только в специально предназначенную посуду, находящуюся в вытяжном шкафу.
- Соблюдайте правила техники безопасности, пользуясь вытяжным шкафом и фотоэлектроколориметром.
Работа 16. Определение содержания липопротеидов низкой плотности
в сыворотке крови по методу Бурштейна
Липопротеиды низкой плотности (ЛНП, ЛПНП, -липо-протеиды) составляют 60-70% всех липопротеидов крови. ЛНП – это белково-липоидные комплексы с молекулярной массой 2–4 х 106, диаметром частиц 20-25 нм и относительной плот-ностью 1,006-1,063. Они состоят из белков (21-25%), три-ацилглицеринов (7-13%), фосфолипидов (22-24%), свободного холестерина (7-10%) и холестеридов (40-45%). ЛНП образуются в гепатоцитах и плазме крови из хиломикронов и липопротеи-дов очень низкой плотности (ЛОНП). Катаболизм ЛНП происходит в печени (50%) и других тканях (50%). ЛНП поглощают холестерин из других липопротеидов и участвуют в транспорте холестеринов и фосфолипидов.
Содержание ЛНП в крови здоровых людей зависит от возраста и пола и составляет 350-600 мг% (3,5-6,0 г/л). Количество ЛНП в крови повышается при ожирении, атеро-склерозе, гепатитах, механической желтухе, диабете, гликоге-новой болезни, ксантоматозе. Снижение уровня ЛНП крови происходит при В2-плазмоцитоме.
Принцип метода. Метод основан на способности ЛНП к образованию комплекса с гепарином. Этот комплекс в присут-ствии хлорида кальция выпадает в осадок, вызывающий помутнение раствора. Интенсивность помутнения определяется колориметрически.
Ход работы
1. В сухую пробирку наливают 2 мл 0,27%-го раствора хлорида кальция, добавляют микропипеткой 0,2 мл сыворотки крови и перемешивают.
2. Определяют оптическую плотность (Е1) раствора в кюветах на 5 мм при длине волны 630 нм (красный свето-фильтр) против контроля, которым является 0,27%-й раствор хлорида кальция.
3. В кювету с сывороткой добавляют микропипеткой 0,04 мл 1%-го раствора гепарина, содержимое осторожно перемешивают тонкой стеклянной палочкой и точно через 4 минуты снова определяют оптическую плотность в тех же условиях.
Оформление работы
1. Рассчитайте содержание ЛНП в сыворотке крови по формуле:
Х = (Е2 – Е1) х 1000 ,
где Х – количество ЛНП в исследуемой сыворотке (в мг%);
Е1 – оптическая плотность раствора перед добавлением гепарина;
Е2 – оптическая плотность раствора после добавления гепарина;
1000 – эмпирический коэффициент пересчета на мг%. При пересчете количества ЛНП в г/л эмпирический коэффициент равен 10.
2. Сделайте выводы.
Техника безопасности
- Соблюдайте правила техники безопасности при работе на фотоэлектроколориметре
работа 17. Количественное определение общего холестерола в сыворотке крови энзиматическим методом
Принцип метода. При гидролизе холестеридов холестерол-эстеразой образуется свободный холестерол: