Первая отечественная кандидатная анти-вич/спид-вакцина: иммунологический мониторинг и испытания «14. 00. 36 аллергология и иммунология»

Вид материала

Диссертация

Содержание ВИЧРЕПОЛ 50 мкг по белку Клинико-лабораторное обследование добровольцев Получение сывороток. Определение антител против антигенов ВИЧ-1 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью иммуноблота. Выявление вирусного белка р24 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью ИФА. ОПкрит = ОПср К (–) + 0,07 Выделение лимфоцитов. Криохранение лимфоцитов. Постановка реакции лимфопролиферации.

Подобный материал:

• Краевая целевая программа "анти-вич/спид" на 2007 2008 годы паспорт, 478.38kb.
• Алтайская краевая общественная организация «Анти спид-сибирь» учебный модуль, 526.43kb.
• Об утверждении районной программы «Предупреждение распространения заболевания, вызываемого, 393.03kb.
• Семинар тема: Проблемы, связанные с вич/спид, профилактика вич-инфекции, 180.77kb.
• Психологические аспекты вич/спид, 58.7kb.
• Целевая программа анти-вич/спид на 2011 год Паспорт Программы, 83.39kb.
• Цель: ознакомить с проблемой вич/спид, дать знания о путях, 682.12kb.
• Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки специалистов Специальность:, 1035.98kb.
• План мероприятий Пинского колледжа уо «Бр. Гу им. А. С. Пушкина» по профилактике спид, 36.68kb.
• Реферат на тему: вич – спид! Спид, 39.96kb.

Табл.2. Схема иммунизации добровольцев вакциной «ВИЧРЕПОЛ».

Группа	Число добро-вольцев	Месяцы
		0	1	3	6
1	3	ВИЧРЕПОЛ 2,5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 2,5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 2,5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 2,5 мкг по белку
2	3	ВИЧРЕПОЛ 5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 5 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 5 мкг по белку
3	3	ВИЧРЕПОЛ 10 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 10 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 10 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 10 мкг по белку
4	3	ВИЧРЕПОЛ 25 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 25 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 25 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 25 мкг по белку
5	3	ВИЧРЕПОЛ 50 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 50 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 50 мкг по белку	ВИЧРЕПОЛ 50 мкг по белку

Оценка безопасности и переносимости

Оценка безопасности и переносимости вакцины «ВИЧРЕПОЛ» проводилась на основании регистрации побочных реакций, неблагоприятных явлений и отклонений от нормы результатов клинико-лабораторных анализов. Регистрировали наличие или отсутствие у добровольцев после введения вакцины субъективных жалоб и объективных проявлений (зуд, отек в месте введения вакцины, жар, повышение температуры тела, отек Квинке, анафилаксия и т.д.). Возможную связь побочных реакций и неблагоприятных явлений с применением вакцины «ВИЧРЕПОЛ» оценивали по следующим критериям:

• клинические проявления
  
• клинико-лабораторные показатели
  
• иммунологические показатели.
  

Оценка иммуногенности

Гуморальный иммунный ответ:

• Антитела, связывающиеся с белками rec(24-41), rec24 и rec41 в ИФА;
  
• Антитела, связывающиеся с твердой фазой (планшетом с сорбированными антигенами ВИЧ) лицензированного в России теста для определения антител к ВИЧ в ИФА;
  
• Антитела, связывающиеся с белками культурального ВИЧ-1 – gp41, p24 и p55 (предшественником р24) в иммуноблоте.
  
• Нейтрализующие антитела против ВИЧ-1, культивируемого в трансформированной клеточной линии.
  

Клеточный иммунный ответ:

• Лимфопролиферативный ответ на белки rec(24-41), rec24 и rec41;
  
• Определение абсолютного количества CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов и соотношения CD4⁺/CD8⁺;
  
• Определение антиген-специфической продукции интерферона-γ Т-клетками.
  

Формирование когорты добровольцев

Когорта добровольцев для участия в клинических испытаний вакцины «ВИЧРЕПОЛ» формировалась в соответствии со стандартами GCP и соблюдением принципов биоэтики, на основе добровольности, информированности, конфиденциальности, анонимности. К участию в клинических испытаниях привлекались здоровые ВИЧ-неинфицированные добровольцы (мужчины и женщины) в возрасте 20-50 лет, которые могли участвовать в исследовании в течение 13 месяцев (12 визитов в центр клинических испытаний). Для добровольцев были обеспечены: страхование, бесплатное медицинское сопровождение, дифференциальная диагностика ложной ВИЧ-сероположительности с выдачей индивидуального документа с подтверждением участия в клинических испытаниях анти-ВИЧ/СПИД-вакцины и отсутствия ВИЧ-инфекции, консультирование о предотвращении ВИЧ-инфекции, вознаграждение. Добровольцы включались в клиническое исследование в соответствии с критериями включения/исключения (табл.1) после подписания формы информированного согласия.

Формирование когорты добровольцев являлось одной из задач клинического исследования и более подробно описано в разделе «Результаты и обсуждение».


Клинико-лабораторное обследование добровольцев

Клинико-лабораторное обследование добровольцев было проведено в лицензированной клинико-диагностической лаборатории. Клинические исследования крови и мочи были проведены на сертифицированных приборах «АВХ Micros-60», «Horiba АВХ Diagnostic» и «PocketChem UA PU-4210 Arkray» (Франция). Биохимические исследования проводили на сертифицированном биохимическом анализаторе «Cormay Livia» («Cormay», Венгрия). В качестве биохимических показателей безопасности были использованы уровни АсАТ, АлАТ, креатинина. Эти параметры являются общепринятыми в мировой практике оценки безопасности анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [Belshe et al, 1994]


Получение сывороток. Забор крови проводили в сроки, указанные в Протоколе испытаний. Кровь собирали в пробирки, выдерживали 1 час при 37°С, затем переносили в холодильник на 4°С на 30 мин, центрифугировали 10 мин (1000-1500 об/мин). Отбирали сыворотку в микропробирку и помещали в на хранение при -20°С до исследования.


Определение анти-ВИЧ-антител в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с использованием диагностической системы для определения антител к ВИЧ1/2 «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» (кат. I-150) (НПО «Диагностические тест-системы», Нижний Новгород). В основе определения антител лежит непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. В качестве твердофазного иммуносорбента в тест-системе используется смесь рекомбинантных белков: gp160, gp 120, gp41 (env ВИЧ-1); р17, р24 и р15 (gag ВИЧ-1), gp120 и gp41 (env ВИЧ-1 группы 0), р17 и р24 (gag ВИЧ-1 группы 0), gp40 и gp38 env ВИЧ2, сорбированных в лунках полистиролового планшета.

Реакцию ставили согласно инструкции предприятия-изготовителя.

Результат считали положительным, если его оптическая плотность (ОП) превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:

ОП крит. = ср. знач. ОП К (-) + 0,2,

где 0,2 – коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА на предприятии-изготовителе, величина которого указана в рабочей инструкции и паспорте на препарат; ОП К (-) – оптическая плотность негативного образца, входящего в состав набора.

В соответствии с международной практикой испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин [Gilbert et al., 2005], для сравнения данных, полученных на различных этапах исследования, результаты были нормализованы и выражены в виде отношения

ОП _иссл. / ОП _крит .


Определение антител к вакцинному антигену препарата «ВИЧРЕПОЛ» в сыворотках крови иммунизированных добровольцев. Определение проводили с помощью твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием сорбированных на твердой фазе рекомбинантных антигенов, входящих в состав активной субстанции вакцины «ВИЧРЕПОЛ». В качестве твердофазного иммуносорбента использовали антигены rec p24, rec gp41, rec (24-41), сорбированные на твердой фазе (в лунках полистиролового планшета). Антиген rec(24-41) представляет собой активную субстанцию вакцины «ВИЧРЕПОЛ». Антиген rec p24 копирует полноразмерный белок р24 ВИЧ1 и повторяет N-концевую часть вакцинного антигена rec(24-41). Антиген rec gp41 копирует N-концевой фрагмент gp41 ВИЧ1 и воспроизводит С-концевую часть вакцинного антигена rec(24-41). Антигены в концентрации 8 мкг/мл сорбировали по отдельности на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» (Германия) в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора антигена в лунку. Выдерживали 48 часов при комнатной температуре во влажной камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаги. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток на 0,01 М фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-АТ). Образцы вносили по 100 мкл в лунку в трех параллелях для каждого разведения, и выдерживали 60 мин при 37° С. По окончании инкубации, лунки пятикратно отмывали ФСБ-Т для удаления несвязавшихся антител, внося в каждую лунку не менее 350 мкл отмывающего раствора. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами мыши против IgG человека. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили по 100 мкл в лунку. Инкубировали 60 мин при 37° С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2 % раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере. Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15-минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм.

Результат считали положительным, если ОП в анализируемой лунке превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:

ОП крит. = ср. знач. ОП К(-) + 0,2,

где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА, ОП К(-) - оптическая плотность ВИЧ-негативного образца из коммерческого набора New LAV Blot I фирмы «Bio-Rad» (США) в разведении 1:10.


Определение антител против антигенов ВИЧ-1 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью иммуноблота. Исследование проводили с применением коммерческой тест-системы New LAV Blot I Assay (HIV-1 Ab confirmation, Western Blot) («Bio-Rad», США, кат. №72251) согласно инструкции предприятия-изготовителя, приложенной к набору. Антигенной основой тест-системы являются белки культурального вируса ВИЧ-1, сорбированные на нитроцеллюлозе.

Реакцию учитывали, сравнивая расположение полосок на стрипе с образцом, приложенным к тест-системе.


Выявление вирусного белка р24 в сыворотках крови иммунизированных добровольцев с помощью ИФА. Определение проводили с применением коммерческих тест-систем «ВектоВИЧ-1 р24-антиген-подтверждающий тест (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Принцип метода заключается во взаимодействии антигена р24 ВИЧ-1 из исследуемых образцов с моноклональными антителами, иммобилизованными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся антиген выявляют с помощью биотинилированных анти-ВИЧ-1 кроличьих антител и конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. Реакцию ставили согласно инструкции предприятия-изготовителя, приложенной к тест-системе.

Результат анализ считали положительным, если значение ОП в соответствующей лунке было равно или превышало критическое значение (ОПкрит), которое вычислялось по формуле:

ОПкрит = ОПср К (–) + 0,07,

где ОПср К (–) - среднее значение оптической плотности негативного образца


Определение генома ВИЧ. Определение генома ВИЧ в плазме крови добровольцев проводили с помощью обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени. Определение генома ВИЧ было проведено в лицензированной лаборатории с применением набора, соответствующего по характеристикам набору «Roche Amplicor».


Выделение лимфоцитов. Цельную кровь собирали в пробирки с К2 ЭДТА (VACUTEST® с К2 ЭДТА, BD). Разбавляли средой RPMI 1640 в соотношении 1:1 и наслаивали на фиколл-урографин. Центрифугировали 20 мин (2000 об/мин) при комнатной температуре. По окончании центрифугирования собирали лимфоциты и переносили в среду RPMI 1640 для удаления примеси фиколла-урографина и тромбоцитов. Центрифугировали 15 мин (1000 об/мин), удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в среде RPMI 1640. Повторяли отмывку. Осадок ресуспендировали в полной питательной среде (ППС) (10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 0,5 М HEPES, RPMI 1640).


Криохранение лимфоцитов. Лимфоциты в ППС центрифугировали 20 мин при 1000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в среде для замораживания (10% DMSO в FCS), переносили в криопробирки. Помещали криопробирки в контейнер для замораживания Mr.Frosty (C1562, «Sigma», США), контейнер помещали в морозильную камеру при - 80 ºС.


Постановка реакции лимфопролиферации. Для работы были использованы свежевыделенные клетки. Клетки подсчитывали в гемацитометре. В лунку 96-луночного плоскодонного планшета вносили лимфоциты (200000/лунку) и антигены или rec (24-41), или rec p24, или rec gp41 (рабочая концентрация 10 мкг/мл) в ППС. Положительным контролем реакции служила стимуляция лимфоцитов ФГА (рабочая концентрация 20 мкг/мл). Реакцию ставили в 3-х параллелях. Инкубировали планшеты в 5% атмосфере СО₂ при 37 ⁰С. Через 48 часов в лунки вносили ³Н-тимидин, оставляли еще на 24 часа, после чего переносили содержимое лунок на нитроцеллюлозные фильтры. Включение ³Н-тимидина определяли на β-счетчике в толуоловом сцинтилляторе. Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле:

ИП=CPM_{антиген}/CPM_{спонтанная пролиферация} ,

где CPM_{антиген} – сигнал клеток, стимулированных антигеном,

CPM_{спонтанная пролиферация} – сигнал клеток, инкубированных в ППС (спонтанная пролиферация).