Пособие для врачей и врачей-лаборантов Москва
| Вид материала | Документы |
| Определение свободного биологически активного кортизола. Характеристика метода определения свободного кортизола в слюне. |
- Пособие для врачей -москва 2005- министерство здравоохранения и социального, 482.51kb.
- Пособие предназначено для врачей психиатров-наркологов, психиатров, а также врачей, 2459.51kb.
- Агрессия. Формы проявления и коррекции, 32.04kb.
- Методические рекомендации мр 0003-10, 364.62kb.
- Пособие для врачей удк 616. 14-08, 543.32kb.
- Е. А. Фокина пути освоения техники гинекологических операций учебное пособие, 185.1kb.
- Учебно-методическое пособие минск Белмапо 2006, 314.28kb.
- Пособие для врачей Минск, 2006 удк 616. 8-053. 2(476), 404.21kb.
- Пособие для врачей Пенза 2003 министерство здравоохранения российской федерации, 548.25kb.
- Методическое пособие для врачей. М., 2004., 93.79kb.
Определение свободного биологически активного кортизола.
Определение свободного кортизола в крови возможно только трудоемким методом равновесного диализа, который нельзя использовать в диагностической практике.
Альтернативной биологической жидкостью является слюна.
Более 50 лет тому назад было показано, что клеточная мембрана (барьер) слюнных желез, не пропускает в слюнные протоки биологические молекулы с МВ > 400Да. Молекулярный вес всех стероидов < 400 Да и в результате только свободные формы стероидов проникают в слюнной проток.(кортизол, тестостерон, эстрадиол и др.), а гормоны, связанные с альбумином или глобулинами, транспортными белками стероидов, не проникают. Концентрация свободных биологически активных молекул стероидных гормонов в слюне очень низкая и не превышает 3-5% от общей концентрации стероидов, циркулирующих в крови.
В настоящее время в ЭНЦ разработан ультрачувствительный метод определения свободного кортизола в слюне, основанный на технологии иммуноанализа с использованием принципа усиленной люминисценции. Этот неинвазивный метод рутинно используется в странах Европы и США в комбинации с измерением общего кортизола в крови и свободной формы гормона в моче. Определение свободного кортизола в слюне является наиболее оптимальным, позволяя у каждого пациента собрать материал в любых заданных временных интервалах, не подвергая пациента стрессу.
Как и содержание общего кортизола в крови, концентрация свободного кортизола в слюне подчиняется суточному ритму. В дневные часы этот показатель снижается на 54%, а в вечерние часы на 89% (рис. 1 ).
Необходимо помнить, что градиент концентрации кортизола в крови и слюне составляет более 10 раз, и поэтому контаминация слюны кровью (микротрещины или язвочки десен и ротовой полости) может искажать результаты определения свободного кортизола в слюне. Такие пробы должны быть исключены из анализа.
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО КОРТИЗОЛА В СЛЮНЕ.
| Принцип метода | Конкурентный иммунохемилюминесцентный анализ | | |
| Формат | Плашка 12 стрипов по 8 лунок каждый | | |
| Образцы | 20 мкл слюны или сыворотка, разведенная не менее чем 1:50 | | |
| Стандарты | 7 стандартов, готовых к использованию: 0. 0.3. 0.6. 2.0. 6.0. 15.0 и 40 нг/мл | | |
| Инкубации | 3 часа при температуре 18 - 22 °С. на шейкере; | | |
| Субстрат | Люминол | | |
| Ожидаемые значения | Время после пробуждения | | |
| 0 -1.5 часа 1.5 – 3 часа 3-6 часов 6-9 часов 9-12 часов | 1.84 – 14.5 нг/мл 1.30 – 10. 2 нг/мл 0.76 -5.68 нг/мл 0.65 – 4.68 нг/мл 0.33-3.33 нг/мл | | |
| Чувствительность | 0.15 нг/мл | ||
| Точность | Внутри одной серии: 2.9 —7.7 % | В диапазоне 0.96— 8.7 нг/мл | |
| Между сериями: 6.2 — 11.5 % | В диапазоне 0.75 — 6.82 нг/мл | ||
| Специфичность | Перекрестная реактивность (по методу Абрахама) | ||
| Кортикостерон Кортизон Преднизон | 2.5% 2.0% 1.0% | ||
При измерении свободных форм стероидов в слюне необходимо было ответить на вопрос - зависит ли их концентрация от скорости выделения слюны в протоки. Для этого были проведены специальные исследования со стимуляцией слюноотделения и сбором образцов слюны по 50 мкл каждые 30 сек. Последующие измерения концентрации кортизола показали отсутствие разницы в его содержании до и после активации слюноотделения. И тем самым, была доказана независимость его уровня в общей слюне от скорости ее выделения, что имеет принципиальное значение при интерпретации результатов.
По уровню кортизола в слюне с частым ее забором можно проследить за физиологическими колебаниями активности гипоталамо-гипофизарной-адреналовой системы на протяжении дня, месяца, года и т. д., тогда как по уровню кортизола в крови это сделать намного сложнее. На рис 1 приведена иллюстрация суточной динамики свободного кортизола в слюне у молодых мужчин и женщин в возрасте до 40 лет.
часы
Нмоль/л
Рис. 1 Динамика св. кортизола в слюне у здоровых мужчин и женщин на протяжении дня. Примечание: • - индивидуальные показатели; Медиана - сплошная линия; 10,90 процентили - пунктирные линии
Исследование слюнной жидкости для определения кортизола существенно снижает затраты, т.к. в большинстве случаев не требует госпитализации больного. Однократный визит к врачу с получением четкой письменной инструкции о правилах и временном интервале сбора слюны дома, позволяет избежать стрессорных ситуаций, связанных с посещением госпиталя, взятием крови из вены и т. д., кроме этого снижаются транспортные расходы, а так же расходы на преаналитическом этапе, которые зачастую превышают стоимость самого гормонального теста. Стоимость теста кортизола в слюне не превышает его определения в крови.
Определение свободного кортизола в слюне является методом выбора при первичном обследовании пациентов с подозрением на БИК. Наиболее информативны вечерние показатели содержания св. кортизола в слюне, которые более чем ы 3 раза превышают показатели здоровых людей. ( Рис. 2). В мировой практике определение св. кортизола в слюне в утреннее и вечернее время рассматривается как “золотой” стандарт в оценке глюкокортикоидной функции надпочечников.
Контроль
БИК
Нмоль\л
Р=0.000*
Р=0.000*
08:30-09:30 ч.
22:.00 -23:00 ч. ч.ч. ч.
Р
2
ис. 2 Средние показатели ( Ме,10-,90-ый процентиль) уровня свободного кортизола в слюне в утренние и вечерние часы у пациентов с БИК до лечения и у здоровых людей.
Определение кортизола в слюне радикально облегчает проведение функциональных тестов с АКТГ, дексаметазоном, инсулином и исключает влияние стресса на гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему, обусловленного многократным забором крови. И, самое главное, содержание кортизола в слюне отражает концентрацию свободной, физиологически активной фракции гормона, циркулирующего в крови, тогда как его определение в сыворотке крови отражает уровень общего кортизола, т. е. связанного с транскортином и альбумином. Изменение его концентрации не всегда является следствием изменения функции системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Во многих случаях изменение концентрации общего кортизола в крови обусловлено нарушением связывающей способности транскортина, на продукцию которого в печени оказывает влияние ряд фармакологических препаратов, включая аспирин, а также изменение гормонального гомеостаза. Кортизолсвязывающий глобулин (транскортин) и альбумин исследуемой плазмы могут конкурировать с антисывороткой к кортизолу в иммунологической реакции и, тем самым, создавать “неспецифический эффект” с искажением полученных результатов. Эти проблемы требуют затратных технологических решений, чтобы уменьшить обозначенные помехи. Слюнная жидкость не содержит в значимых количеств белка и тем самым является оптимальным биологическим материалом, позволяющим избежать указанную проблему. Кроме этого, определение кортизола в слюне, равно как и других стероидов, позволяет избежать проблему матрикса в иммуноанализе и готовить калибрующую кривую стандарта не в безстероидной плазме (при их определении в плазме), а в буферном растворе. Это принципиально уменьшает стоимость технологии и повышает точность и надежность работы метода. Кроме того, в случае гемолиза крови регистрируются искажения результатов, что создает дополнительные диагностические трудности, особенно проблемные для современных прямых автоматизированных систем определения стероидных гормонов.
Мониторинг терапии надпочечниковой недостаточности производными гидрокортизона.
Наибольший интерес представляет возможность использования свободного кортизола в слюне для мониторинга терапии глюкокортикоидными препаратами, поскольку неинвазивоность получения образцов слюны дает возможность проводить частый сбор образцов в различных временных режимах и тем самым проследить индивидуальную факрмакокинетику вводимого препарата. Уровень свободного кортизола в слюне является чувствительным маркером подавления секреции эндогенного кортизола при терапии метипредом и может быть использован для индивидуального мониторинга терапии синтетическими глюкокортикоидами (СГК).
Необходимо отметить, что во всех случаях, при оценке адекватности заместительной терапии могут возникать определенные трудности в интерпретации результатов, особенно по уровню общего кортизола в крови и в меньшей степени уровню свободного кортизола в слюне и в моче. Эти трудности связаны с рядом факторов:
- наличие перекрестных реакций в процессе иммуноанализа кортизола с близкими по структуре СГК. При этом в зависимости от химического строения препарата и его фармакокинетики изменяется интенсивность и динамика его интерферирующего эффекта.
- обоснованность выбора времени забора образцов крови и слюны после приема препарата. Для этого необходимо учитывать способ введения препарата, время его полураспада, степень связывания с транскортином и альбумином плазмы, состоянием ЖКТ, печени, почек. Перечисленные факторы определяют продолжительность и оптимальный временной режим терапии глюкокортикоидными препаратами. Все это обуславливает необходимость индивидуального мониторинга за динамикой свободного кортизола в период отработки доз вводимого препарата и последующего мониторинга адекватности используемого режима лечения.