Семян и зародышей редких видов растений

  1   2   3   4

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук

Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина РАН


Научный руководитель: кандидат с.-х. наук

Молканова Ольга Ивановна


Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карписонова Римма Анатольевна

доктор биологических наук

Калашникова Елена Анатольевна


Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН.


Защита диссертации состоится 20 мая 2010 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.028.01 в Главном ботаническом саду им. Н. В. Цицина Российской академии наук в конференц-зале лабораторного корпуса.

Адрес: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4, ГБС РАН

Факс: 8 (495) 977-91-72


С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБС РАН по адресу:

127276, г. Москва, ул. Ботаническая, д. 4


Автореферат разослан « 20 » апреля 2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Ю. К. Виноградова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время одной из наиболее острых экологических проблем является стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение многих видов растений. В связи с этим все большую актуальность приобретает необходимость разработки методов сохранения и поддержания биологического разнообразия как in situ, так и ex situ (Андреев, Горбунов, 1999). Эффективность сохранения растений ex situ может быть существенно повышена путем создания генетических банков in vitro. Использование системы in vitro по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений имеет целый ряд преимуществ, в том числе и возможность успешной репродукции видов, естественное возобновление которых в природе ослаблено или затруднено (Молканова и др., 2008; Новикова и др., 2008). При создании генетических банков редких и исчезающих растений в качестве исходного предпочтителен семенной материал, поскольку, таким образом, при использовании небольшого количества ценного материала и без нарушения естественных популяций сохранность генетического разнообразия вида обеспечивается на максимальном уровне. В экспериментальной работе с семенами многих редких видов возникает такая проблема, как покой семян и его преодоление. Культура in vitro позволяет значительно сократить срок выведения семян из покоя (Батыгина, Васильева, 2002; Ишмуратова, Ткаченко, 2009). Важнейшей задачей генетического банка, особенно актуальной для редких и исчезающих видов, является поддержание генетической чистоты сохраняемых in vitro таксонов, а также их всестороннее изучение. Использование современных молекулярно-генетических методов исследования генетической вариабельности не только позволяет контролировать стабильность хранящихся in vitro растений (Артюкова и др., 2004), но также дает возможность для быстрой и точной идентификации видовой подлинности вновь поступающих образцов и молекулярного маркирования растений на популяционном уровне, в том числе и редких видов сохраняемых в коллекциях in vitro (Журавлев и др., 1999, Боронникова, 2009).

Цель и задачи исследований – выявление специфики культивирования семян и зародышей представителей родов Iris L., Belamcanda Adans., Paeonia L. и Fritillaria L. в культуре in vitro и оптимизация методов сохранения исследуемых таксонов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать особенности покоя семян представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria и способов его преодоление в условиях in vitro;
   
2. оценить возможность использования эмбриокультуры как метода преодоления покоя вышеназванных таксонов;
   
3. изучить влияние условий стратификации, степени развития зародыша и состава питательной среды на начальные этапы онтогенеза растений in vitro;
   
4. разработать методику культивирования in vitro зародышей исследуемых таксонов;
   
5. изучить возможности применения ISSR-анализа для идентификации и паспортизации коллекций in vitro.
   

Научная новизна исследований. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro зародышей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria,определены оптимальные сроки их изоляции.

Впервые для некоторых представителей рода Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria экспериментально установлены границы наступления стадии относительной автономности зародыша. Отработаны методы культивирования семян и зародышей исследуемых таксонов, показано преимущество эмбриокультуры по сравнению с традиционными способами преодоления покоя семян.

Впервые показана возможность использования ISSR-анализа для идентификации видовой подлинности и паспортизации коллекций in vitro.

Практическая ценность работы. Подобраны оптимальные условия для культивирования in vitro семян и зародышей исследуемых таксонов.

Создан генетический банк in vitro представителей Iris, Belamcanda, Paeonia и Fritillaria, включающий в том числе 37 образцов редких и исчезающих видов.

Предложен подход ISSR-анализа для уточнения видовой подлинности образцов семян некоторых редких видов рода Iris и детектирования на популяционном уровне Belamcanda chinensis в коллекциях in vitro.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2003); VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева (Москва, 2005); Международной научной конференции «Плодо- и семеноведение. Состояние и перспективы исследований» (Киев, 2005); Международном симпозиуме ирисоводов «Задачи международного сотрудничества ирисоводов» (Москва, 2005); I Международной Школе для молодых ученых «Эмбриология и Биотехнология» (Санкт-Петербург, 2005); IV Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург, 2007). II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 2 статьи в реферируемом журнале.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на _____ страницах компьютерного текста, содержит ____ таблиц, ____ рисунков и ____ приложений, объемом _____ страниц. Список использованной литературы включает _____ наименований, из них ____ на иностранных языках.


ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений ГБС им. Н.В. Цицина РАН в 2003 – 2009 гг.

В качестве исходного материала использовали экспедиционный и коллекционный семенной материал из фондов ГБС им. Н.В. Цицина РАН, а также семена, полученные в системе межботанического обмена.

Для семян исследуемых видов Iris и Belamcanda, характерен комбинированный и физиологический покой различной глубины (Аф-В_1-3; В_1-3); для семян видов Paeonia – простой глубокий морфофизиологический покой (Б-В₃); для видов Fritillaria – сложный глубокий морфофизиологический покой (БВ-В₃) (Николаева, 1985,1999).

Модельными объектами в эксперименте служили 31 вид Iris, в том числе 6 занесенных в Красную книгу РФ (I. acutiloba C.A. Mey., I. aphylla L., I. ensata Tunb., I. nota Bieb., I. pumila L. s. l., I.scariosa Willd. ex Lik); 16 видов Paeonia, в том числе 6 занесенных в Красную книгу РФ (P. caucasica (Schipcz) Schipcz., P. lactiflora Pall, P. obovata Maxim, P. oreogeton S. Moore, P. tenuifollia L., P.wittmanniana Hartwiss ex Lindl.), 26 видов Fritillaria, в том числе 3 занесенных в Красную книгу РФ (F.caucasica Adams., F. meleagris L., F. ruthenica Wikstr.) и Belamcanda chinensis (L.) CD (Красная книга РФ).

Методика биотехнологических исследований основывалась на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений (Бутенко, 1999). Во всех вариантах эксперимента использовали питательную среду Murashige, Skoog (1962). В связи со спецификой покоя исследуемых таксонов, для каждого из них были использованы индивидуальные схемы культивирования.

Семена видов рода Iris и Belamcanda chinensis культивировали на среде с добавлением 1 мг/л ГК₃, также использовали несколько способов предобработки семян: замачивание в растворе ГК₃ в концентрации 1 и 10 мг/л в течение суток, холодная стратификация в течение 1 и 3 месяцев. Обработанные семена и изолированные из них зародыши помещали на среду безгормонального состава. Контролем являлись необработанные семена и изолированные из них зародыши, культивируемые на безгормональной среде.

Незрелые зародыши извлекали из семян 13 модельных видов рода Iris и Belamcanda chinensis в разные периоды созревания: 20-30 дней после опыления (ДПО), 35-45 ДПО, 50-60 ДПО, 65-75 ДПО и культивировали на питательных средах МС: с добавлением 0,1 мг/л БАП, питательная среда с увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов, питательная среда, не содержащая гормональных добавок.

Семена видов рода Paeonia культивировали на безгормональной питательной среде. Изолированные из зрелых семян зародыши на этапе теплой стратификации культивировали на питательных средах с добавлением 0,1 и 0,3 мг/л БАП, а также на питательной среде с увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов и безгормональной питательной среде (контроль); на этапе холодной стратификации на питательных средах (8 вариантов) с добавлением БАП (0,1; 0,5 и 1 мг/л) и ГК₃ (0,1 и 1 мг/л) и безгормональной питательной среде (контроль).

Незрелые зародыши извлекали из семян 3 модельных видов рода Paeonia в разные периоды созревания: 20-30 ДПО, 30-40 ДПО, 40-50 ДПО и культивировали на питательных средах с добавлением 0,1 мг/л БАП, питательной среде с увеличенными в два раза концентрациями минеральных и органических компонентов и безгормональной питательной среде (контроль).

Семена видов рода Fritillaria культивировали на безгормональной питательной среде (контроль) и питательных средах с добавлением 1 мг/л БАП и 1 мг/л ГК₃ в течение 2-х этапной стратификации: 5-7 недель при температуре 20-22⁰С, 2 – 9-12 недель при температуре 3-5⁰С. Для эмбриокультуры зародыши изолировали из семян на разных этапах стратификации (5, 9, 12 и 18 недель) и культивировали на питательных средах (10 вариантов) с добавлением ГК₃ (0,1 – 1 мг/л) и БАП (0,1 – 1 мг/л), а также на питательной среде с увеличенными в 2 раза концентрациями минеральных и органических компонентов. Контроль – питательная среда, не содержащая гормональных добавок.

Математическую обработку данных проводили стандартными методами (Доспехов, 1985, Зайцев, 1984) с использованием пакета программ Microsoft Office.

В молекулярных исследованиях использованы образцы семян I. pumila (3 популяции), I. aphylla (4 популяции), I. scariosa (3 популяции), I. notha (2 популяции) и I. variegatа (2 популяции), а так же образцы 3-х популяций Belamcanda chinensis.

ДНК исходных образцов выделяли с использованием набора NucleoSpin^® Plant II (Macherey-Nagel, Germany) из 100 мг свежего растительного материала, полученного из листьев 2-3 недельных проростков. ДНК контрольных образцов выделяли тем же способом из молодых вегетирующих листьев.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе DNA Engine Diad^TM (Bio-Rad, USA) с ISSR-праймерами: М1, М2, М3, М4, М5, М9, М11, М12, М13, М14, UBC881, UBC855, 844B, НВ15, синтезированными ЗАО «СИНТОЛ» («Биоком», Россия). Для полимеразной цепной реакции были использованы наборы реактивов производства “Диалат-ЛТД” (Москва). Все реакции были проведены в двукратной повторности.

ISSR-профили анализировались с помощью программы Cross Checker (Version 2.91) (Buntjer,1999). Учитывали только хорошо различимые фрагменты. За полиморфные принимали ДНК-фрагменты, присутствующие в спектре не всех образцов. Уровень геномной вариабельности оценивали по значениям генетических расстояний. Межвидовые и внутривидовые генетические расстояния определялись с использованием коэффициента Жаккарда. Расчеты выполняли с помощью программы PAST (Version 1.89) (Hammer et al., 2001), используя кластерный анализ методом невзвешенного парно-группового арифметического усреднения (UPGMA). Анализ образцов на гибридное происхождение проводили с помощью программы NewHybrids (Version 1.1 beta) (Anderson, Thomson, 2002)


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Культура in vitro семян и зародышей представителей Iris и Belamcanda.

1.1.Влияние гиббереллиновой кислоты на преодоление покоя семян и развитие зародышей в культуре in vitro.

Для семян исследуемых видов Iris и Belamcanda, характерен комбинированный и физиологический покой различной глубины (Аф-В_1-3; В_1-3), обработка семян гиббереллинами (ГК) способствует преодолению покоя такого типа (Николаева, 1985,1999; Небыков и др., 2005).

На динамику прорастания значительное влияние оказали тип покоя, используемый способ аппликации ГК₃ и продолжительность периода хранения исходных семян.

Из всех высаженных семян, проростки были получены только у 16 видов, процент прорастания при этом варьировал. Было показано, что во всех вариантах эксперимента показатель прорастания культивируемых in vitro семян, прошедших 2-х летний период хранения был значительно ниже по сравнению с показателем прорастания семян, хранившихся 1 год. Для семян, покой которых относится к комбинированному типу было отмечено совместное стимулирующее действие ГК₃ и скарификации (Табл.1).

Таблица 1

Влияние скарификации и гиббереллиновой кислоты на прорастания семян in vitro.

Вид	Семена без скарификации			Скарифицированные семена
	MS0	MS + 1 мг/л ГК3	10 мг/л ГК3; MS	MS0	MS + 1 мг/л ГК3	10 мг/л ГК3; MS
Belamcanda chinensis	53,62 ± 1,2	54,79 ± 1,0	54,94 ± 1,0	70,79 ± 2,1	80,86 ± 2,3	82,86 ± 1,7
I. ensata	55,64 ± 2,1	53,12 ± 1,6	52,33 ± 1,1	69,64 ± 3,1	75,12 ± 1,6	77,22 ± 2,2
I. laevigata	8,01 ± 0,2	7,95 ± 0,5	7,63 ± 0,3	21,37 ± 1,1	28,62 ± 1,1	26,15 ± 1,0
I. pseudacorus	15,58 ± 1,1	13,12 ± 0,9	14,45 ± 0,8	35,32 ± 2,1	42,18 ± 1,4	43,43 ± 1,3
I. setosa	17,32 ± 0,8	17,00 ± 0,8	17,67 ± 0,2	27,83 ± 1,4	35,63 ± 1,7	36,0 ± 2,7
I. sibirica	62,37 ± 1,0	60,20 ± 1,2	63,05 ± 1,0	71,45 ± 2,	78,12 ± 2,2	81,34 ± 2,5
I. spuria	8,52 ± 0,7	9,11 ± 0,6	8,79 ± 0,3	13,75 ± 0,9	15,62 ± 1,1	13,01 ± 1,1

Установлено, что между способами аппликации ГК₃ ни в одном из вариантов эксперимента ни для одного из исследуемых видов значимых различий выявлено не было.

Положительное влияние ГК₃ на процент прорастания было показано только для видов с промежуточным физиологическим типом покоя семян (I.ensata, I.sibirica, I.pseudacorus, Belamcanda chinensis и др.), хранившихся 1 год (Рис.1).




Рис.1. Влияние гиббереллиновой кислоты на динамику прорастания in vitro семян с промежуточным типом физиологического покоя.


Значимого влияния на прорастание семян с неглубоким типом физиологического покоя, не зависимо от года хранения ( I.pumila, I. scariosa) показано не было. Для видов, семена которых имеют глубокий физиологический покой (I.graminea, I.klatti и др.), использование двух предложенных вариантов аппликации ГК₃ оказалось не результативным – семена не прорастали.

Показано, что развитие зародышей, выделенных из семян, прошедших предобработку зависело от длительности периода хранения, типа покоя исходных семян и концентрации используемой ГК_3.

В данном варианте эксперимента проростки были получены из культивируемых зародышей всех 32 исследуемых видов. Наибольший процент прорастания изолированных зародышей наблюдался у видов с неглубоким типом физиологического покоя семян, в этом варианте эксперимента максимальный результат (I.pumila – 92,15%) был получен у контрольных образцов, обработка семян ГК₃ приводила к снижению процента прорастания (I.pumila – 79,85%). Установлено, что для зародышей, выделенных из семян с промежуточным и глубоким типом покоя семян процент прорастания в контрольном варианте был значительно ниже. Также показано, что предобработка семян ГК₃ существенно увеличивала прорастание изолированных зародышей по сравнению с контролем, однако показатель прорастания, в среднем не превышал 50% (I.graminea – 49,23%) для видов с глубоким типом физиологического покоя семян и 73% (I.versicolor – 72,47%) для видов с промежуточным типом физиологического покоя семян.

Развитие проростков, полученных из изолированных зародышей, зависело от продолжительности периода хранения, типа покоя исходных семян и используемой концентрации ГК_3. Максимальные показатели развития для проростков, полученных из зародышей изолированных, из семян с неглубоким типом физиологического покоя и хранившихся 1 год отмечены в контрольном варианте (без обработки ГК₃) (Рис.2); из хранившихся 2 года – в варианте с предобработкой семян ГК₃ в концентрации 10 мг/л.



Рис.2. Изменение длины наиболее развитого листа у проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян c неглубоким (I.pumila) и промежуточным (I.pseudacorus) типом физиологического покоя семян, обработанных ГК₃


Для развития проростков, полученных из зародышей, изолированных из семян с промежуточным и глубоким типом физиологического покоя, показано стимулирующее влияние предобработки исходных семян ГК₃, не зависимо от продолжительности периода хранения (Рис.2).