Комплексная оценка функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов при бластоцистной инвазии 03. 03. 01 физиология

Вид материала

Автореферат

Содержание Ильина Наталья Анатольевна Гондарева Людмила Николаевна доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна Общая характеристика работы Целью работы Научная новизна работы. Практическая значимость работы Апробация работы. Структура и объем диссертации. Объект и методы исследования Создание экспериментальной модели Воспроизведения экспериментального бластоцистоза. Определение количества лейкоцитов периферической крови у экспериментальных животных Определение фагоцитарной реакции полиморфноядерных лейкоцитов крови. Тест с тетразолием нитросиним. Определения уровня катионных белков нейтрофильных гранулоцитов. Определения активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах. Методика выявления кислой фосфатазы. Методика выявления щелочной фосфатазы. Blastocystis spp Таблица 2 – Размеры бластоцист ... Полное содержание

Подобный материал:

• Патофизиологическое обоснование применения препаратов метаболического типа действия, 308.49kb.
• Элективный цикл, 36.5kb.
• Гоу спо «Саратовский областной химико-технологический техникум» Методические указания, 433.37kb.
• Оценка элементного статуса в определении нутриентной обеспеченности организма. Значение, 325.18kb.
• Простейшая комплексная оценка финансового состояния предприятия на основе нечетко-множественного, 181.89kb.
• Особенности морфологического и гормонально-метаболического статуса спортсменок-борцов, 533.99kb.
• Методика № комплексной оценки персонала и условий его мотивации общие положения, 122.42kb.
• Календарно-тематический план лекций по биологии для студентов факультета медицинской, 44.56kb.
• Роль метаболического и антиоксидантного статуса в возникновении омфалита у новорожденных, 484.86kb.
• Методика обоснование рационального размещения автозаправочных станций в Санкт-Петербурге, 734.96kb.

На правах рукописи

Захаров Александр Алексеевич


КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СТАТУСА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ
ПРИ БЛАСТОЦИСТНОЙ ИНВАЗИИ


03.03.01 – физиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Ульяновск - 2011

Работа выполнена на кафедре анатомии, физиологии и гигиены в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ильина Наталья Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гондарева Людмила Николаевна доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный педагогический университет имени И.Я. Яковлева»


Защита состоится «16» июня 2011 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу: Набережная реки Свияги, 106, корп.1, ауд.703.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом на сайте вуза ссылка скрыта


Отзывы на реферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул. Л.Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.


Автореферат разослан «14» мая 2011 года.


Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н., доцент Пантелеев С.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы.

Нейтрофильные гранулоциты являются одним из основных компонентов неспецифической системы иммунитета и мобилизируются организмом уже на начальных этапах защитных реакций.

По современным данным, нейтрофильные лейкоциты, подвергаясь каскадным влияниям различных цитокинов, способны изменять свой количественный и субпопуляционный состав, перестраивать свою функциональную активность, секретировать многочисленные ферменты, медиаторы (в том числе и цитокины), активные формы кислорода, чтобы в конечном итоге реализовать свой физиологический потенциал – фагоцитоз и киллинг, уничтожая вирусы, бактерии, аллергены, неопластические клетки (Антонаева И.И.; 2007, Нестерова И.В., 2005; Romani L., 1997).

Бластоцисты относят к условно-патогенным микроорганизмам (Белова Л.М., 1992; Zierdt C.H., 1988). Находясь в кишечнике, они участвуют в формировании микробиоценоза данного биотопа. При снижении резистентности макроорганизма бластоцисты способствуют созданию благоприятных условий для развития патологических процессов (Потатуркина-Нестерова Н.И. с соавт., 2004; Rivera W., Tan M., 2005; Iguchi A. et al., 2007).

Известно, что слизистая оболочка кишечника является местом первого контакта с большим числом потенциальных антигенов (эндотоксинов, вирусов, протеингликанов бактериальной оболочки и др.) (Ардатская Н.Д. с соавт., 2001; Бондаренко В.М. с соавт, 2003; Гасанова Т.А. с соавт, 2007).

Актуальность данного исследования определяется тем, что условно-патогенные микроорганизмы, в частности бластоцисты, в последние годы рассматриваются как одна из причин, вызывающая патологические процессы в толстой кишке (Онищенко Г.Г., 2002, 2007; Романенко Н.А., 2002).

Занимая одну из самых активных позиций в системе клеточно-гуморальной кооперации, нейтрофильные лейкоциты периферической крови выступают высокочувствительным индикатором нарушений гомеостаза. В то же время, секреторная активность нейтрофилов при бластоцистной инвазии до настоящего времени не изучена.

Вышеизложенное диктует необходимость комплексного изучения показателей функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови в динамике развития бластоцистоза.

Целью работы является комплексная оценка функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов периферической крови при бластоцистной инвазии.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Выявить роль бластоцистной инвазии в возникновении паразитозов у свиней в Ульяновской области.
   
2. Получить модель экспериментального бластоцитоза на мышах и изучить динамику количественных показателей периферической крови в динамике развития бластоцистной инвазии.
   
3. Оценить состояние фагоцитарной активности нейтрофилов на различных этапах бластоцистной инвазии у мышей.
   
4. Дать характеристику кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов биоцидности нейтрофильных гранулоцитов в динамике бластоцистной инвазии.
   

Научная новизна работы.

Впервые проведено комплексное исследование показателей функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе.

Установлено, что при развитии экспериментального бластоцистоза происходит фазное изменение количественных и функциональных характеристик нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, свидетельствующих об активации неспецифического звена иммунитета.

Получены оригинальные данные о структуре паразитоценоза кишечника свиней в Ульяновской области, установлено превалирование протозойных паразитов, среди которых доминируют Blastocystis spp.

Впервые показано, что изменения функционально-метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов носят разнонаправленный характер. Установлено, что в основе изменения содержания микробицидных компонентов и метаболической активности нейтрофилов лежит угнетение катионных белков на фоне повышения активности миелопероксидазы, щелочной и кислой фосфатаз, а также возрастания количества активных нейтрофилов НСТ-теста и фагоцитоза.

Впервые установлено, что все изменения активности компонентов микробицидной системы фагоцитов различаются по характеру и глубине проявлений на разных этапах компенсаторной реакции организма.

Практическая значимость работы.

Результаты проведенных исследований позволяют использовать полученные результаты в повышении эффективности свиноводства, т.к. являются основой для проведения лечебно-профилактических мероприятий по борьбе с паразитарными инвазиями животных.

Установленные данные по нарушению микробиоты кишечника, увеличению общего количества лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, внешним проявлениям патологического процесса целесообразно применять при оценке здоровья поголовья свиней в животноводческих хозяйствах.

Установленные фазные изменения количественных показателей и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, связанные с последовательными этапами развития бластоцистоза, позволят достоверно оценивать функционально-метаболический статус этих клеток, являющихся важнейшими клеточными элементами внутренней среды, которые мобилизуются организмом в защитных реакциях.

По материалам диссертационной работы написаны практические рекомендации: Методы исследования функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов. Захаров А., Ильина Н.А., Практические рекомендации. Ульяновск. 2009 г. 17 с., Изменение физиологического статуса макроорганизма (на примере свиней) при бластоцистной инвазии. Захаров А. Практические рекомендации. 2009 г. 25 с.

Результаты исследования используются в процессе преподавания физиологии и паразитологии на естественно-географическом факультете ГОУ «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова» (Акт о внедрении от 15.09.2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При экспериментальном бластоцистозе у мышей имеет место увеличение абсолютного и относительного количества нейтрофилов периферической крови на пике патологического процесса.
   
2. Показатели базального и стимулированного фагоцитоза нейтрофилов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе у мышей зависели от фазы патологического процесса, при этом показатели стимулированного фагоцитоза в течение всего исследуемого периода были значительно ниже нормы.
   
3. Активация системы «кислородного взрыва», развивающаяся на 9-12 сутки экспериментального бластоцистоза, сменяется дальнейшей ее супрессией (16 сутки и далее), в то время как для кислороднезависимых механизмов характерно разнонаправленное действие – повышение активности щелочной и кислой фосфатаз на фоне снижения уровня катионных белков.
   

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на: Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2008, 2009), Всероссийской заочной электронной научной конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва, 2008), Международном молодежном научном форуме «Университетское образование: традиции и инновации» (Ульяновск, 2009, 2010), III Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010), Международная научная конференция «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Москва, 2010), VII Международной научно-практической интернет-конференции «Наука и современность» (Новосибирск, 2010), III Международной научно-практической дистанционной конференции «Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы» (Москва, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 132 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Библиография содержит 214 источников, из них 112 отечественных и 102 иностранных. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 23 рисунками.


ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


Объект исследования

При изучении паразитоценоза кишечника и характера его проявлений было обследовано 263 свиньи на свиноводческих фермах Ульяновской области. В ходе исследования наблюдали за общим состоянием животных, производили периодическое взвешивание и отмечали характер стула. Контрольную группу составили 72 здоровых свиней, у которых отсутствовали паразитарные инвазии.

Для исключения влияния суточных ритмов на результаты исследований проводили в одно и то же время суток, обычно в утренние часы, как у опытных, так и контрольных животных.

Изучение паразитоценоза проводили в соответствии с Методическим указанием МУК 4.2.735-99 «Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов», утвержденных главным государственным санитарным врачом РФ 25.02.1999 г.

Изоляты Blastocystis spp. получали из фекалий свиней. Выявление бластоцист в препаратах проводили путем микроскопии нативных и окрашенных мазков.

Культивирование бластоцист проводили с использованием сред Suresh СЕМ, Zierdt и Павловой. Среда Suresh СЕМ (Suresh et al., 1994) содержит экстракт дрожжей, однозамещенный фосфорнокислый калий и двузамещенный фосфорнокислый калий, лошадиную сыворотку, бактериальнорастворимые продукты. Для культивирования бактерий и микроскопических грибов применяли искусственные питательные среды, рекомендуемые Приказом №535 от 22.04.1985 МЗ РСФСР.

Создание экспериментальной модели.

Эксперименты по изучению функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови при экспериментальном бластоцистозе проводили на нелинейных лабораторных мышах массой 23 - 25 г, которых содержали в условиях постоянного температурного режима (20^о-25°С) и стабильной освещённости. Животные получали полноценное питание. Перед проведением экспериментов и опытные, и контрольные группы находились в карантине. В этот период наблюдали за общим состоянием животных, производили периодическое взвешивание. Для исключения влияния суточных ритмов на результаты экспериментов все манипуляции (введение культуры, взятие крови и т.д.) проводили в одно и то же время суток, обычно в утренние часы, как у опытных, так и контрольных животных. Перед началом эксперимента у всех опытных мышей определяли общее количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. В работу брали только тех животных, у которых количество лейкоцитов соответствовало норме. Экспериментальный бластоцистоз воспроизводили по методике К.Т. Moe (1997) на мышах-самцах, массой 23-25 г. С целью контроля на наличие бластоцист у этих животных, их испражнения засевали на питательные среды.

Воспроизведения экспериментального бластоцистоза.

Экспериментальный бластоцистоз воспроизводили по методике К.Т. Moe (1997) на мышах-самцах, массой 23-25 г. С целью контроля на наличие бластоцист у этих животных, их испражнения засевали на питательные среды.

Определение количества лейкоцитов периферической крови у экспериментальных животных.

Содержание количества лейкоцитов в крови было изучено по методу Н.М. Николаева в счетной камере Горяева.

Расчет лейкоцитов проводили, учитывая разведение крови, число сосчитанных квадратов и объем одного большого квадрата (1/250 мкл, так как сторона квадрата 1/5 мм, высота 1/10 мм) (Меньшиков с соавт.,1987).

, т.е. , где

x - число лейкоцитов в 1 мкл; а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах.

Определение фагоцитарной реакции полиморфноядерных лейкоцитов крови.

Принцип метода основан на количественном определении поглощенных и переваренных нейтрофилами микроорганизмов при совместной инкубации исследуемой крови с микробной тест-культурой (Staphylococcus aureus).

Показатели фагоцитарной реакции полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) крови определяли, используя тест-систему, предложенную НПКО «Реакомплекс».

Для определения поглотительной способности нейтрофилов из полученной взвеси готовили мазки на предметных стеклах, затем препараты высушивали на воздухе, фиксировали в смеси Никифорова 10 минут и окрашивали по Романовского-Гимза.

Подсчет поглощенных микробов вели в 200 нейтрофилах. Поглотительную способность фагоцитов оценивали по фагоцитарному индексу, то есть проценту фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, и фагоцитарному числу микробов, поглощенных одним активированным нейтрофилом (Карпищенко А.И., 1999)

Тест с тетразолием нитросиним.

Метод основан на цитохимическом выявлении темно-синих гранул диформазана, которые образуются в цитоплазме нейтрофила в результате восстановления нитросинего тетразолия (Земсков В.М.,1988). Подобная реакция обозначается как спонтанный тест НСТ, она осуществляются благодаря активации кислородзависимой биоцидности фагоцита.

Мазок крови окрашивали дважды: по Паппенгейму и второй раз тетразолиевым нитросиним. Окраска по Паппенгейму наиболее качественный метод окраски и представляет собой комбинацию методов Мая – Грюнвальда и Романовского-Гимзы.

Определения уровня катионных белков нейтрофильных гранулоцитов.

Катионные белки лизосом нейтрофилов в нейтральной среде способны связывать анионный краситель бромфеноловый синий. Степень гранулярного синего окрашивания цитоплазмы пропорционально содержанию катионных белков в клетках. Поскольку катионные белки обладают протеолитическими и бактерицидными свойствами, по количеству гранул и по интенсивности их окраски можно судить о состоянии кислороднезависимой биоцидной системы нейтрофилов. Снижение ее показателей ниже 2,4±0,25 свидетельствует о дефектности кислороднезависимых антимикробных систем нейтрофилов.

Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов и вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) (Карпищенко, 1999).

Определения активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах.

Активность фермента определяется по появлению в цитоплазме нейтрофилов (n=100) окрашенного продукта пероксидазной реакции – оксибензидина. Оксибензидин окрашивает места локализации пероксидазы в желто–коричневый цвет, под микроскопами эти участки выглядят как жёлто-коричневые гранулы. Степень окрашивания цитоплазмы нейтрофилов пропорциональна активности миелопероксидазы. Результат вычисляли через средний цитохимический коэффициент (СЦК) (Карпищенко, 1999).

Методика выявления кислой фосфатазы.

Мазки крови исследовали под микроскопом в иммерсионной среде. В местах локализации кислой фосфатазы отмечалось окра­шивание в коричневый цвет. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) (Шубич М.Г., 1980).

Методика выявления щелочной фосфатазы.

Места локализации щелочной фосфатазы определялись в ви­де гранул коричневого цвета. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) (Шубич М.Г., 1980).

При проведении цитохимических исследований применялась оценка результатов по L.S. Kaplow (1955) в модификации G. Astaldi и L.Verga (1957), основанная на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов.

Картина распределения и количества осадка позволила разделить клетки на четыре типа по степени активности фермента:

«0» - отсутствие фермента, цитоплазма не окрашена

«1» - слабое диффузное окрашивание, единичные гранулы в цитоплазме

«2» - диффузная окраска с умеренным количеством гранул

«3» - сильно положительная реакция с многочисленными гранулами

Повышенная активность фермента находит отражение в увеличении среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для определения СЦК количественное выражение результатов проводилось путём подсчёта 100 нейтрофилов с их дифференцировкой по описан­ному выше принципу. Число клеток с одинаковой активностью окраски ум­ножали на цифру, соответствующую данному типу степени активности фермента. Сумма этих произведений, делённая на 100, и представляет собой СЦК для одной клетки:



Готовые мазки периферической крови исследовали под микроскопом в иммерсионной среде объективом ×90, окуляром ×10.

Методы статистического анализа.

Статистическую обработку результатов исследований выполнили с помощью программы Stata 6.0. Достоверными считались различия при уровне вероятности менее 5% (p<0,05). Графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Exel-2000.


Исследование видового состава паразитоценоза кишечника свиней


На основе анализа эффективности известных диагностических методов в качестве программы мониторинга паразитоценоза кишечника этих животных была использована диагностическая система КТ-ФЭО-МЦН, так как она вследствие использования консерванта Турдыева (КТ) позволяет длительное время сохранять морфологию всех стадий развития кишечных паразитов.

Исследование видового состава паразитоценоза кишечника свиней выявило более выраженную инвазированность животных простейшими по сравнению с другими группами паразитов. Так, простейшие были выявлены у 92,6% свиней, тогда как гельминты – лишь у 12,9% животных. Часть поголовья (4,2%) была не инвазирована, а 9,7% поражена одновременно и простейшими, и гельминтами.

Ввиду высокой инвазированности свиней простейшими, был проведен анализ их родового состава, который выявил 7 родов. Одноклеточные были представлены саркодовыми: Blastocystis spp., Entamoeba spp., Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, жгутиковыми: Lamblia intestinalis, инфузориями: Balantidium coli и кокцидиями: Cryptosporidium parvum (табл. 1).


Таблица 1 - Встречаемость кишечных паразитов у обследованных свиней (n=163)

Выделенные паразиты	Встречаемость паразитов
	абс.	%
Простейшие	151	92,6
1. Саркодовые	144	88,3
1.1. Blastocystis spp.	135	82,8
1.2. Entamoeba spp.	89	54,6
1.3. Endolimax nana	46	28,2
1.4. Iodamoeba spp.	23	14,1
2. Жгутиковые	8	4,9
2.1. Lamblia intestinalis	8	4,9
3. Инфузории	5	3,1
3.1. Balantidium coli	5	3,1
4. Кокцидии	3	1,8
4.1. Cryptosporidium parvum	3	1,8

Таким образом, в ходе проведенных исследований была выявлена высокая распространенность у обследованного поголовья свиней простейших бластоцист, они были обнаружены у 82,8% обследованных животных, что превышало показатели инвазированности всех остальных групп паразитов.

В ходе проведенных исследований были выявлены три формы бластоцист: вакуолярная, гранулярная и амебоидная, выявленные в ходе исследований. Вакуолярные формы Blastocystis spp. обнаруживались в 58,6% препаратов из фекалий, на гранулярную приходилось 28,7%, обе формы бластоцист среди обследованных были выявлены у 12,7% животных. Амебоидная форма в биоматериале не обнаружена.

Следует отметить, что амебоидные формы простейших были обнаружены только в препаратах, приготовленных из культуры простейших, выращенной на искусственных питательных средах (3,9%). Одновременно все три формы бластоцист встречались в культуре в 2,3% случаях.

Таким образом, преобладающими формами Blastocystis spp., как в препаратах из фекалий (58,6%), так и из культуры (42,1%) являлись вакуолярные.

Собственные исследования показали, что размеры простейших варьировали в широких пределах. В фекалиях преобладали бластоцисты размером от 8 до 21 мкм (67,6%), клетки размером менее 8 мкм встречались в 15,3% наблюдений и более 21 мкм – у 17,1% инвазированных.

В препаратах, приготовленных из культуры, размеры бластоцист, как вакуолярной, так и гранулярной форм, также варьировали (табл. 2).

Таблица 2 – Размеры бластоцист

Формы бластоцист	Размеры бластоцист (мкм)
	Менее 8	От 8 до 21	Более 21
Вакуолярная: из фекалий	15,3%	67,6%	17,1%
из культуры	4,6%	77,5%	17,9%
Гранулярная: из фекалий	14,2%	63,8%	22,0%
из культуры	9,7%	59,2%	31,1%

Полученные результаты свидетельствуют о том, что среди выделенных простейших Blastocystis spp., как в препаратах из фекалий, так и в культуре, превалировали клетки размером от 8 до 21 мкм. Вакуолярная форма бластоцист характеризовалась округлой формой, наличием центрального тела (ЦТ), занимающего большую часть клетки. Полученные результаты показали, что простейшие с центральным телом, занимающим более 90% объема клетки, составили 29,3%. Установлено, что на долю бластоцист, где ЦТ занимало 70-90% всей клетки, приходилось 54,7% от общего количества бластоцист вакуолярной формы, обнаруженных в фекалиях. При окрашивании бластоцист железным гематоксилином центральное тело прокрашивалось с разной интенсивностью, от слегка голубого до интенсивно синего цвета. Раствор Люголя придавал простейшим желто-коричневый оттенок. Редко встречались клетки с неокрашенным центральным телом. Эта структура на препаратах, приготовленных из свежих фекалий, выглядела гомогенной (78,6%), реже зернистой (24,3%). По периферии бластоцист тонким слоем обнаруживалась цитоплазма, в которой различались ядра (от 1 до 10) в виде плотных скоплений. Расположение ядер преимущественно полярное. В одной клетке встречались ядра разных размеров. При окраске железным гематоксилином ядра принимали темно-синий цвет.

Таким образом, при изучении выделенных бластоцист были обнаружены две формы простейших: вакуолярная и гранулярная. Преобладающими формами Blastocystis spp., как в препаратах из фекалий (51,85%), так и из культуры (45,4%) являлись вакуолярные. Бластоцисты амебоидной формы были обнаружены нами только в культуре (3,9%) при пересеве на питательных средах. При хранении культуры, количество амебоидных форм увеличивалось.

Размеры простейших варьировали в широких пределах. Простейшие размером менее 8 мкм встречались в 15,3% случаев, размером от 8 до 21 мкм – в 67,6% случаев и более 21 мкм – в 17,1% случаев. Бластоцисты, в которых центральное тело занимало, более 90% всей клетки составили 29,3%, от 70-90% клетки – 54,7% и менее 70% – 16% от общего количества вакуолярных форм.

Основными проявлениями кишечного бластоцистоза у экспериментальных животных являлись вялость, потеря аппетита, жажда, изменение состояния шерсти, ахолия фекалий, развитие диареи с примесью крови и слизи. Признаки бластоцистной инвазии отмечались уже через 24 часа после заражения животных бластоцистами. Максимальное их развитие наблюдалось на 12 сутки от начала эксперимента. В последующем отмечалось улучшение состояния подопытных животных, наступало их выздоровление.


ВЛИЯНИЕ БЛАСТОЦИСТНОЙ ИНВАЗИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ


Динамика количественного содержания нейтрофильных гранулоцитов.

В связи с тем, что нейтрофилы играют ведущую роль в механизмах реализации неспецифической резистентности организма, нами была изучена динамика изменений их количественного содержания у животных контрольной и опытной групп.

Результаты абсолютного количества нейтрофильных лейкоцитов периферической крови представлены на рисунке 1.



Рис. 1. Динамика абсолютного количества нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови мышей при бластоцистной инвазии (∙10⁹/л).


При экспериментальном бластоцистозе у инвазированных животных происходило выраженное повышение содержания нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови до двенадцатых суток, когда показатели увеличились до 7,75±0,29∙10⁹/л. В последующие сроки наблюдений количественное содержание нейтрофильных гранулоцитов периферической крови животных опытной группы снижалось и к двадцать восьмому дню эксперимента статистически достоверно не отличалось от значения показателя в контрольной группе (3,01±0,16∙10⁹/л и 3,08±0,11∙10⁹/л соответственно, p>0,05).

Показано также, что при экспериментальном бластоцистозе у инвазированных животных происходило выраженное повышение содержания нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови до двенадцатых суток, когда показатели увеличились до 7,75±0,29∙10⁹/л (табл. 3). В последующие сроки наблюдений количественное содержание нейтрофильных гранулоцитов периферической крови животных опытной группы снижалось и к двадцать восьмому дню эксперимента статистически достоверно не отличалось от значения показателя в контрольной группе (3,01±0,16∙10⁹/л и 3,08±0,11∙10⁹/л соответственно, p>0,05).


Таблица 3 – Динамика относительного количества нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у мышей при бластоцистной инвазии (%)

Группы животных	Стат. показатели	Сроки наблюдений (в сутках)
		3	6	9	12	16	21	28
Опыт (n=92)	M±m	45,8 ±0,6	42,8 ±0,4	50,1 ±0,3	62,9 ±0,4	32,7 ±0,3	29,3 ±0,4	35,6 ±0,4
Контроль (n=40)	M±m	37,6 ±0,7	38,1 ±0,8	38,1 ±0,9	38,1 ±0,8	37,9 ±0,9	38,6 ±0,8	38,1 ±0,8
	р	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001	<0,001

Таким образом, установлено, динамика показателей относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов в целом повторяет динамику абсолютного количества нейтрофилов у опытных животных.

Изучение фагоцитарной активности при бластоцистной инвазии.

Поглотительную способность нейтрофилов оценивали по фагоцитарному индексу, т.е. проценту фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, и фагоцитарному числу, т.е. среднему количеству микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом.

Резервную возможность показателей фагоцитарной реакции определяли по отношению показателей фагоцитарной активности при стимуляции липополисахаридом – продигиазаном к аналогичным в базальных условиях. Все показатели определяли в динамики на 3, 6, 9, 12, 16, 21, 28 сутки после заражения животных бластоцистами.

Результаты определения фагоцитарного индекса.

На 3 сутки от начала эксперимента у животных опытной группы наблюдалось достоверное увеличение показателей фагоцитоза (57,5±0,3%) по сравнению с контролем (49,5±0,2%), данное различие было статистически достоверным (p<0,05). На 6 сутки от начала заражения показатель фагоцитарного индекса возрос до 65,1±0,4%, в то время как уровень данного показателя животных контрольной группы практически не изменился и составил 50,1±0,2% (p<0,001). На 9 сутки повышение базального фагоцитоза достигло наибольших значений 69,7±0,8% (p<0,05).

Показатель достоверно динамически увеличивался в опытной группе с 3 по 9 сутки (с момента заражения), а к шестнадцатым суткам произошло резкое снижение фагоцитарного индекса до минимальных значений, причем показатель составил 44,5±0,6%, что было в 1,1 раза ниже, чем у интактных животных (49,5±0,4%, p<0,001). В дальнейшем показатели базального фагоцитоза нарастали вплоть до 28 суток от начала эксперимента, когда данный показатель у мышей опытной группы составил 49,9±0,8% (p>0,05) при отсутствии достоверности статистического различия между группами (рис. 2).




Рис. 2. Динамика показателей базального фагоцитоза у мышей при бластоцистной инвазии.


Результаты исследований показателей стимулированного фагоцитоза у инвазированных и интактных животных представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы, уровень стимулированного фагоцитоза у здоровых животных составил, в среднем – 49,8±0,9%. У инвазированных животных на 3 сутки после заражения показатели стимулированного фагоцитоза уменьшились в 2,1 раза и составили 23,8±0,4% (р<0,001). На 6 сутки различия оставались статистически достоверными, однако показатель фагоцитарного индекса несколько повысился, составив 26,9±2,7%, что было в 1,8 раза ниже показателя здоровых животных (рис. 3).




Рис. 3. Изменение показателей стимулированного фагоцитоза нейтрофилов мышей при бластоцистной инвазии.


В дальнейшем показатели фагоцитоза нарастали до двенадцатых суток от начала эксперимента, когда уровень стимулированного фагоцитоза в опытной группе составил 32,1±1,7% при сохранении статистически достоверного различия между группами. К 16-22 суткам показатели стимулированного фагоцитоза у инвазированных мышей снизились до минимальных значений, ее показатель снизился до 17,8±1,2%, что было в 2,8 раза ниже, чем у контрольных животных.

Таким образом, наличие бластоцистной инвазии способствовало снижению уровня стимулированного фагоцитоза. Следует отметить, что даже в период максимальной его активизации показатели стимулированного фагоцитоза не достигали соответствующих величин у здоровых животных.

Показатели базального фагоцитоза свидетельствуют о том, что происходит его активизация, максимум которого приходится на 9 сутки эксперимента, к 16 суткам наступает депрессия, сменяющаяся медленным подъемом показателей.

Уровень стимулированного фагоцитоза свидетельствует о статистически достоверном его снижении у инвазированных животных. Однако на фоне общего падения происходит его некоторая активация, также достигающая максимума на 9-12 сутки, которая затем сменяется снижением показателей.

Характеристика способности фагоцитов к поглощению возбудителя.

Фагоцитарное число интактных животных составило, в среднем – 1,7±0,2 условных единиц. У опытных мышей фагоцитарное число изменялось волнообразно (рис. 4).




Рис. 4. Изменение показателей фагоцитарного числа у мышей при бластоцистной инвазии.


Как видно из рисунка, фагоцитарное число интактных животных составило, в среднем – 1,7±0,2 условных единиц. У опытных мышей число изменялось волнообразно.

Нарастание фагоцитарного числа к двенадцатым суткам у животных экспериментальной группы можно объяснить мобилизацией компенсаторных механизмов. Это, по-видимому, может быть связано с увеличением в этот же срок относительного (62,9±0,4%) и абсолютного (7,75±0,29∙10⁹/л) количества нейтрофильных гранулоцитов периферической крови. Механизм нейтропении, возможно, обусловлен усиленной миграцией нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови в очаг воспаления, развивающегося в кишечнике при бластоцистозе.

Рзультаты определения завершенности фагоцитоза.

Бластоцистная инвазия сопровождалась изменением в динамике эксперимента показателя завершенности фагоцитоза. Так, в первые сутки после заражения происходило его увеличение до 72,7±3,4% (в контроле 62,5±3,3%; р<0,001), в период разгара, на 6-12-е сутки, показатель завершенности снижался до 63,8±4,2% (р>0,01), в период реконвалесценции опять наступало его повышение (67,2±6,8%), которое, однако, не было достоверным по сравнению с контролем (р>0,05).

Таким образом, экспериментальная бластоцистная инвазия у мышей сопровождалось изменением содержания нейтрофилов в периферической крови и их фагоцитарной активности. Установлены фазные изменения уровней базального и стимулированного фагоцитоза, а также показателей завершенности фагоцитоза.


характеристика кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов биоцидности нейтрофильных гранулоцитов в динамике бластоцистной инвазии


Оценка кислородзависимой биоцидности нейтрофильных гранулоцитов при бластоцистной инвазии.

Результаты определения активности «респираторного взрыва» НСТ-тестом показали фазное изменение показателей у экспериментальных животных при бластоцистной инвазии, что свидетельствует об активации кислородзависимой биоцидности нейтрофилов в первые сутки после заражения животных, сменяющейся ее депрессией в период разгара бластоцистоза. Затем наступало незначительное увеличение показателей НСТ-теста и опять их понижение в период выздоровления.

Результаты активности миелопероксидазы (МПО), представленные на рисунке 5, свидетельствуют, что у контрольных животных средний цитохимический коэффициент (СЦК) активности миелопероксидазы составил 2,18±0,02 условных единиц, через трое суток от начала эксперимента значения СЦК у мышей опытной группы повысилось незначительно (2,28±0,04 у.е.; p<0,05).

Максимальное значение показателя СЦК в группе опытных мышей было отмечено на девятые сутки. В это время активность МПО у опытных животных увеличилась на 33%, что составило 2,90±0,07 у.е. от исходного уровня, и было статистически высоко достоверным (p<0,001).

Через двенадцать дней данный показатель снижался, но оставался выше контроля на 26,6% (2,76±,06 у.e.; p<0,001). В последующие сроки наблюдений отмечалось дальнейшее достоверное снижение данного показателя.



Рис.5. Изменение активности миелопероксидазы у мышей при бластоцистной инвазии.


Таким образом, было показано, что при экспериментальном бластоцистозе у лабораторных животных обнаружено достоверное увеличение среднего цитохимического коэффициента миелопероксидазы, достигающих максимальные значения к 9-12 суткам от начала эксперимента. В дальнейшем показатель возвращался к значениям, незначительно превосходящим исходный уровень.

Характеристика кислороднезависимой биоцидной системы нейтрофилов.

Показатели катионных белков, кислой и щелочной фосфатаз были изучены в динамике на 3, 6, 9,12, 16, 21 и 28-е сутки от начала заражения животных простейшими Blastocystis spp. Результаты выражали через средний цитохимический коэффициент.

Установлено, что бластоцистная инвазия приводит к значительному повышению уровня щелочной и кислой фосфатаз. Результаты изучения активности ЩФ и КФ представлены на рисунке 6 и 7.

Как видно из рисунка 6, уже на третий день исследований уровень ЩФ животных, инфицированных бластоцистами, был выше контрольного почти в 1,2 раза (2,11±0,05 и 1,77±0,02 соответственно, p<0,001). Дальнейшее динамическое повышение показателя мы отмечали до 12 суток, при этом уровень ЩФ в контрольной группе составил 2,66±0,05 (p<0,001). В дальнейшем уровень ЩФ снижался и к 28 дню от начала эксперимента уровень щелочной фосфатазы оставался незначительно повышенным (1,94±0,04 и 1,8±0,03 соответственно, p<0,01).



Рис. 6. Изменение активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах мышей при бластоцистной инвазии.


Аналогичным образом изменялась активность кислой фосфатазы (рис.7). Как видно из рисунка, динамика активности кислой фосфатазы была аналогична изменениям показателей щелочной фосфатазы: уже на 3 сутки после заражения статистически достоверно превосходил таковой в контрольной группе (0,91±0,04 и 0,82±0,02 соответственно; p<0,05).




Рис.7. Изменение активности кислой фосфатазы в нейтрофилах мышей при бластоцистной инвазии.


В последующем уровень кислой фосфатазы достоверно динамически возрастал и на 12 сутки эксперимента составлял 1,73±0,05 (p<0,01). В дальнейшем содержание кислой фосфатазы в крови имело тенденцию к снижению и к концу эксперимента значение показателей статистически не отличалось от уровня данного фермента в контрольной группе (p>0,05).

Наряду с увеличением показателей активности миелопероксидазы, щелочной и кислой фосфатаз при экспериментальном бластоцистозе было установлено снижение уровня катионного белка у животных опытной группы (рис. 8).

Как видно из представленной диаграммы, через трое суток от начала эксперимента у животных экспериментальной группы уровень катионных белков снижался и составил 1,98±0,04 условных единиц, что было в 1,1 раза ниже, чем у животных контрольной группы (2,22±0,03; p<0,05).



Рис.8. Изменение показателей катионных белков в нейтрофилах мышей в динамике бластоцистной инвазии.


Минимальное значение показателя в группе опытных мышей было отмечено к девятым суткам от начала эксперимента. В это время уровень катионных у опытных животных составил 1,23±0,07 условных единиц, при этом различие в показателях по сравнению с контрольной группой было статистически достоверным (p<0,05).

В дальнейшем отмечалась тенденция к увеличению уровня КБ у инвазированных животных. Так, на двенадцатые сутки СЦК катионных белков у опытных мышей превышал показатель контроля в 1,6 раза (1,40±0,09), к шестнадцатым суткам – в 1,3 раза (1,65±0,07), к двадцать первым суткам – в 1,3 раза (1,70±0,1). Все указанные показатели высоко статистически достоверно отличались от уровня контрольных групп (p<0,05). К концу эксперимента значения СЦК катионных белков составили 1,96±0,05 (p<0,05).

Таким образом, изучение ферментативной активности нейтрофильных лейкоцитов в динамике экспериментального бластоцистоза выявило изменение активности миелопероксидазы, щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы и уровня катионных белков. Так максимальное угнетение КБ, на фоне повышения значений активности МПО, ЩФ, КФ, нами отмечено на двенадцатые сутки эксперимента. В дальнейшем наблюдались разнонаправленные сдвиги показателей МПО, ЩФ, КФ и КБ в сторону их нормализации, т.е. повышался уровень катионных белков при динамическом снижении миелопероксидазной и фосфатазной активности лейкоцитов, направленных на отграничение и удаление из организма чужеродного антигенного материала. Повышение активности этих ферментов также коррелировало со степенью выраженности проявлений экспериментального бластоцистоза.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что 82,8% поголовья свиней с кишечными протозоозами заражено простейшими Blastocystis spp., что значимо превышает показатели инвазированности всеми остальными группами паразитов.
   
2. Получена модель экспериментального бластоцитоза мышей, характеризующаяся морфологическими и функциональными изменениями толстой кишки, характерных для неспецифического воспаления, а также увеличения абсолютного и относительного количества нейтрофильных гранулоцитов на высоте патологического процесса.
   
3. Показано, что период повышения показателей базального и стимулированного фагоцитоза, достигавший максимума на 9-12 сутки, сменялся их депрессией (16 сутки) и повторным подъемом. Показатели стимулированного фагоцитоза даже в период максимальной его активизации не достигали соответствующих величин у здоровых животных.
   
4. Установлено значимое повышение на начальных стадиях патологического процесса числа активированных нейтрофилов в НСТ-тесте и уровень активности МПО по сравнению с контролем, а также повышение уровня активности щелочной и кислой фосфатаз при одновременном выраженном снижении количества катионных белков.
   

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. *Захаров А.А., Карпеева Е.А. Характеристика ферментативной активности нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном бластоцитозе. / А.А. Захаров, Е.А. Карпеева // Вестник Чувашского государственного педагогического университета им. И.Я. Яковлева – 2010. - №4(68). - С. 75-78.
   
2. *Захаров А.А., Ильина Н.А. Морфологические формы бластоцист свиней. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Естественные и технические науки – 2010. - №5(49). - С. 88-90.
   
3. *Захаров А.А. Оценка кислородзависимой биоцидности нейтрофильных гранулоцитов при бластоцистной инвазии. / А.А. Захаров // Естественные и технические науки – 2011. - №1(51). - С. 70-72.
   

публикации в других изданиях

4. Захаров А.А., Ильина Н.А. Морфологическая картина толстой кишки при бластоцистной инвазии. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Сборник научных работ с материалами трудов участников 3-ей Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» – 2010. - Т. 1. - №4. - С. 90.
   
5. Захаров А.А., Ильина Н.А. Изменение количества лейкоцитов периферической крови при бластоцитозе. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Академический журнал Западной Сибири – 2010. - №3. - С. 17.
   
6. Захаров А.А., Ильина Н.А. Оценка фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов при бластоцитозе. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Молодой ученый – 2010. - Т. 1. - №8(19). - С. 182-185.
   
7. Захаров А.А., Ильина Н.А. Изменение микрофлоры толстой кишки при бластоцистной инвазии. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Молодой ученый – 2010. - Т. 2. - №8(19). - С. 193-196.
   
8. Захаров А.А., Ильина Н.А. Клинические проявления бластоцистной инвазии. / А.А. Захаров, Н.А. Ильина // Современные наукоемкие технологии – 2010. - №9. - С. 88-90.
   
9. Захаров А.А. Характеристика фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов при бластоцистной инвазии. / А.А. Захаров // Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы – 2010. - №1. - С. 12-17.
   
10. Захаров А.А. Динамика количественного содержания нейтрофильных гранулоцитов при экспериментальном бластоцитозе. / А.А. Захаров // Наука и современность – 2010. – Ч.1. - С. 13-15.