Geum.ru

Предисловие

Вид материалаМетодическое пособие
Занятие № 6
Материалы и оборудование
Ход работы
Раздел iii. санитарно-бактериологические исследования окружающей среды
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6

Занятие № 6


Тема: Генетика микроорганизмов.

Цель занятия: Изучить механизмы передачи наследственной информации с помощью трансформации, трансдукции и конъюгации.

Материалы и оборудование: ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культурыдонора; стрептомициночувствительная культура E.coli (реципиент); культура E.coli lac – (реципиент); умеренный трансдуцирующий фаг; культура кишечной палочки (Hfrдонор) с генотипом: pro + (пролин), thr + (треонин), leu + (лейцин), Str s  стрептомициночувствительный; культура кишечной палочки (F–) реципиент с генотипом: pro – , thr –, leu –, Str r  стрептомицинорезистентный; чашки Петри с МПА и стрептомицином в концентрации 100 ЕД/мл, чашки Петри с дифференциально  диагностической средой Эндо, минимальная питательная среда с добавлением стрептомицина  100 ЕД/мл; стерильные градуированные пипетки.

Вопросы для обсуждения:

1. Генотип и фенотип бактерий.

2. Фенотипическая изменчивость у микроорганизмов.

3. Генотипическая изменчивость у микроорганизмов.

4. Трансформация у бактерий, ее сущность.

5. Трансдукция и лизогенная конверсия.

6. Механизм конъюгации.

7. Бактериальные плазмиды, их классификация.

  1. Генетические рекомбинации прокариот

Генетические рекомбинации у микроорганизмов имеют особенности. У эукариот это происходит при половом процессе с помощью реципрокного обмена фрагментами хромосом, при этом возникают две рекомбинативные особи. У прокариот в одну из клеток (реципиент) проникает не вся, а


только часть ДНК (донора), что приводит к образованию мерозиготы и при этом образуется один рекомбинант. Передача генетического материала от одной бактерии другой осуществляется следующими способами:

1.Трансформация. Заключается в переносе генетической информации путем пиноцитоза бактерией-реципиентом из внешней среды фрагментов хромосомы лизированной клетки-донора. Способность к пиноцитозу ДНК свойственна только бактериям, находящимся в состоянии компетенции. В одних случаях поглощенный фрагмент разрушается нуклеазами хозяина (абортивная трансформация). В других он интегрирует с хромосомой, образуя мерозиготу, после чего клетка делится. Ее потомство наследует признаки характерные для донора и реципиента.

2.Трансдукция. При трансдукции передача генетического материала осуществляется с помощью умеренного бактериофага. При общей трансдукции передается любой фрагмент хромосомы бактерии. При специфической трансдукции переносятся определенные гены, которые расположены в хромосоме рядом с трансдуцирующим фагом. Фрагмент ДНК интегрирует с хромосомой бактерии-реципиента, образуя мерозиготу, и при делении передает информацию потомству. При абортивной трансдукции фрагмент ДНК донора не интегрирует с геномом клетки-хозяина и не передается потомству.

3.Конъюгация. Под конъюгацией понимают половой процесс, при котором в результате физического контакта (через sex-пили) происходит передача генетического материла от донора к реципиенту. Процесс контролируется половой плазмидой F+-фактор. При конъюгации образуется мерозигота и потомство может иметь смешанный геном.


Ход работы:
  1. Поставить опыт передачи устойчивости к стрептомицину у кишечной палочки (E. coli) путем трансформации.
  • Культуру клеток E.coli в объеме 1 мл соединить с равным количеством ДНК культуры донора и выдеражать смесь в термостате при 37о в течение 30 минут для контакта.
  • Произвести посев смеси на МПА, содержащий стрептомицин.
  • Произвести контрольные посевы: реципиента и ДНК донора.



  • Учесть опыт через 2448 часов. Контрольные посевы на среде, содержащей стрептомицин,  стерильны. В опыте будет наблюдаться рост колоний трансформантов.
  • Сделать выводы.
  1. Поставить опыт по передаче «lac» маркера у E.coli с помощью бактериофага.
  • К 1 мл 4-часовой культуры реципиента (E.coli lac ) добавить 1 мл трансдуцирующего фага. Смесь выдержать в термостате при 37о в течение 30 минут для контакта.
  • Произвести посев смеси на среду с лактозой.
  • Произвести контрольные посевы: культуры реципиента и фага.
  • Учесть опыт через 2448 часов.
  • Сделать выводы.

III. Поставить опыт по передаче маркеров “pro”, “leu”, “thr” в скрещивание типа Hfr x F у кишечной палочки.
  • В опытную пробирку в соотношении 1:10 внести культуру донора (0.1 мл) и реципиента (0.9 мл). Скрещиваемую смесь поставить в итермостат при 37о и выдержать 30 минут. В течение этого времени проксимальные маркеры донора входят в бактерию реципиента.
  • Произвести посев смеси и контроли (культуру донора и реципиента) на минимальную среду со стрептомицином .
  • Учесть опыт через 24  48 часов.
  • Сделать выводы.


Задача:


Получить прототрофный рекомбинантный штамм Bac.subtilis, устойчивый к ампициллину, если в лаборатории имеются: 1) Bac.subtilis Hfr amp r ауксотроф; 2) Bac.subtilis F _ amp s прототроф, 3) МПА с ампициллином, 4) Глюкозо-солевая среда с ампициллином.


Ответ: Штамм можно получить с помощью опыта по передаче маркеров прототрофности и устойчивости к ампициллину в скрещивании типа Hfr x F у сенной палочки путем конъюгации.


Ключевые слова: генотип, фенотип, рекомбинации, плазмиды.


РАЗДЕЛ III. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ